Sphaerophysa kotschyana bitkisinin bazı kimyasal bileşenlerinin analizi ve antioksidan kapasitesinin belirlenmesi

SPHAEROPHYSA KOTSCHYANA BİTKİSİNİN BAZI KİMYASAL BİLEŞENLERİNİN ANALİZİ

VE ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN BELİRLENMESİ

Abdussamat GÜZEL

Yüksek Lisans Tezi Kimya Anabilim Dalı Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ

2013

T.C.

GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

KİMYA ANABİLİM DALI

Y. LİSANS TEZİ

SPHAEROPHYSA KOTSCHYANA

BİTKİSİNİN BAZI KİMYASAL

BİLEŞENLERİNİN ANALİZİ VE ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN

BELİRLENMESİ

Abdussamat GÜZEL

TOKAT 2013

ÖZET

Y. Lisans Tezi

SPHAEROPHYSA KOTSCHYANA BİTKİSİNİN BAZI KİMYASAL

BİLEŞENLERİNİN ANALİZİ VE ANTİOKSİDAN KAPASİTESİNİN BELİRLENMESİ

Abdussamat GÜZEL Gaziosmanpaşa Üniversitesi

Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı

Danışman: Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ

Bitkilerin tedavi amaçlı kullanımı insanlık tarihi ile başlamaktadır. Doğal kaynakların tedavi amacı ile kullanılması içerdiği fonksiyonel bileşiklerden kaynaklanmaktadır. Son yıllarda doğal kaynakların kimyasal bileşenleri ile ilgili bilimsel çalışmalar yaygın bir şekilde yapılmaktadır. Bu da bitkilerin içeriğinin kimyasal olarak aydınlatılmasının önemini ortaya koymaktadır. Bu çalışmada Konya yöresinde Tuz Gölü etrafında yetişen, endemik bir bitki olan Sphaerophysa kotschyana bitkisinin yağ asidi bileşenleri, vitamin A ve vitamin E içeriği belirlenmiş ve antioksidan kapasitesi değerlendirilmiştir. Ayrıca bazı bileşikler saflaştırılmış ve yapısı aydınlatılmıştır. Yapılan antioksidan aktivite testlerinde; serbest radikal (DPPH●) giderme aktivitesi ve indirme gücü aktivitesi çok düşük olmasına rağmen katyon radikali (ABTS●+) giderme aktivitesi yüksek olduğu gözlemlenmiştir. Total fenol bileşik miktarı yaprak-gövde de 0,357 mg GAE/kg kuru bitki ve meyvede ise 0,006 mg GAE/kg kuru bitki olarak çok düşük miktarda bulunmuştur. Vitamin A; yaprak-gövdede: 16,8 mg /kg kuru bitki ve meyvede: 15,85 mg/kg kuru bitki olarak belirlendi. Vitamin E ise; yaprak-gövdede:84,1 mg/kg kuru bitki ve meyvede:70,6 mg/kg kuru bitki olarak belirlendi. Yağ asitlerinde ana bileşen meyvede; linoleik asit (%72,41) ve palmitik asit (%18,20) ve yaprak-gövdede ise; oleik asit (%59,12) ve stearik asit (%13,42) olarak belirlendi.

2013, 60 sayfa

Anahtar Kelimeler: Sphaerophysa kotschyana, Antioksidan kapasite, Vitamin A, Vitamin E, Yağ asitleri

ABSTRACT

M. Sc. Thesis

ANALYSIS OF SOME CHEMICAL COMPONENT AND DETERMINATION OF ANTIOXIDANT CAPACITY OF SPHAEROPHYSA KOTSCHYANA PLANT

Abdussamat GÜZEL Gaziosmanpaşa University

Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry

Supervisor: Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ

Medicinal use of plants starts with the history of mankind. Usage of natural sources for medicinal purposes is due to functional compounds they contain. In recent years, the chemical constituents of natural products have been widely studied. This shows the importance of structural elucidation of chemical contents in plants. In this study, contents of fatty acids, vitamin A and vitamin E were determined in Sphaerophysa kotschyana, an endemic plant distributed around the Salt Lake in Konya region, and its antioxidant capacity was evaluated. In addition, some compounds were purified and their structures were elucidated. According to obtained antioxidant activity data, free radical (DPPH●) scavenging activity and reducing power activity were very low but cation radical (ABTS●+) scavenging activity was observed to be high. Total phenolic compound content was found to be very low in leaf-body with 0.357 mg GAE/kg dry plant and in the fruit with 0.006 mg GAE/kg dry plant.Vitamin A content was found to be 16.8 mg/kg dry plant in leaf-body and 15.85 mg/kg dry plant in fruit. Vitamin E content in the leaf-body was observed to be 84.1 mg/kg DW and in the fruit 70.6 mg/kg DW. The main component fatty acids were determined as linoleic acid (72.41%) and palmitic acid (18.20%) in fruit and; oleic acid (59.12%) and stearic acid (13.42%) in the leaf-body.

2013, 60 pages

Keywords: Sphaerophysa kotschyana, Antioxidant Capacity, Vitamin A, Vitamin E, Fatty acids

ÖNSÖZ

Tez çalışmam boyunca, bilgi, fikir ve literatür temini konusunda her türlü desteğini gördüğüm, her zaman benim için bir yol gösterici olan ve tez yazımında yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Prof. Dr. Mahfuz ELMASTAŞ’a;

Bitki temininde yardımcı olan saygıdeğer hocam Doç. Dr. Murat Aydın ŞANDA’ya

Öncelikle moral desteğinden dolayı ve tezimin yazım aşamasında ve laboratuvar çalışmaları sırasında her türlü bilgi birikimini benimle paylaşan sevgili arkadaşım uzman ÖZKAN ŞEN’e;

Laboratuvar çalışmalarım esnasında güzel bir ortam oluşturan arkadaşlarım Uzman Hüseyin AKŞİT, Mehmet Geçeci, Ömer KAYIR, Zülfikar KARAÇAY ve Uzman Nusret GENÇ'e,

Bölümümüzün her türlü imkânından faydalanmamı sağlayan Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü yöneticilerine ve manevi desteklerini esirgemeyen bütün öğretim elemanlarına;

Hayatım boyunca maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen aileme;

Çok teşekkür ederim.

Abdussamat GÜZEL Temmuz 2013

İÇİNDEKİLER

Sayfa

SİMGE VE KISALTMALAR ... viii

1. GİRİŞ ... 1

2. GENEL BİLGİLER ... 3

2.1. Sphaerophysa kotschyana ... 3

2.2. Literatür Özeti ... 4

2.3. Reaktif Oksijen Türleri Ve Etkileri ... 7

2.3.1. Yaşam İçin Oksijen (02) ... 7

2.3.2. Reaktif Oksijen Türleri (ROS) ... 8

2.4. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri ... 8

2.5. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri ... 11

2.6. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri ... 11

2.7. Serbest Radikallerin Karbonhidratlara Etkileri ... 12

2.8. Antioksidan Savunma Sistemleri ... 12

2.8.1. Fenolik Bileşikler ... 14

2.9. Sekonder Metabolitlerin Ayırma ve Saflaştırılmasında Kullanılan Kromatografik Yöntemler ... 15

2.9.1. Kolon Kromatografisi (KK) ... 15

2.9.2. İnce Tabaka Kromatografisi (İTK) ... 16

2.9.3. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ... 17

2.9.4. Gaz Kromatografisi (GC) ... 18

3. MATERYAL ve YÖNTEM ... 19

3.1. Bitkisel Materyal ... 19

3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler ... 19 iv

3.3. Cihazlar ... 19

3.4. Antioksidan Aktivite Testleri ... 20

3.4.1. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 20

3.4.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi (Oyaizu Metodu) ... 21

3.4.3. Toplam Fenolik Bileşik ... 21

3.4.4. Katyon Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 22

3.5. Sphaerophysa kotschyana Bitkisinin Yağ Asitlerinin Analizi ... 22

3.6. Vitamin A ve Vitamin E’nin HPLC ile Kantitatif Tayini ... 23

4. BULGULAR ve TARTIŞMA

...

4.1.Antioksidan Aktive Testlerinin sonuçları ... 24

4.1.1. Serbest Radikal (DPPH●) Giderme Aktivitesi ... 24

4.1.2. İndirgeme Gücü ... 25

4.1.3.Katyon Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 26

4.1.4.Total Fenol Bileşik Tayini ... 26

4.2. A ve E Vitamini Tayini ... 27

4.3. Yağ Asitleri Analizi ... 27

4.4. Ayırma/saflaştırma Aşaması ... 29

4.5. Kolon Kromatografisi Sonuçları ... 30

4.5.1. Gövde kısmı için kolon kromatografisi ... 30

4.5.2.D-pinitol (1) Bileşiğinin Fiziksel ve Spektral Özellikleri ... 32

4.5.3. Sukroz (17) Bileşiğinin Fiziksel ve Spektral Özellikleri ... 41

5. SONUÇ ... 50

KAYNAKLAR ... 51

ÖZGEÇMİŞ ... 53

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 2.1. Sphaerophysa Kotschyana (Fotograf: Doç. Dr. Murat Aydın Şanda) ... 3

Şekil 2. 2. Li Ve Arkadaşlarının Sphaerophysa Salsula Türünden İzole Ettikleri Sterol Bileşiği ... 5

Şeki 2.3. Ma Ve Arkadaşlarının İzole Ettikleri Bileşikler ... 6

Şekil 2.4. Ma Ve Arkadaşlarının İzole Ettiği Bileşikler ... 6

Şekil 2.5. Ma Ve Arkadaşlarının Sphaerophysa Salsula Türünden İzole Ettikleri 2 Yeni Falvanoid Bileşikler ... 7

Şekil 2.6. Yağ Asidi Zincirinin Bir Lipid Radikali Niteliği Kazanması ... 9

Şekil 2.7. Lipid Reaksiyonu ... 10

Şekil 4.1. Sphaerophysa Kotschyana Bitkisinin Dpph Radikal Giderme Aktivitesi ... 25

Şekil 4.2. Sphaerophysa Kotschyana Bitkisinin İndirme Gücü Aktivitesi ... 25

Şekil 4.3. Sphaerophysa Kotschyana Bitkisinin Katyon Serbest Radikal Giderme Aktivitesi ... 26

Şekil 4.4. Kolon Kromatografide Kullanılan Cam Kolon ... 32

Şekil 4.5. D-Pinitol (3-O-Methyl-D-Chiro-İnositol) Bileşiğinin Yapısı ... 32

Şekil 4.6. D-Pinitol Bileşiğinin Belirlenen Hmbc Korelasyonları ... 33

Şekil 4.9. D-Pinitol Bileşiğinin 13 c-Nmr Spektrumu (100 Mhz, Dmso-D6) ... 36

Şekil 4.10. D-Pinitol Bileşiğinin Hmbc Spektrumu (400 Mhz, Dmso-D6) ... 37

Şekil 4.11. D-Pinitol Bileşiğinin Cosy Spektrumu (400 Mhz, Dmso-D6) ... 38

Şekil 4.12. D-Pinitol Bileşiğinin Hetcor Spektrumu (100 Mhz, Dmso-D6) ... 39

Şekil 4.13. D-Pinitol Bileşiğinin Apt, Dept-90, Dept-135 Spektrumları (100 Mhz ... 39

Şekil 4.14. D-Pinitol Bileşiğinin Tocsy Spektrumu ... 40

Şekil 4.15. D-Pinitol Bileşiğinin Ft-Ir Spektrumu (Kbr) ... 41

Şekil 4.16. Sukroz Bileşiğinin Yapısı ... 41

Şekil 4.17. Sukroz Bileşiğinin Belirlenen Hmbc Korelasyonları ... 42

Şekil 4.18. Sukroz Bileşiğinin 1 h-Nmr Spektrumu (400 Mhz, Dmso-D6) ... 43

Şekil 4.19. Sukroz Bileşiğinin 13 c-Nmr Spektrumu (100 Mhz Dmso-D6) ... 44

Şekil 4.20. Sukroz Bileşiğinin Hmbc Spektrumu (400 Mhz, Dmso-D6) ... 45

Şekil 4.21. Sukroz Bileşiğinin Cosy Spektrumu (400 Mhz, Dmso-D6) ... 46

Şekil 4.22. Sukroz Bileşiğinin Hetcor Spektrumu (400 Mhz, Dmso-D6) ... 47

Şekil 4.23. Sukroz Bileşiğinin Apt, Dept-90 Ve Dept-135 Spektrumları (100 Mhz, ... 48

Şekil 4.24.Sukroz Bileşiğinin Ft-Ir Spektrumu ... 49

ÇİZELGELER DİZİNİ

Çizelge 4.1. Sphaerophysa Kotschyana Bitkisinin Total Fenolik Bileşik Tayini ... 27 Çizelge 4.2. Sphaerophysa Kotschyana Bitkisinin A Ve E Vitamini Tayini ... 27 Çizelge 4.3.Sphaerophysa Kotschyana Bitkisinin Yağ Asidi Bileşenleri ... 28 Çizelge 4.4.Sphaerophysa Kotschyana Bitkisinin Doymuş Ve Doymamış Yağ Asidi

Oranları ... 29 Çizelge4.5. Kolon Kromatografisi İçin Çözücü Sistemi ... 30 Çizelge4.6. D-Pinitol Bileşiğinin 1

H-NMR Ve 13C-NMR Kimyasal Kayma Değerleri . 33 Çizelge 4.7. Sukroz Bileşiğinin 1

H-NMR, 13C-NMR Kimyasal Kayma Değerleri ve HMBC Korelasyonları ... 42

SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ Simge Açıklama δ Kimyasal Kayma d Dublet dd Dubletin dubleti J Etkileşme Sabiti s Singlet t Triplet m Multiplet N Normal ppm Milyonda bir kısım Kısaltma Açıklama

APT Attached Proton Test BHA Bütillenmiş Hidroksi Anisol BHT Bütillenmiş Hidroksi Toluen

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimetilsülfoksit

GC-MS Gaz Kromatografisi- Kütle Spektrometresi HPLC High Performence Liquid Chromatography İTK İnce Tabaka Kromatografi

NMR Nükleer Manyetik Rezonans TCA Trikloroasetik asit

UV-VIS Ultraviyole-Görünür Bölge

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Corralation HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Corralation HETCOR Heteronuclear Corralation

SRGA Serbest Radikal Giderme Aktivitesi KRGA Katyon Radikali Giderme Aktivitesi

Antioksidanların çağımızda artan popüleritesi ile antioksidan araştırmaları son zamanlarda hız kazanmıştır. Bunun sonucu olarak bitkiler üzerinde çalışmalar artmıştır. Çünkü bitkilerin tedavi, gıda ve kozmetik amaçlı kullanıldığı göz önünde bulundurulduğunda, bitkilerin kimyasal içeriklerinin aydınlatılması önemli hale gelmektedir.

Antioksidanların vücut içerisindeki işlevselliği yapılan araştırmalarla tespit edilmiştir (Scholz ve ark., 2007). Hastalıklara neden olan çeşitli etkenlerden biri olan radikallerin antioksidanlarla etkisinin yok edildiği görülmüştür (Rahman ve ark., 2006).

İnsan vücudunda katabolizma sırasında harcanan oksijen, reaktivitesi çok yüksek reaktif oksijen ara ürünleri (ROS) olarak bilinen zararlı bazı radikallere dönüşür. Bu radikallerin oluşumu stres durumlarında artış gösterir ve vücutta birçok hastalığa tetikleyici rol oynar. Bu radikalleri kararsız ve canlı sistemlerde diğer madde ve gruplarla kolay bir şekilde reaksiyona girerler. Oluşan yeni ürünler, hücre harabiyeti, hücre ölümü, yaşlanma ve birçok hastalığa neden olabilen zararlı ürünlerdir. Serbest radikaller yaşlanmayı kolaylaştırdığı gibi Alzeimier hastalığı, Parkinson Hastalığı, romatizmal hastalıklar, kalp rahatsızlığı, damar sertliği ve kanser gibi hastalıklara öncülük eder. Reaktif oksijen ara ürünleri, lipit peroksidasyonu, protein oksidasyonu ve dejenerasyonu, DNA hasarı gibi ciddi harabiyetlere de yol açabilir. (Dawn, Allan ve Colleen, 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

Vücutta, kararsız radikallerin oluşumu ile bunu etkisiz hale getirmek için savunma sistemleri devreye sokulur. Bu savunma sistemlerinden biride antioksidanlardır. Doğal ürünlerin büyük bir kısmında bulunan A vitamini, C vitamini, flavonoidler, fenolik asitler, polifenolik bileşikler ve karotenoidleri içerenlerin antioksidan olduğu tespit edilmiştir. (Larson, 1988). Antioksidanlar bu zararlı bileşik olan reaktif oksijen ara ürünleri ile reaksiyona girerek etkisiz hale getirirler.

Vücutta nötralize edilemeyen serbest radikaller pek çok hastalıklara sebep olabiliyor. Önlem alma kabilinde alınan besinlerin içeriği çok önemlidir. Gıdalardan alınan vitamin A ve vitamin E serbest radikallerin sebep olabildiği hastalıkları önleyebilmektedir. Çoğu organizmalar ve insanlar tarafından sentezlenememesine rağmen bitkiler tarafından sentezlenebilen vitaminler diyetle alınması gereken esansiyel organik maddelerdir. (Keha ve Küfrevioğlu., 2005)

Sağlık açısından yağların ne kadar önemli olduğu bilinmektedir. Çoklu doymamış yağ asitleri olan w-3 ve w-6 diyetle alınması gereken insan sağlığına faydalı çok önemli esansiyel yağ asitleridir.

Yağlar suda çözünmeyen hidrofobik ve anyonik yapılara sahip organik heterojen molekülerdir(Champe ve ark., 2007). Bu karakteristik özellik ile bazı iyon ve polar maddelerin geçişini engelleyerek seçici geçirgen özelliğine sahiptir. Hücre zarının yapısına katılarak akıcılık ve esneklik kazandırlar. (Keha ve Küfrevioğlu., 2005)

Bu çalışmada; Ülkemizde İç Anadolu bölgesinde endemik olan Sphaerophysa kotschyana bitkisinde kimyasal bileşen açısından hiçbir çalışma yapılmadığından bu bitki üzerine bazı kimyasal bileşenlerinin analizi, vitamin A ve vitamin E miktarlarının belirlenmesi, yağ asidi kompozisyonları ve antioksidan kapasitesinin belirlenmesi hedeflenmiştir.

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Sphaerophysa kotschyana

Sphaerophysa kotschyana 20-50 cm boyunda, çok yıllık, otsu dik bitki. Yapraklar imparipinnat (teleksi); yaprakçık 4-6 çift, 8-14 mm, kama-dikdörtgensi. Çiçekle kümesi salkım, 5-8 çiçekli. Çanak yapraklar çan şeklinde, seyrek tüylü. Taç yapraklar pembe, yaklaşık 15 mm. Meyve dikdörtgen-elips şeklinde, zarsı, şişkin, tüysüz, olgunlukta açılmaz.

Hayvanlar tarafından fazla tercih edilmese de otlanmaktadır. Ayrıca gösterişli çiçeklere ve şişkin meyvelere sahip olduğu için hafif tuzlu çorak alanlarda peyzaj mimarisinde kullanılabilecek nadir endemik bir bitkidir. Türün Yayılışı Ülkemizde İç Anadolu bölgesinde 800-1000 m’ler arasında çorak alanlarda tarla içi ve kenarlarında yetişen nadir endemik bir türdür. Afyon: Akşehir Gölü, Ankara: Şereflikoçhisar, Kayseri: Sultan Sazlığı, Develi, Everek-Dündarlı, Denizli: çardak-Gemiş Köyü, Dazkırı-Akkeçili, Konya: Aslım Bataklığı, Ereğli, Cihanbeyli (Anonim, 2013).

Doğal olarak Tuz Gölü çevresinde yetişen S. kotschyana morfolojik tanımlama, ekolojik özellikleri, polen ve tohum mikromorfoloji ve karyoloji olarak incelenmiştir (Duran ve ark., 2010).

2.2. Literatür Özeti

Sphaerophysa cinsi dünyada S. Kotschyana Boiss. ve S. Salsula (Pall.) DC olmak üzere iki türle temsil edilmektedir.

Sphaerophysa kotschyananın S. salsula ile yakın akrabalığı olmasına rağmen yaprak, gövde, tohum ve kaliks boyutları farklıdır. (Davis, 1970; Shiskin, 1971).

S. salsula (Pall.) DC. (Sinonimleri: Colutea caspica M. Bieb., Phaca salsula Pall., Swainsona salsula (Pall.) Taub., Swainsonia salsula (Pall.) Taub.), Afganistan, Ermenistan, Azerbaycan, Çin, İran, Irak, Kazakistan, Kırgızistan, Moğolistan, Rusya, Tacikistan, Türkmenistan, Özbekistan ve Amerika’da yayılış gösterir (Shiskhin, 1971).

Sphaerophysa DC. cinsi güney Sibirya'dan kuzey Çin’e kadar Asya kıtasının ortalarında, batı Kafkasya ve Anadolu’da, yaygın olarak bulunmaktadır. Bu cins dünyada iki türü temsil edilir. Bu türler Sphaerophysa kotschyana Boiss. ve Sphaerophysa salsula DC’ dir.

S. kotschyana İç Anadolu’ya endemik iken S. salsula, Rusya, Azerbaycan, İran ve Suriye ‘de yetişir. S. kotschyana türü Bern Sözleşmesine mutlak korunması bitki listesinde (CITES 2008) yer almaktadır. S. kotschyana tuzlu bataklıklarında, tuz steplerinde ve buna benzer alanlarda yetişir(Aytaç ve Ekim, 1996).

Çin'de, S. salsula nefrit, kronik hepatit ve anjiyonörotik ödem gibi bazı hastalıkların tedavisi için bitkisel ilaç olarak kullanılmaktadır. Bitki orta düzeyde kuraklığa dayanıklı, ve bozulmuş toprak ortamlarının iyileştirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır (Xu ve ark., 2009).

Sphaerophysa salsula Çin’de yüksek tansiyon tedavisinde halk arasında kullanılan bir bitkidir. 4 - [2 - (3,5-dimetoksifenil)-etenil] -1,2-benzendiol bir yeni stilben olarak Sphaerophysa salsuladan izole edildi (Ma ve ark., 2002).

4 - [2 - (3,5-dimetoksifenil)-etenil] -1,2-benzendiol, bir stilben Sphaerophysa salsula izole edilen, % 33 genel verimle beş adımda 3,4-dihidroksibenzaldehit’ den sentez edildi. Sentetik spektral veriler doğal ürün olanlar ile iyi bir uyumluluk içindedir. Hidroksistilben güçlü antioksidan aktivite göstermiştir (Venkateswarlu ve ark., 2003).

Sphaerophysa salsula bitkisinin etanol ekstraktına kolon kromatografisi uygulanması sonucu sterol bileşenleri izolosyonu değerlendirilmiştir (Li ve ark., 2003).

H OCH2CH3

HO

(24S)-stigmast-5-en-7b-ethoxy-3b-ol

Şekil 2.2. Li ve arkadaşlarının Sphaerophysa salsula türünden izole ettikleri sterol bileşiği

Sphaerophysa salsula (Pall.) DC (Leguminosae) bitkisi üzerine önceki fitokimyasal çalışmalar isoflavanlar, kumarinler ve alkaloidlerin varlığını ortaya çıkarılmıştır. Sphaerophysa salsula (Pall.) DC (Leguminosae) bitkisinden elde edilen trans -4-[ 2- (3, 5-dimetoksifenil) etenil]-2- metoksifenol ve daucosterol ile birlikte, yeni bir stilben 1 izolasyonu ve karakterizasyonu yapılmıştır (Ma ve ark., 2002).

OH HO H _H H3CO OCH3 OH H3CO H _H H3CO OCH3

(trans)-4-[2-(3, 5-dimethoxyphenyl) ethenyl]-2-methoxyphenol Daucosterol

Şeki 2.3. Ma ve arkadaşlarının izole ettikleri bileşikler

Sphaerophyside ve SC sphaerophyside SD olarak adlandırılan iki yeni 9,10-seko-sikloartanlar ile birlikte bazı bilinen bileşikler Sphaerophysa salsula tohumlarının etanol ekstratından elde edilmiştir (Ma ve ark., 2005).

R₁O 30 29 4 19 7 28 17 20 21 27 OH 26 OR₂ 1 1.R₁=H, R2=Glc 2.R₁=Glc ,R₂=H

Şekil 2.4. Ma ve arkadaşlarının izole ettiği bileşikler

Sphaerophyside ve SC sphaerophyside SD (2) olarak adlandırılan iki yeni flavonoid ile birlikte 15 bilinen flavonoid Sphaerophysa salsula (Pall.) DC. tohumlarının etanol ekstratından izole edilmiştir. Yeni bileşiklerin yapıları esas olarak 1D ve 2D NMR verileri temelinde aydınlatılmıştır (Ma ve ark., 2004).

O HO OH OH HO O OCH3 OCH₃ O HO (3R)-isomucronulatol 2'-O-b-D-glucopyranoside

O

O

O

O

OH

CO

O

OH

OCH

HO

OH O

OH

HO

HO

OH

HO

H

CO

Şekil 2.5. Ma ve arkadaşlarının Sphaerophysa salsula türünden izole ettikleri 2 yeni falvanoid bileşikler

2.3. Reaktif Oksijen Türleri Ve Etkileri

2.3.1. Yaşam İçin Oksijen (02)

Yaşamın devam edebilmesi için moleküler oksijeni (O2) kullanıyoruz. Total oksijen tüketimimizin %90'mdan fazlasından elektron transport zinciri (solunum zinciri), %5-10'undan da diğer oksijen gerektiren reaksiyonlar sorumludur. Elektron transport zincirinde moleküler oksijen, yakıtlardan (glukoz, yağ asidi ve amino asitlerin karbon iskeleti) türeyen NADH ve FADH2'den elektronları alarak suya indirgenir. Bu yolda oksijen molekülünün kuvvetli oksitleyici gücü, ATP'nin yüksek enerjili fosfat bağı haline

dönüştürülür. Moleküler oksijen gerektiren fakat ATP' nin oluşumu reaksiyonuyla eşleşmeyen diğer reaksiyonlar, aminoasitlerin katabolizması, ilaçların detoksifikasyonu ve steroid hormonların sentezi gibi spesifik metabolik yollar için önemlidirler. Bu reaksiyonlarda diğer oksidazlar (oksijeni suya veya hidrojen perokside indirgeyen enzimler) ve oksijenazlar (oksijeni okside olan moleküle bağlayan enzimler) görev alırlar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark., 1999).

2.3.2. Reaktif Oksijen Türleri (ROS)

Reaktif oksijen türleri (ROS), normal oksijen metabolizması sırasında az miktarda oluşan süperoksit radikali (O2•─

), hidrojen peroksit (H2O2) ve hidroksil radikali (OH●)'dir.

O

O

-e

_e

_,2H

H

O

e

_,H

H

_{O + OH}

e

,H

_H

O

oksijen süperoksit radikali

hidroksil radikali

Reaktif oksijen türleri, çeşitli serbest radikallerin oluştuğu serbest radikal zincir reaksiyonlarını başlatabilirler ve hücrede karbon merkezli organik radikaller (R●_), peroksit radikalleri (ROO●), alkoksi radikalleri (RO●), tiyil radikalleri (RS●), sülfenil radikalleri (RSO●), tiyil peroksit radikalleri (RSO2●) gibi çeşitli serbest radikallerin oluşumuna neden olurlar (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark., 1999).

2.4. Serbest Radikallerin Lipidlere Etkileri

Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarndaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar.

Poliansatüre yağ asitlerinin oksidatif yıkımı lipid peroksidasyonu olarak bilinir. Lipid peroksidasyonu kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve oldukça zararlıdır. Hücre membranlarında lipid serbest radikalleri (L●) ve lipid peroksit radikallerinin (LOO●) oluşması, reaktif oksijen türlerinin (ROS). neden olduğu hücre hasarının önemli bir özelliği olarak kabul edilir. Serbest radikallerin sebep olduğu lipid peroksidasyonuna "nonenzimatik lipid peroksidasyonu" denir.

Hücre membranlarında lipid peroksidasyonuna uğrayan başlıca yağ asitleri poliansatüre yağ asitleridir. Lipid peroksidasyonu genellikle yağ asitlerindeki konjuge çift bağlardan bir elektron içeren hidrojen atomlarının çıkarılması ve bunun sonucunda yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanmasıyla başlar (Şekil 2.6).

y x

LH L

Şekil 2.6. Yağ asidi zincirinin bir lipid radikali niteliği kazanması

Lipid radikali (L●) dayanıksız bir bileşiktir ve bir dizi değişikliğe uğrar. Lipid radikallerinin (L●) moleküler oksijenle (O2) etkileşmesi sonucu lipid peroksit radikalleri (LOO●) oluşur. Lipid peroksit radikalleri (LOO●), membran yapısındaki diğer poliansatüre yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşumuna yol açarken kendileri de açığa çıkan hidrojen atomlarım alarak lipidperoksitlerine (LOOH) dönüşürler ve böylece olay kendi kendini katalizleyerek devam eder (Şekil 2.7).

L O₂ LOO LOO LH LOOH L y x O O LOO y x O OH LOOH

Şekil 2.7 Lipid reaksiyonu

Lipid peroksidasyonu sonucu oluşan lipid peroksitlerinin (LOOH) yıkılımı geçiş metalleri iyon katalizini gerektirir. Plazma membranı ve subsellüler organel lipid peroksidasyonu serbest radikal kaynaklarının hepsiyle uyarılabilir ve geçiş metallerinin varlığında artar. Lokal olarak hidrojen peroksitten (H2O2) Fenton reaksiyonu sonucu hidroksil radikali (OH•) oluşması zincir reaksiyonunu başlatabilir.

Lipid peroksitleri (LOOH) yıkıldığında çoğu biyolojik olarak aktif olan aldehitler oluşur. Bu bileşikler ya hücre düzeyinde metabolize edilirler veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarlar.

2.5. Serbest Radikallerin Proteinlere Etkileri

Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi aminoasit kompozisyonlarına bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi aminoasitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur.

Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G (IgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur, normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri (ROS) üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali (O2 • −) veya hidrojen peroksitle (H2O2) reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark. 1999).

2.6. Serbest Radikallerin Nükleik Asitler ve DNA'ya Etkileri

İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali (OH•) deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit (H2O2) membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. Süperokside (O2 • −) maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiklerinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir, çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematozusta (SLE) ve romatoit artritte (RA) dolaşımda anti-DNA antikorlar bulunur (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark., 1999).

2.7. Serbest Radikallerin Karbonhidratlara Etkileri

Serbest radikallerin karbonhidratlara etkisiyle çeşitli ürünler meydana gelir ve bunlar, çeşitli patolojik süreçlerde önemli rol oynarlar. Diyabet ve diyabet komplikasyonlarının gelişimi, koroner kalp hastalığı, hipertansiyon, cilt hastalıkları, romatoit artrit, behçet hastalığı, çeşitli deri ve göz hastalıkları, kanser gibi birçok hastalıkta ve yaşlılıkta serbest radikal üretiminin arttığı, antioksidan savunma mekanizmalarının yetersiz olduğu gösterilmiştir. Ancak bu hallerde serbest radikal artışının sebep mi yoksa sonuç mu olduğu tam olarak bilinmemektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve ark., 1999).

2.8. Antioksidan Savunma Sistemleri

Reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için birçok savunma mekanizmaları vardır. Bu mekanizmalar "antioksidan savunma sistemleri" veya kısaca "antioksidanlar" olarak bilinirler.

Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler;

 Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya daha zayıf yeni moleküle çevirme toplayıcı etkidir. Antioksidan enzimler, trakeobronşiyal mukus ve küçük moleküller bu tip etki gösterirler.

 Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürme bastırıcı etkidir. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler.

 Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki zincir kırıcı etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler.

Antioksidan sistem; serbest radikalleri hücre zarına, nükleik asitlere (DNA) ve hücre bileşenlerine saldırmadan kendine çeker ve bağlar. Günümüzde antioksidanların gıda sanayinde kullanımı oldukça yaygın olup hemen hemen tükettiğimiz her ürüne antioksidan maddeler katılmaktadır. Bunlar gıdaları bozulmaya karşı korumakta olup onların daha uzun süreli saklanmasını sağlar, bunlardan bazıları bütillenmiş hidroksi toluen (BHT) ve bütillenmiş hidroksi anisol (BHA) bileşikleridir ancak bunların toksik etkilerinden şüphelenilmektedir. Bu nedenle son yıllarda yeni, daha güvenli ve ucuz antioksidan maddelerin bulunması için doğal ürünler üzerinde yaygın çalışmalar yapılmaktadır (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

Antioksidanlar vücutta çok kısa ömürlü fakat saldırgan olan serbest radikaller diye adlandırılan moleküllerle savaşırlar. Eğer serbest radikaller nötralize edilmezlerse vücutta ciddi hasarlara neden olabilirler.

Sürekli gelişmekte olan teknoloji, oluşan çevre kirliliği, sigara, UV vb. pek çok diğer etken sürekli olarak çeşitli toksik maddelerle karşı karşıya kalmamıza neden olmaktadır. Bu etkiler kendini serbest radikal oluşumuyla gösterir. Tüm bu nedenlerden dolayı dış etkilerle oluşan hastalıklar artmakta, genetik hastalıkların da çevresel etkilerle daha çok belirginleşmesine neden olmaktadır. Bu hastalıklara çözüm getirmek öncelikle bu hastalıkların oluşumunu engellemekle gerçekleşebilir. Bunun için de ilaçlardan öte alınan besinler önem kazanmaktadır. Serbest radikallerin etkilerini önleyen ve gıdalarda bol miktarda bulunması gereken C vitamini ve E vitamini kanser ve kalp hastalıkları gibi toplumda erken ölümlerin başlıca nedenleri olan hastalıkların oluşumunu önlemektedir. Besinlerin dışında dışarıdan yapılacak takviyelerin de yararlı olduğu yapılan doz tespit çalışmalarıyla anlaşılmıştır. Ancak vücudun hassas dengesi alınacak aşırı dozlarla bozulabilmekte, bunun sınırının konabilmesi gerekmektedir (Dawn ve ark., 1996; Akkuş, 1995; Tietz, 1995; Burtis ve Ashwood, 1999).

2.8.1. Fenolik Bileşikler

Bitkisel kökenli bütün gıdalarda daima farklı nitelikte ve miktarda çeşitli fenolik bileşikler bulunmaktadır. Fenolik bileşikler meyve ve sebzelerin kendilerine özgü buruk tadını verir. Fenolik maddeler meyve ve sebzelerde çok az bulunmalarına rağmen meyve ve sebze işleme teknolojisi bakımından değişik sorunlara neden oldukları için önemlidir. Fenolik bileşikler gıdalarda renk değişimlerine neden olur. Bunlar arasında en önemlisi esmerleşmelerdir.

Gıda bileşeni olarak fenolik bileşikler:  insan sağlığı açısından işlevleri  Tat ve koku oluşumundaki etkileri  Renk oluşumu ve değişimine katılmaları

 Antimikrobiyal ve antioksidatif etki göstermeleri

 Fenoloksidaz enzimlerinin etkisiyle enzimatik renk esmerleşmelerine neden olmaları

 Çeşitli gıdalarda saflık kontrol kriteri olmaları gibi pek çok açıdan önem taşımaktadırlar.

Fenolik maddeler bitkiler aleminde oldukça yaygın olarak az veya çok bulunur. Bazı meyve ve sebzeler kesildiği veya zedelendiği zaman bir süre sonra okside olarak renklerin değişip esmerleştiği gözlenir. Örneğin, elma, ayva patates gibi. Renk değişimi gözlenenlerde polifenol oksidaz enzimleri aktivitesi fazla, bunun yanında askorbik asit miktarlarıda düşüktür. Esmerleşme görülmeyen meyve ve sebzelerde ya askorbik asit miktarı çok yüksek ve bunun yanında polifenol oksidaz aktivitesi çok düşük veya yoktur.

Gıdalarda enzimatik esmerleşme, genellikle kalite kaybı olarak değerlendirilmekte ve bu nedenle meyve ve sebzelerin işlenmeleri sırasında fenolik maddelerin oksidasyonları çeşitli yöntemlerle önlenmeye çalışılmaktadır.

2.9. Sekonder Metabolitlerin Ayırma ve Saflaştırılmasında Kullanılan Kromatografik Yöntemler

Doğal kaynaklı özellikle de bitki kaynaklı biyo-aktif moleküllerin yapılarının aydınlatılabilmesi için mutlak surette ayrılmış olması gerekmektedir. Kromatografik ayırma sistemlerinde; ayrılması istenen maddeler ile reaksiyon vermeyen sabit faz ve hareketli faz seçilir. Ayrılacak maddenin özelliğine göre, öncelikle kullanılacak kromatografik yöntem (gaz, sıvı kromatografi gibi) belirlenir. Bu yönteme uygun sabit faz (normal faz, ters faz, silika jel, alümina vb.) ve hareketli faz seçilerek ayrım başlanabilir. İyi bir ayrım için, bu üç parametrenin - kromatografi türü, sabit faz ve hareketli faz - iyi seçilmiş olması gerekmektedir.

2.9.1. Kolon Kromatografisi (KK)

Kolon kromatografisi, organik moleküllerin ayrılmasında oldukça kullanışlı ve ucuz bir yöntemdir. Ayrılacak olan maddeler kolona sıvı ya da katı olarak yüklenebilir. Sıvı yüklemelerde, ilk olarak başlanacak polaritede çözücü sistemi ile maddeler çözülmelidir. Bunun sebebi, ilk yükleme esnasında istenmeyen bir olay olan maddelerin hızlı ve beraber yürümesi veya kolonun yarılmasına engel olmaktır. KK ile ayrıma başlamadan önce mutlaka; ayrılmak istenen karışımı en iyi şekilde ayırabilen mobil faz karışımı ince tabaka kromatografisi (İTK) ile belirlenmelidir. İTK ile belirlenen çözücü sistemi direkt olarak başlangıç mobil fazı olarak kullanılabilir.

KK’da en çok kullanılan sabit faz silika jeldir. Genelde Silika jel 60-230 mesh kullanılır. Daha küçük tanecik boyutlu silika jel ile yapılan ayrımlarda mutlaka vakum desteği gerekir. Bu tür ayrımlar, özellikle bitki ekstraktları için kaba ayrımlar için kullanılır. Bu sistemde, nispeten daha büyük kolonlar kullanılır ve vakum destekli olarak az polardan yüksek polaritelere değişik çözücü sistemleri kolondan geçirilir. Bu yolla, ekstrakt içindeki mader polaritelerine göre kısmen ayrılmış olur. Daha sonra bu parçalar, KK ile ayrılarak izolasyona gidilebilir.

KK’da genelde 10-20 ml arasında fraksiyonlar toplanır. Toplanan her fraksiyon İTK ile kontrol edilerek aynı yürüyenler birleştirilir. İTK da gözle görülmeyen spotları görünür hale getirmek için kullanılan birkaç teknik vardır; UV lambası (254 ve 360 nm), iyot buharına maruz bırakma, Serik sülfat belirteci vb. UV sentetik organik kimya için kullanışlı bir görüntüleme yöntemidir. Ancak doğal ürünlerde bu dalga boylarında görünmeyecek maddeler de mevcuttur. İyot ile görüntülemede; ağzı sıkıca kapatılabilen bir tank içinde silika jel ile iyot karıştırılır. İTK bu tanka konulur kapak kapatılarak 12-20 saniye beklendikten sonra alınarak kontrol edilir. Spotlar artık çıplak gözle görülebilir haldedir. Serik sülfat çözeltisi (Seryum (IV) sülfat + Der. Sülfürik Asit + Su) karışımı bir püskürtücü yardımı ile İTK üzerine püskürtülür ve 110 ºC’de ısıtılarak spotların görünür hale gelmesi sağlanır.

Bu kontrollerden sonra, tek spot olarak gözlenen maddeler değişik spektroskopik yöntemler ile aydınlatılır. Karışım olarak gözlenenler ise, tekrar daha küçük kolonlarda ayrılmaya çalışılır.

Bu çalışmada KK ham bitki ekstraktının fraksiyonlandırılmasında ve saflaştırılmasında kullanılmıştır. Sabit faz olarak silika jel (60-230 mesh), hareketli faz olarak, hekzan, diklormetan, etil asetat ve metanol kullanılmıştır. İTK belirteci olarak da Serik sülfat kullanılmıştır.

2.9.2. İnce Tabaka Kromatografisi (İTK)

Bir karışım içindeki bileşenlerin ayrılmasını ve kalitatif olarak değerlendirilmesini sağlayan, kromatografinin en basit uygulamalarından biridir. Bazı organik ayırma ve saflaştırma işlemlerinde oldukça kullanışlı ve diğer yöntemlere göre nispeten daha ucuzdur. Alüminyum plakalar üzerine silika jel ya da alimüna partikülleri yerleştirilmiş tabaklar ticari olarak mevcuttur. Kulanım amacına göre kesilerek ya da bütün olarak kullanılabilir. Ya da uygun aparatlarla destek fazı cam plakalar üzerine çekilerek preparatif olarak da kullanılabilir. Numune uygulaması kapiler bir tüp kullanılarak yapılır. Uygulanan numune spotları kuruduktan sonra plaka az miktar mobil faz içeren cam bir tank içine alınır. Mobil faz, plakanın üzerinden yukarıya doğru kapiler etki ile

tırmanırken uygulanan maddeleri polaritelerine göre koşturur. Uygulama sonrası madde spotları UV (254 ve 366 nm) ışığı altında kontrol edilir. UV ışığı altında görünmeyen bileşenler iyot, seriksülfat gibi reaktiflerle görünür hale getirildikten sonra değerlendirme yapılır. Rf değerleri aynı olan maddeler aynı maddeler olarak değerlendirilir.

Bu çalışmada İTK uygulamaları kolon kromatografisi ile toplanan fraksiyonlardan aynı olanlarını birleştirmek için kullanılmıştır. Spotların görünür hale getirilmesi işlemi seriksülfat çözeltisi ile yapılmıştır.

2.9.3. Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC)

Modern HPLC sistemleri istenilen akış hızında (0.1-5 mL/dakika) dört farklı çözücü sistemini izokratik, gradiyent ya da sabit şekilde pompalayabilen bir pompadan, maddeleri yüksek ayırma kapasitesine sahip kolondan ve ayrılan maddeleri tayin edebilecek bir detektörden oluşur. Detektörden çıkan maddeleri toplamaya yarayan fraksiyon toplayıcılar sayesinde ayrı ayrı toplamak da mümkündür. Uygun yazılımlarla HPLC cihazına entegre edilen bu toplayıcılar preparatif olarak maddelerin ayrılmasına olanak sağlar.

HPLC sistemleri, genelde termal olarak kararlı olan ve GC ile analizi mümkün olmayan maddelerin analizlerinde kullanılmaktadır. Yüksek kaynama noktalı, birbirine yakın özelliklerdeki polar maddelerin ayrımı kolaylıkla HPLC sistemlerinde yapılabilmektedir. Uygun detektör seçimi ya da enjeksiyon öncesi türevlendirme işlemleri ile neredeyse bütün termal kararlı maddelerin ayrımı ve ayrılan her maddenin de hem kalitatif hem de kantitatif analizi yapılabilir.

HPLC sistemlerinde kullanılan, uzunlukları 100 mm ile 300 mm, çapı ise 4-6 mm arasında değişen tanecik büyüklüğü 5 μm boyutunda olan çelik kolonlar ticari olarak mevcuttur. En yaygın olarak ters faz (apolar dolgu maddeli) ve normal faz ( polar dolgu maddeli) kolonlar kullanılır. Hareketli faz olarak da ters faz kolonlar için genelde değişik mobil faz düzenleyicilerle birlikte ( TCA, TFA, Asetik Asit, Sülfürik asit vb.) su ve asetonitril normal faz kolonlar için metanol , diklormetan vb. çözücüler kullanılır.

2.9.4. Gaz Kromatografisi (GC)

Uçucu organik bileşiklerin tespitinde oldukça yaygın olarak kullanılan GC, 1951 yılından itibaren gelişerek ve oldukça çok yönlü kullanımı olan bir teknolojidir. Özellikle rutin analiz yöntemleri ile belirlenmesi güç olan ve çok zaman alan uçucu ve uçucu hale getirilebilen organik maddelerin bu yöntemle belirlenmesi öncelikli tercih nedenidir. Gaz kromatografisinde analizi yapılacak bileşiğin mutlaka buharlaştırılması gerekmektedir. Bunun için bir GC cihazı toplamda 6 ana parçadan oluşmaktadır. Bunlar, taşıyıcı gazın basınç ayarını yapacak bir regülatör ve valf ünitesi, enjeksiyon sistemi, ayırma kolonu, detektör, detektörün içine konduğu ve sabit sıcaklığı sağlayan fırın ve bir kaydediciden oluşmaktadır.

Taşıyıcı gaz olarak genelde helyum, hidrojen veya azot gibi inert gazlar kullanılır. Belirli bir sıcaklıkta ve akım hızında karışımı kolon içinde sürükleyerek taşır. Numuneler genelde kolona bozunmaya neden olmayacak kadar kısa sürede ve küçük hacimlerde (µL) enjekte edilirler. Enjeksiyon portunda numune aniden buharlaştırılarak gaz fazına dönüştürülür. Taşıyıcı gaz ile birlikte kolon içinde sürüklenir. Kolon boyunca kolon içinde ilk olarak adsorbe edilen madde sonradan gelen gaz ile tekrar desorbe edilir ve böylece kolonun değişik noktalarında ve değişik zamanlarda kolon içinde ortaya çıkan gazdaki bileşenler bir detektör yardımı ile kaydedilir. Detektör sinyalleri kaydedicide pik şeklinde grafiğe dökülür. Her bir pik bir bileşeni ifade etmektedir. Her bir pikin alanı konsantrasyonu değerini ifade etmektedir.

Katı numunelerde analizlerin yapılması durumunda az miktarda katı numuneden alınır ve bir tüp içine yerleştirilir. Tüp, daha sonra GC’ye sonradan ilave edilebilen buharlaştırma ünitelerine (örneğin head-space gibi) yerleştirilir ve uygun elektrik akımı, sıcaklık programı vs. verilerek tüpün içindeki katı maddenin tamamen gaz fazına geçirilmesi sağlanır ve sonra tüpün ağzı açılarak buharlaşan gaz, taşıyıcı gazla kolon içinde süpürülür.

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1. Bitkisel Materyal

Doç. Dr. Murat Aydın ŞANDA tarafından Konya yöresinde 2012 yılının temmuz ayında toplanarak güneş görmeyecek şekilde kurutulan Sphaerophysa kotschyana bitkisinin yaprak-gövde ve meyvesi kimyasal analiz için laboratuvarımıza gönderildi. 3.2. Kullanılan Kimyasal Maddeler

Çözücüler: Metanol, Asetonitril, petrol eteri 40-60º (Merck), kloroform, etil asetat (Carlo Erba), Diklormetan, etanol (Tekkim). Bütün çözücüler destilleme işlemi yapılmadan kullanıldı. Deiyonize su Milipore 550 cihazından elde edildi. NMR ölçümleri için kullanılan döteryumlu çözüler: CDCl3 DMSO-d6, D2O (Merck).

Reaktifler: DPPH, FeCl3, ferrozin (Sigma), K3Fe(CN)6, TCA, KH2PO4, Na2CO3, Folin-Ciocalteu Reaktifi (Sigma-Aldrich), BHA, BHT, Vitamin E, Gallik asit (Merck), Amonyum seryum sülfat (Sigma).

Dolgu maddeleri; Silika jel (Merck 60-230 mesh), silika jel GF254 İTK tabakaları (20x20), Alimüna İTK tabakları (20x20) (Merck).

Belirteçler: Serik sülfat (12 g amonyum seryum (IV) sülfat + 50 mL Derişik. Sülfürik Asit+ 450 mL Su şeklinde hazırlandı).

3.3. Cihazlar

GC-MS: Perkin Elmer Clarus500

HPLC: Shimadzu, LC-20AT pomp, DGU-20A5 Degasser, SPD-M20A Dedector, CTO-20AC Column Oven

UV Spektrofotometre: Perkin Elmer Lambda 35

Erime Noktası (Elektrotermal 9100 Erime Noktası Tayin Cihazı) Santrifüj (Hettich EBA20)

Döner buharlaştırıcı (IKA) Manyetik karıştırıcı (IKA) Etüv

Vortex (Velp Scientifica) Ultrasonik Banyo (Elma)

3.4. Antioksidan Aktivite Testleri

Bitki türevli yenilebilir/yenilemez ürünler büyük oranda antioksidan özelliğe sahip fenolik bileşikler (örneğin; fenolik asitler, flavanoidler, antosiyaninler, taninler, lignanlar ve kateşinler) içerir. Bu fenolikler, kalp hastalıkları, bazı kanser türleri ve oksidatif strese bağlı diğer hastalıklara yakalanma riskini arttırdığı bilinen zararlı serbest radikalleri engeller (Ness ve Powles, 1997). Bu bileşiklerin antioksidan özellikleri temelde onların hidrojen atomu vericisi veya indirgeme ajanı olarak davranmalarından dolayı indirgeyebilme yeteneklerinden kaynaklanır. Bu doğal antioksidanlar; serbest radikal toplayıcısı, zincir kırıcı, proantioksidant metal iyonlarını kompleksleştiricisi olarak davranır.

Meyvelerin, sebzelerin ve diğer bitki türevli ürünlerin antioksidan aktivitesini bir tek testle kesin olarak tespit etmek zordur. Doğal kaynaklı ürünlerin antioksidan aktivitesini değerlendirmek/tahmin etmek için birçok test önerilmiştir. Doğal ürünlerin antioksidan aktivitesinin belirlenmesi için en azından iki test uygulanmalıdır.

3.4.1. Serbest Radikal Giderme Aktivitesi

Serbest radikal (DPPH·) giderme aktivitesi Liyana-Pathirana’nın özetlediği metotta bazı modifikasyonlar yapılarak değerlendirildi (Liyana-Pathirana ve Shaihidi, 2005). DPPH· (2,2-difenil-1-pikril hidrazil) 0,135 mM’lik etanol çözeltisin 1 mL si üzerine değişik

konsantrasyonlarda (40-80-160 µg/mL) numune çözeltisi ilave edildi. Son hacim etanol ile 4 mL’ye tamamlandı. Karışım şiddetli şekilde vortekslenerek oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildi. Spektrofotometrik ölçüm (Jasco V-530, Japan Servo Co. Ltd., Japan) oda şartlarında, 517 nm’de yapıldı. Denemeler üç tekrarlı olarak yapıldı. Numunelerin % serbest radikal giderme aktivitesi aşağıdaki formülle hesaplandı

SRGA (%) = [ (Abskontrol-Absnumune)/Abskontrol]x100 Abskontrıol: etanol + DPPH çözeltisinin absorbansı,

Absnumune= etanol + DPPH + ekstrakt / standart absorbansı

3.4.2. İndirgeme Gücü Aktivitesi (Oyaizu Metodu)

Sphaerophysa kotschyana ekstraklarının indirgeme gücü Oyaizu metodunun (Oyaizu, 1986) bazı modifikasyonlarına (Elmastaş ve ark., 2006) göre değerlendirildi. Standart ve numunelerin etanol içindeki farklı derişimlerine (40, 80 ve 120 mg/mL) fosfat tamponu (2.5 mL, 0.2 M, pH 6.6) ve potasyum ferrik siyanür [K3Fe(CN)6] (2.5 mL, %1) ilave edildi. Bu karışım 50 ˚C’de 20 dakika inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, bu karışıma TCA (2,5 mL, % 10) ilave edildikten sonra 10 dakika 3000 rpm’de santrifüjlendi. Karışımdan 2.5 mL alınarak destile su (2.5 mL) ve FeCl3 (0.5 mL, % 0.1) ilave edildi. Elde edilen son karışımın absorbansları 700 nm’de kaydedildi. Yüksek absorbans yüksek indirgeme olarak değerlendirildi. Ölçümler üç tekrar olarak yapılmış sonuçlar absorbans ± standart sapma olarak verilmiştir.

3.4.3. Toplam Fenolik Bileşik

Sphaerophysa kotschyana’nın total fenolik bileşik tayini Folin-Ciocalteu reaktifi ile yapıldı (Slinkard ve Singleton 1977). Bitki ekstraktı (0.5 mL, 1 mg/mL) üzerine 10 kat seyreltilmiş Folin-Ciocalteu reaktifi (2.5 mL) ve Na2CO3 (2 mL, 75g/L) ilave edildi. Bu karışım vortekslendikten sonra 50°C de 5 dakika inkübe edildi. Numuneler oda sıcaklığına getirildikten sonra 760 nm’deki absorbansları spektrofotometrede kaydedildi. Kontrol olarak su kullanıldı. Standart olarak kullanılan gallik asitin değişik

derişimleri ile elde edilen kalibrasyon eğrisini oluşturuldu. Sonuçlar mg/L gallik aside eşdeğer fenolik madde ± standart sapma olarak verildi.

3.4.4. Katyon Serbest Radikal Giderme Aktivitesi

Serbest radikal (ABTS•+) giderme aktivitesi Re’nin önerdiği metoda göre yapıldı (Re ve ark., 1999). Serbest radikal (ABTS•+) giderme aktivitesi için 0,1 M pH: 7.4 PO4 3-tamponu, 2mM’lık ABTS·+ _{ve 2,45 mM’lık potasyum persülfat (K2}

S2O8) çözeltisi hazırlandı. ABTS·+

ve K2S2O8 çözeltileri(1:2) ABTS•+ - K2S2O8 olacak şekilde karıştırıldı ve 6 saat karanlıkta inkübe edildi. Farklı konsantrasyonlarda (2,5-5-10 μg/mL) numune ve standart çözeltileri alındı ve üzerine 1 ml ABTS•+

- K2S2O8 çözeltisi eklendi. Toplam hacim 4 ml olacak şekilde fosfat tamponu ilave edildi. Karışım şiddetli şekilde vortekslenerek 30 dk inkübe edildi. Spektrofotometrik ölçüm oda şartlarında, 734 nm’de yapıldı. Uygulamalar üç tekrarlı olarak yapıldı. Numunelerin ve standartın % katyon serbest radikal giderme aktivitesi aşağıdaki formülle hesaplandı.

KRGA (%) = [ (Abskontrol - Absnumune)/Abskontrol]x100

Abskontrıol: PO43- tamponu + ABTS•+ - K2S2O8 çözeltisinin absorbansı,

Absnumune= PO43- tamponu + ABTS•+ - K2S2O8 çözeltisinin + ekstrakt / standart absorbansı

Abskör = PO43- tamponu

3.5. Sphaerophysa kotschyana Bitkisinin Yağ Asitlerinin Analizi

Sabit yağ analizi için 100 mg yağ örneği (kolon kromatografide %100 hekzan ile alınan kısım) tartılarak hekzan (3 mL) içinde çözüldü. Esterleştirme işlemi için yağ örneği üzerine metanol içinde hazırlanan KOH (3 mL, 0,5 N) çözeltisinden eklendi. 3 dakika vortekslendi. Üst fazdan 1 mL alınarak direk olarak GC-MS cihazında analiz edildi.

Gaz kromatografi (GC) analizi: Bitki ekstrelerinde bulunan kimyasal bileşenlerin analizleri Perkin Elmer Clarus 500 marka gaz kromatografisi kullanılarak analiz edilmiştir. Bileşenlerinin Gaz Kromatografisinde alıkonulma zamanlarına göre gelen

piklerin alanı hesaplanarak yüzde olarak verilmiştir. Standart FAME miks karışımı (Supelco) kullanılarak pik çakıştırma yöntemine göre bileşenler karakterize edilecektir. Cihaz Şartları

Kolon: TR-FAME 70 kapiler kolon (0.25id x 30 m ) Dedektör: FID

Taşıyıcı Gaz: He

Yakıcı Gazlar: Yüksek saflıkta (%99,999) kuru hava ve hidrojen Enjeksiyon sıcaklığı: 250 °C

Kolon sıcaklığı: Fırın sıcaklığı 60 °C de 5 dakika bekletildikten sonra 220 °C ye hızla çıkarılacak ve 220 °C’de 10 dakika bekletilecek.

Dedektör sıcaklığı: 270 °C Split oranı: 1:20

Enjeksiyon miktarı: 0,2µL

3.6. Vitamin A ve Vitamin E’nin HPLC ile Kantitatif Tayini

Bitkinin yaprak-gövde ve meyvesinden 5’er g alınarak sıvı azot ile havanda parçalandıktan sonra 1’er g tartıldı ve üzerlerine 10 mL hegzan-metilenklorür karışımı (6:4) ilave edildi. Vortekslenip 2 saat ultrasonik banyoda bekletildi ve daha sonra tüplere alınarak çözücüsü uçuruldu. HPLC analizleri öncesi 5 mL etil alkol ile tekrar çözülüp, 20 µm filtre ile süzüldükten sonra 20 µL olarak HPLC’ye enjekte edildi. Vitamin A ve vitamin E kantitatif analizleri için; DAD dedektörlü HPLC sisteminde yapılmıştır. Analiz ve standartların kromatografik ayrımlarında Wakosil (150x4.60 mm, 5 µm) C18 ters faz dolgu maddeli kolon kullanıldı. Mobil faz olarak % 100 metanol, mobil faz akış hızı 1 mL/dakika olarak belirlendi. Dedektör dalga boyu; vitamin E için 295 nm ve vitamin A için 450 nm olarak seçildi. Numune ve standartlar cihaz 20 μL olarak enjekte edildi ve kolon sıcaklığı ise 50°C’ye ayarlandı. Vitaminlerin kantitatif analizleri standartların kalibrasyon garfiği kullanılarak hesaplanmıştır.

4. BULGULAR ve TARTIŞMA

4.1.Antioksidan Aktive Testlerinin sonuçları

Sphaerophysa kotschyana bitkisine ait yaprak gövde ve meyve kısımlarına antioksidan kapasiteleri, serbest radikal giderme aktivitesi, indirgeme gücü aktivitesi, katyon serbest radikal giderme aktivitesi ve total fenolik bileşik tayini yapılarak belirlenmiştir

4.1.1. Serbest Radikal (DPPH●) Giderme Aktivitesi

1,1-Difenil 2-pikril hidrazil serbest radikalini giderme aktivitesi temeline dayanılarak yapılan (DPPH●_{) radikal giderme aktivitesi Sphaerophysa kotschyana bitkisinin meyve} ve yaprak gövdesine uygulandı. Sphaerophysa kotschyana bitkisinin (DPPH●) radikali giderme aktiviteleri analiz edilmiş ve pozitif kontrol olarak BHA ve Trolox ile kıyaslanmıştır. Bitkiye ait sonuçları standart olarak kullanılan BHA ve Troloks ile karşılaştırıldığında serbest radikal giderme aktivitesi çok düşük olduğu görülmüştür. BHA, BHT ve Trolox’un serbest radikal giderme aktiviteleri % 80–90 iken yaprak - gövde aktivitesi %20, meyvede ise %10 kadar az olduğu Şekil 4.1’de görülmektedir. Bu nedenle bitkinin serbest radikal giderme aktivitesinin çok düşük olduğu gözlenmiştir.

Şekil 4.1. Sphaerophysa Kotschyana bitkisinin DPPH radikal giderme aktivitesi 4.1.2. İndirgeme Gücü

İndirgeme gücü analizinde Sphaerophysa kotschyana bitkisine ait yaprak gövde ve meyve kısmının ortamdaki Fe3+ iyonlarını Fe2+

ye indirgeyerek ortamda serbest radikal oluşumunu engellemede aktivitesinin çok düşük olduğu ölçümlerin BHT, BHA ve Trolox standardıyla karşılaştırılmasıyla belirlenmiştir (Şekil 4.2).

Şekil 4.2. Sphaerophysa kotschyana bitkisinin indirme gücü aktivitesi

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 5 10 15 20 25 30 35 DP PH G id er m e A kti vi tes i ( % ) Konsantrasyon (µg/mL) yaprak gövde meyve BHT BHA Trolox 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 0 5 10 25 Abso rba ns ( 700 nm ) konsantrasyon (µg/mL) BHT BHA TROLOX meyve yaprak-gövde

4.1.3.Katyon Serbest Radikal Giderme Aktivitesi

Sphaerophysa kotschyana bitkisinin yaprak-gövde ve meyve kısmında yapılan katyon serbest radikal giderme aktivite belirlenmesinde aktivitelerinin yüksek olduğu gözlenmiştir. Şekil 4.3’de görüldüğü gibi standart olarak kullanılan trolox ve BHA aktivitelerine benzer bir aktivite göstermektedir.

Şekil 4.3. Sphaerophysa kotschyana bitkisinin katyon serbest radikal giderme aktivitesi 4.1.4.Total Fenol Bileşik Tayini

Sphaerophysa kotschyana bitkisinin yaprak-gövde ve meyve kısmının fenolik bileşik miktarı tayini yapılmıştır. Fenolik bileşiklerin tayininde gallik asit kullanılarak elde edilen kalibrasyon grafiği kullanılmıştır (Y=0,9742X+0.0469; R2

=0,999). Fenolik bileşik miktar tayini Gallik aside eşdeğer gram olarak hesaplanmıştır. Çizelge 4.1’de de görüldüğü gibi Sphaerophysa kotschyana bitkisinin içeriği toplam fenolik bileşik miktarı çok düşük bulunmuştur. Meyve kısmında fenolik bileşik yok denecek kadar azdır. Ma ve arkadaşlarının (2003) daha önce yapmış oldukları çalışmada, S. salsula bitkisinde flavonoid saflaştırmışlar ve saflaştırılan flavonoidlerin yapılarını aydınlatmışlardır. Bu çalışmada kullanılan folin-ciocalteau reaktifinin flavonoidlerle reaksiyona girmediğinden dolayı fenolik bileşik miktarı analiz sonucunda az çıkmasına neden olmuştur. 0 20 40 60 80 100 120 0 10 20 30 40 50 60 A B T S K a ty o n R a di ka li G ide rm e A k ti v ite si (% ) Konsantrasyon (µg/mL) meyve yaprak gövde BHA Trolox

Çizelge 4.1. Sphaerophysa kotschyana bitkisinin total fenolik bileşik tayini

Fenolik Bileşik Miktarı (mg Gallik aside eşdeğer/kg bitki)

Yaprak - Gövde 0,357

Meyve 0,006

4.2. A ve E Vitamini Tayini

Sphaerophysa kotschyana bitkisinin yaprak-gövde ve meyve kısmının vitamin A ve vitamin E içeriği HPLC cihazı ile belirlendi. Vitamin A değerleri Çizelge 4.2’de görüldüğü gibi birbirine yakın değerlerde bulunmuştur. Vitamin E değerleri ise yaprak-gövdede meyveye nispeten daha fazla olduğu gözlemlendi.

Çizelge 4.2. Sphaerophysa kotschyana bitkisinin A ve E vitamini tayini

Vitamin A(mg vit/kg bitki) Vitamin E(mg vit/kg bitki)

Yaprak-Gövde 16.8 84.1

Meyve 15.85 70.6

4.3. Yağ Asitleri Analizi

Sphaerophysa kotschyana bitkisinin meyvesinde elde edilen sonuçlara bakıldığında en yüksek oranda linoleik asit (72,41), palmitik asit(18,20), stearik asit (4,74) ve oleik asit (1,39) içerdiği diğer yağ asidi bileşenlerinin %1’in altında olduğu gözlemlenmiştir (Çizelge 4.3). Meyvedeki doymuş yağ asiti %25,08 iken doymamış yağ asitleri toplamı %74,93 oranında olduğu gözlemlenmiştir. Meyve için elde edilen yağ asitleri bileşenlerine bakıldığında doymamış yağ asitlerinin doymuş yağ asitlerine oranı(USFA/SFA) 3 gibi yüksek oran elde edilmiştir ve çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) 73,32 olarak hesaplanmıştır (Çizelge 4.4).

Yaprak-gövde için elde edilen sonuçlara bakıldığında en yüksek oranda linoleik asit (%59,12), stearik asit (%13,42), miristik asit (%8,35) ve laurik asit (%7,32) içerdiği görülmektedir (Çizelge 4.3.). Bunun yanı sıra en düşük oranda α-linolenik asit (%0,44) olarak analiz edilmiştir. Yaprak-gövde için yağ asitleri bileşenlerine bakıldığında

doymuş yağ asitleri %37,45, doymamış yağ asitleri toplamı %62,55 ve doymamış yağ asitlerinin doymuş yağ asitlerine oranı %1,7 olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.4).

S.kotschyana bitkisi zeytinyağındaki bazı yağ asitleriyle karşılaştırıldığında linolenik asit; zeytinyağında S.kotschyana bitkisinden %1’den daha düşük yüzdelerde bulunur. S.kotschyana bitkisinin meyvesinde %18,20 çıkan palmitik asit yüzdesi zeytinyağında %7,5-20 arasındadır. Zeytinyağında oleik asit %55-83 arasındayken S.kotschyana bitkisinde çok düşüktür (% 1,59). Diğer taraftan linoleik asit S.kotschyana bitkisinin meyvesinde %72,41 bulunmasıyla zeytinyağından (%3,5-21) daha yüksek çıkmıştır (Anonim, 2007).

Çizelge 4.3. Sphaerophysa kotschyana bitkisinin yağ asidi bileşenleri

Karbon sayısı

Yağ asidi Yağ asidi miktarı (%)

Meyve Yaprak gövde

C12:0 Laurik Asit 0,18 7,32 C14:0 Miristik Asit 0,75 8,35 C16:0 Palmitik Asit 18,20 C16:1 Palmitoleik Asit 0,22 0,61 C17:0 Heptadekanoik Asit 0,25 2,73 C18:0 Stearik Asit 4,74 13,42 C18:1n9c Oleik Asit 1,39 1,59 C18:2n6c Linoleik Asit 72,41 59,12 C18:3n3 α-Linolenik Asit 0,88 0,44 C21:0 Hekzanoik Asit 0,38 2,29 C24:0 Lignoserik Asit 0,58 3,34 C22:6n3 cis-4,7,10,13,16,19-Dokosaheksaenoik Asit 0,03 0,79

Çizelge 4.4. Sphaerophysa kotschyana bitkisinin doymuş ve doymamış yağ asidi oranları

Yağ asitleri(%) Meyve Yaprak ve gövde

Doymuş yağ asitleri

(SFA) 25,08 37,45

Tekli doymamış y.a.

(MUFA) 1,61 2.2

Çoklu doymamış y.a.

(PUFA) 73,32 60.35

Doymamış y.a./doymuş y.a.

oranı (USFA/SFA) 3 1.7

4.4. Ayırma/saflaştırma Aşaması

Kolon dolum işleminde 1 kg silika jel kullanıldı. Dolum sırasında silika jel hekzan ile bulamaç yapılarak kolona aktarıldı. Ayırma işleminden sonra kolondan 5 L hekzan geçirilerek kolon stabilizasyonu sağlandı. Ham ekstrakt mümkün olan en az metanol ile çözülerek 1:1 olacak şekilde silika jel ile karıştırılarak kuru hava ile kuruluğa kadar çözücüsü uzaklaştırıldı. Tamamen kurutulmuş silika jel-ham ekstrakt karışımı kolona yüklendi. Kullanılan çözücü sistemi ve fraksiyon aralıkları Çizelge 4.5’de verilmiştir.

4.5. Kolon Kromatografisi Sonuçları

4.5.1. Gövde kısmı için kolon kromatografisi

8 g metanol ham ekstresi kolonda (Şekil 4.4) aşağıdaki çözücü sistemleri kullanılarak elde edildi (Çizelge 4.5).

Çizelge 4.5. Kolon kromatografisi için çözücü sistemi

Çözücü sistemi Harcanan çözücü miktarı (L) Toplanan fraksiyon %100 Hekzan 10 1-2 %10EtOAc -%90 Hekzan 10 3-6 %20EtOAc - %80 Hekzan 7 7-22 %30EtOAc - %70 Hekzan 11 23-59 %40 EtOAc - %60 Hekzan 11.5 60-108 %50 EtOAc- %50Hekzan 1.6 109-136 %60 EtOAc- %40Hekzan 3 137-146 %80 EtOAc- %20Hekzan 8.8 147-154 %100 EtOAc 11 155-201 %95 EtOAc-%5 MeOH 10 202-208 %95 EtOAc-%5 MeOH 11 209(pinitol) %95 EtOH- %5 4 210-230

MeOH l %90 EtOH- % 10 MeOH l 11 231-273 %80 EtOH-%20 MeOH 10.5 274-287 %80 EtOH-%20 MeOH 10 288(sukroz) %80 EtOH-%20 MeOH 8 289-330 %60 EtOH-%40 MeOH 7.5 331-353 %50 EtOH-%50 MeOH 12.5 354-373

%25 EtOH- %75 EtOAc çözücü sistemine kadar fraksiyonlar yaklaşık 2.5 L’lik kısımlar halinde toplanırken, daha sonraki çözücü sistemleri için 500 mL’lik balonlar kullanıldı. Toplanan fraksiyonlar yaklaşık 10 mL çözücü kalıncaya kadar döner buharlaştırıcıda çektirildi. Kristallenme gözlenen tüplerdeki kristaller, uygun çözücülerle yıkanarak kristal üstünden ayrıldı ve spektroskopik yöntemlerle yapı tayinleri gerçekleştirildi. A1 kolon kromatografisinden 2 madde izole edildi.

Şekil 4.4. Kolon kromatografide kullanılan cam kolon

4.5.2.D-pinitol (1) Bileşiğinin Fiziksel ve Spektral Özellikleri

OH O OH OH HO HO CH3 1 2 3 4 5 6

Şekil 4.5. D-Pinitol (3-O-Methyl-D-chiro-inositol) bileşiğinin yapısı

D-Pinitol bileşiği fraksiyonlandırma işlemi ile elde edilen Sphaerophysa kotschyana yaprağından fraksiyonundan %95 EtOAc-%5 MeOH çözücü sisteminden izole edildi (209-230. Fraksiyon 180 mg). Bileşik beyaz renkli ve amorf toz şeklindedir. Bileşiğin erime noktası 185-186°C olup, C7H14O6kapalı formülüne sahiptir. Molekül ağırlığı 194 olarak hesaplanmıştır. Literatürde D-pinitolün erime noktası 184-186°C olarak bulunmuştur (Blanco ve ark., 2008).

OH HO OH O OH HO CH3 1 2 3 4 5 6

Şekil 4.6. D-Pinitol bileşiğinin belirlenen HMBC korelasyonları

D-Pinitol bileşiğine ait karbon ve proton kayma değerleri (Çizelge 4.6.) literatürde verilen değerlerle uyum sağlamaktadır (Blanco ve ark., 2008; Misra ve Sidriqi, 2004).

Çizelge 4.6. D-Pinitol bileşiğinin 1

H-NMR ve 13C-NMR kimyasal kayma değerleri (400 MHz DMSO-d6) C/H DEPT, APT δc (ppm) δH (ppm) 1 CH 71.38 3.44, m 2 CH 73.04 3.35 3 CH 84.21 3.01, (t, J=9.04 Hz) 4 CH 70.53 3.50, m 5 CH 72.40 3.63, m 6 CH 72.85 3.62, m OCH3 CH3 60.07 3.43, s

Şekil 4.7. D-Pinitol bileşiğinin belirlenen HMBC korelasyonları

D-pinitol bileşiğinin 1H-NMR spektrumundan,–OH protonlarının 4.3-4.8 arasında; H-3 protonunun 3.01’de triplet (J=9.04 Hz), H-4 protonunun 3.50 ppm’de multiplet olarak rezonans olmuştur. H-5 ve H-6 protonları 3.63 ve 3.62 ppm’de sinyal verirken, –OCH3 protonları ise 3.43 ppm’de singlet olarak sinyal vermiştir (Şekil 4.7).

Şekil 4.8. D-Pinitol bileşiğinin 1_{H-NMR spektrumu-D2O damlatılmış (400 MHz} DMSO-d6)

D-Pinitol bileşiğine D2O damlatılıp 1H-NMR spektrumu alındığında (Şekil 4.8) 4.3-4.8 ppm arasında gözlenen –OH protonlarına ait sinyallerin ortadan kalktığı, diğer protonlara ait sinyallerin ise bir miktar aşağı alana kaydığı gözlenmiştir.

Şekil 4.9. D-Pinitol bileşiğinin 13

C-NMR spektrumu (100 MHz, DMSO-d6)

D-Pinitol bileşiğinin 13C-NMR spektrumundan yapıda 7 tane karbon atomu olduğu görülmektedir (Şekil 4.9). Bu karbonlardan 6 tanesi metin, 1 tanesi metil karbonuna aittir.

Şekil 4.10. D-Pinitol bileşiğinin HMBC spektrumu (400 MHz, DMSO-d6)

D-Pinitol bileşiğine ait uzak mesafe etkileşmelerinin belirlendiği HMBC spektrumundan (Şekil 4.10), H-3 protonunun (3,01 ppm) –OCH3 karbonu (60,07 ppm) ile, H-5 protonunun (3,63 ppm) C-6 karbonu (72,85 ppm) ile, C-3 karbonunun (84,21 ppm) H-1 protonu (3,44 ppm) ile uzak mesafe etkileşimine girdiği görülmektedir.

Şekil 4.11. D-Pinitol bileşiğinin COSY spektrumu (400 MHz, DMSO-d6)

Proton-proton etkileşmelerinin belirlendiği COSY spektrumundan, δ 3,35’deki H-2 protonunun δ 3,01’deki H-3 protonu ile, δ 3,01’deki H-3 protonunun δ 3,50’deki H-4 protonu ile, δ 3,63’deki H-5 protonunun δ 3,50’deki H-4 protonu ile etkileşmesi görülmektedir (Şekil 4.11).

Şekil 4.12. D-Pinitol bileşiğinin HETCOR spektrumu (100 MHz, DMSO-d6)

D-Pinitol bileşiğinin HETCOR spektrumundan, bileşikteki proton-karbon eşleşmeleri tespit edilmiştir. Metoksi karbonunun (60,06 ppm) 3,43 ppm’deki protonla (H-6'), C-1 (84,26 ppm) karbonunun 3,01 ppm’deki protonla (H-1) korele olduğu görülmektedir (Şekil 4.12). C-2, C-3 ve C-4 karbonlarının (72,81, 72,96 ve 70,44 ppm) sırasıyla 3,62 (H-2), 3.34 (H-3) ve 3,50’deki (H-4) protonlarla etkileştiği tespit edildi.

Şekil 4.13. D-pinitol bileşiğinin APT, DEPT-90, DEPT-135 spektrumları (100 MHz DMSO-d6)

D-Pinitol bileşiğinin APT, DEPT-90 ve DEPT-135 spektrumları (Şekil) incelendiğinde, yapıda 7 tane karbon atomu olduğu görülmektedir. DEPT-90 spektrumundan 7 karbon atomundan 6 tanesinin metin karbonu; 60,06 ppm’deki karbonun ise DEPT-135 ve APT

spektrumlarından metoksi grubunda bulunan metil karbonuna ait olduğu görülmektedir.

Şekil 4.14. D-pinitol bileşiğinin TOCSY spektrumu

Her iki eksende de proton spektrumunu içeren ve çapraz kesişim noktalarında 5 bağa kadar kesintisiz proton ağındaki protonların birbirleri ile etkileşimlerini veren TOCSY spektrumundan H-6, H-1, H-2, H-3 ve H-4 ve protonlarının kesintisiz olarak birbirine bağlandığı tespit edilmiştir (Şekil 4.14).

Şekil 4.15. D-pinitol bileşiğinin FT-IR spektrumu (KBr)

FT-IR : ʋ=3393, 3305 (OH gerilimi), 2918 (CH), 1124 (C-O gerilimleri) cm-1

4.5.3. Sukroz (17) Bileşiğinin Fiziksel ve Spektral Özellikleri

Şekil 4.16. Sukroz bileşiğinin yapısı

Sukroz kolon kromatografisinden, %80 EtOH-%20 EtOAc çözücü sisteminden 100 mg olarak izole edilmiştir (288-300. Fraksiyon). Erime noktası 179°C olarak bulunmuştur. Bileşiğin 13

C-NMR ve 1H-NMR değerleri literatürde belirlenen değerler ile uyum göstermektedir (Popov ve ark., 2006; Wink ve ark., 2009).

O OH OH OH _O OH OH O HO OH OH 1 2 3 4 5 6 1' 2' 3' 4' 5' 6'

O O O OH OH HO OH OH OH OH OH

Şekil 4.17. Sukroz bileşiğinin belirlenen HMBC korelasyonları Çizelge 4.7. Sukroz bileşiğinin 1

H-NMR, 13C-NMR kimyasal kayma değerleri ve HMBC korelasyonları C/H DEPT δC ppm δH ppm (Hz) HMBC 1 CH2 62.58 3.55 H3 2 C 104.18 - H1ʹ 3 CH 77.50 3.87 (t, J=8.00) 4 CH 74.45 3.76 5 CH 83.00 3.56 H6 6 CH2 62.52 3.40 H4 1ʹ CH 92.23 5.17 2ʹ CH 72.09 3.16 H1ʹ 3ʹ CH 73.27 3.48 H_5ʹ 4ʹ CH 70.31 3.16 5ʹ CH 73.27 3.65 H3ʹ 6ʹ CH2 60.95 3.59

Şekil 4.18. Sukroz bileşiğinin 1

H-NMR spektrumu (400 MHz, DMSO-d6)

Sukroz bileşiğinin 1_{H-NMR spektrumundaki (Şekil 4.18.) 4.30-5.30 ppm arasındaki} pikler –OH protonlarına aittir. δ 3,87’deki triplet H-3ʹ protonuna aittir (J=8.00 Hz).

Şekil 4.19. Sukroz bileşiğinin 13

C-NMR spektrumu (100 MHz DMSO-d6)

Sukroz bileşiğinin 13_{C NMR spektrumu incelendiğinde (Şekil 4.19.) yapıda 12 karbon} atomunun olduğunu görmekteyiz. Yapıdaki karbonların dışında 56,62, 49,08 ve 18,99 ppm’de gözlenen sinyaller ise çözücü (metanol) karbonlarına aittir.