ÖNİŞLEM GÖRMÜŞ AYÇİÇEĞİ VE TÜTÜN SAPLARINDAN
ENZİMATİK YÖNTEMLE KSİLOZ ÜRETİMİ Fatmagül HALICI
Yüksek Lisans Tezi Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Doç. Dr. Özlem AKPINAR
2013 Her hakkı saklıdır
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FENBİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
ÖNİŞLEM GÖRMÜŞ AYÇİÇEĞİ VE TÜTÜN SAPLARINDAN
ENZİMATİK YÖNTEMLE KSİLOZ ÜRETİMİ
Fatmagül Halıcı
TOKAT 2013
i ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
ÖNİŞLEM GÖRMÜŞ AYÇİÇEĞİ VE TÜTÜN SAPLARINDAN
ENZİMATİK YÖNTEMLE KSİLOZ ÜRETİMİ
Fatmagül HALICI Gaziosmanpaşa Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü Gıda Mühendisliği Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. Özlem AKPINAR
Beş karbonlu pentoz bir şeker olan ksiloz, bitki hücre duvarlarında bulunan ksilanca zengin lignoselülozik materyallerden elde edilir. Tütün ve ayçiçeği sapları Tokat bölgesinde yaygın olarak bulunan ksilanca zengin tarımsal atıklardır ve ksiloz üretimi için potansiyel kaynaklardır. Ksiloz ksilanın asit hidrolizi ile üretilir; ancak ksilozun asit hidroliz metoduyla üretiminde, korozif kimyasallar kullanılmakta ve işlem sırasında istenmeyen bileşikler üretilmektedir. Ksiloz enzim hidroliziyle de üretilebilir. Enzimatik hidroliz spesifik olup, reaksiyon ılımlı koşullarda gerçekleşir ve hidrolizasyon sırasında istenmeyen bileşikler üretilmez. Bu çalışmada ayçiçeği ve tütün saplarından 160 º C de 1 saatte ekstrakte edilen ksilanca zengin likörden, Trichoderma reseei ve Trichoderma
longibrachiatum ksilanazları ile ksiloz üretilmiştir. Hidrolizasyon işlemi Cevap Yüzey
Yöntemi ile optimize edilmiştir. Substrat konsantrasyonunun (0,1- 0,4 g atık/ ml KOL) ve enzim aktivitesinin (60-240 U) ksiloz üretimine etkileri incelenmiştir. Optimum koşullar altında, ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün (KOL) (0,22 g atık/ml KOL ve 238 U) T. reseei ksilanazı ile hidrolizasyonunda ksiloz verimi ve seçicilik %86,4 ve 9,2 g/g olarak elde edilmiştir. Ayçiçeği sapı KOLünün optimum substrat konsantrasyonunda (0,24 g atık/ ml KOL) ve enzim aktivitesinde (234 U) T.
longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonunda ise ksiloz verimi ve seçicilik %69,5 ve
8,2 g/g olarak bulunmuştur. Optimum koşullar altında, tütün sapı KOLünün (0,12 g atık/ ml KOL ve 114 U) T. reseei ksilanazı ile hidrolizasyonunda ksiloz verimi ve seçicilik %92,2 ve 2,1 g/g olarak elde edilmiştir. Tütün sapı KOLünün optimum substrat konsantrasyonunda (0,28 g atık/ml KOL) ve enzim aktivitesinde (228 U) T.
longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonunda ise ksiloz verimi ve seçicilik sırasıyla
%79,8 ve 1,9 g/g olarak bulunmuştur.
2013, 107 sayfa
ii ABSTRACT
M. Sc. Thesis
ENZYMATIC XYLOSE RELEASE FROM PRETREATED SUNFLOWER AND TOBACCO STALKS
Fatmagül HALICI Gaziosmanpaşa University
Graduate School of Natural and Applied Science Department of Food Engineering
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Özlem AKPINAR
Xylose, a five carbon pentose sugar, is obtained from the xylan rich lignocellulosic materials, present in the plant cell walls. Sunflower and tobacco stalks, widely available at Tokat region, are xylan rich agricultural waste and serve as potential sources for xylose production. Xylose is produced by acid hydrolysis of xylan, but the acid hydrolysis production method of xylose is corrosive and produces some undesirable compounds. Xylose can also be produced by enzymatic hydrolysis. Enzymatic hydrolysis is more specific, the reaction takes place at moderate conditions and during the hydrolysis undesirable compounds are not produced. In this work, xylan rich liquors, extracted at 160 º C for 1 h from sunflower and tobacco stalks, were used to produce xylose with Trichoderma reseei and Trichoderma longibrachiatum xylanases. Responce Surface Methodoloy was used for the optimization of hydrolysation process. The effects of substrate concentrations (0,1- 0,4 g waste/ ml CAL) and enzyme activity (60-240 U) were investigated for the production of xylose. Under the optimum conditions, xylose yield and selectivity for the concentrated autohydrolysis liquor (CAL) of sunflower stalk (0,22 g waste/ml CAL and 238 U) with T. reseei xylanase were obtained as %86,4 and 9,2 g/g, respectively. For the hydrolysis of CAL of sunflower stalk with T. longibrachiatum xylanase at the optimum substrate concentration (0,24 g waste/ml CAL) and enzyme activity (234 U), xylose yield and selectivity were found as %69,5 and 8,2 g/g, respectively. Under the optimum conditions, xylose yield and selectivity for CAL of tobacco stalk (0,12 g waste/ml CAL and 114 U) with T. reseei xylanase were obtained as %92,2 and 2,1 g/g, respectively. For the hydrolysis of CAL of tobacco stalk with T. longibrachiatum xylanase at the optimum substrate concentration (0,28 g waste/ml CAL) and enzyme activity (228 U), xylose yield and selectivity were found as %79,8 and 1,9 g/g, respectively.
2013, 107 pages
iii ÖNSÖZ
Araştırmanın planlanmasında ve yürütülmesinde emeği olan ve çalışmanın her aşamasında desteğini ve ilgisini hiç esirgemeyen danışman hocam sayın Doç. Dr. Özlem AKPINAR’a; tezimi okuyup değerlendirdikleri için değerli jüri üyelerim Doç. Dr. Bilge Hilal ÇADIRCI ve Yrd. Doç. Dr. Şeniz KARABIYIKLI’ya her zaman yanımda olup desteklerini hiç esirgemeyen aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
Bu çalışma Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Projeleri Araştırma Komisyonu (Proje no: 2013/46) tarafından desteklenmiştir.
Fatmagül HALICI Ekim, 2013
iv İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ... i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ……… iii İÇİNDEKİLER ……… iv KISALTMA DİZİNİ ………. vi ŞEKİLLER DİZİNİ ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ ……… x 1. GİRİŞ ……….. 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ……….... 3 2.1. Tarımsal Atıklar ………... 3 2.2. Lignoselülozik Materyaller ……….. 5 2.3. Selüloz ... 6 2.4. Lignin ………... 8 2.5. Hemiselüloz ……….. 9
2.5.1. Hemiselülozun kaynağına göre yapısı ………... 10
2.5.2. Hemiselülozun eldesi ve lignoselülozik materyallere uygulanan önişlemler ………... 12
2.5.3. Hemiselüloz ve parçalanma ürünlerinin kullanım alanları ………... 13
2.6. Ksiloz ve Ksilitol ……….. 16
2.6.1. Ksilozun elde edilme yöntemleri ………... 18
2.7. Ksilanazlar ……… 22 2.8. Endoksilanazlar ……… 24 3. MATERYAL ve YÖNTEM... 28 3.1. Materyal ……….... 28 3.2. Yöntem ..………... 28 3.2.1. Otohidroliz ………. 28 3.2.2. Analitik yöntem ………. 28 3.2.3. Nem ………... 29 3.2.4. Kül ………. 29
v
3.2.5. Klason ve asitten çözünür lignin ………... 30
3.2.6. Polisakkarit analizi ………... 30
3.2.7. Enzim aktivitesinin belirlenmesi ……….. 30
3.2.8. Enzimatik hidroliz ……… 31
3.2.9. Deneysel tasarım ve cevap yüzey metodu (Response Surface Methodology RSM) ile hidrolizasyon koşullarının optimizasyonu... 31
3.2.10. İnce tabaka romotografisi (TLC) ile hidrolizatların kalitatif analizi ……... 32
3.2.11. Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile hidrolizasyon ve fermantasyon ürünlerinin kantitatif tayini………... 32
3.2.12. Furfural ……… 33
3.2.13. Üronik asit ………... 33
3.2.14. İndirgen şeker ……….. 33
3.2.15. İstatistiksel Analiz ………... 34
4. BULGULAR ve TARTIŞMA...………... 35
4.1.Ayçiçeği ve Tütün Sapı Karakterizasyonu ……… 35
4.2.Ayçiçeği ve Tütün Sapı Otohidrolizi ………. 37
4.3. Ksilanın enzimatik hidrolizi ………. 39
4.3.1. Ksilan hidrolizinde kullanılan ksilanazlar ve özellikleri... 39
4.3.2. Otohidroliz edilen tütün ve ayçiçeği sapının Tricoderma reesei ve Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizi... 41 4.3.3. Konsantre otohidroliz likörürün Tricoderma reesei ve Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizi ………... 47
4.4. İstatistiksel Modelleme ………. 58 4.5. Optimizasyon ……… 74 5. SONUÇ ………... 88 KAYNAKLAR ……….. 90 EKLER ………... 97 EK A ……….... 99 EK B ……….... 101 EK C………... 102 ÖZGEÇMİŞ ………. 107
vi
KISALTMALAR DİZİNİ
Kısaltma Açıklama
KOL Konsantre Otohidroliz Likörü
DNS Dinitrosalisilikasit
HPLC TLC
Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi İnce Tabaka Kromatografisi
RSM Cevap Yüzey Yöntemi (Response Surface Methodology)
X1 Substrat konsantrasyonu
X2 Enzim aktivitesi
Y1 Verim
vii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. Sayfa Lignoselülozik yapı ………... 6
Şekil 2.2. Selülozun molekül yapısı ………... 7
Şekil 2.3. Ligninin yapısı ………... 9
Şekil 2.4. Farklı hemiselülozların yapısı ……….... 10
Şekil 2.5. Lignoselülozik materyallerden asit hidrolizi ile oluşan bileşenler.….... 20
Şekil 2.6. Ksilanazların ksilan iskeletindeki rolleri ……….... 23
Şekil 4.1. Otohidrolize edilen ayçiçeği sapının Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyon hidrolizasyonu ……….. 43
Şekil 4.2. Otohidrolize edilen ayçiçeği sapının Trichodermalongibrachiatum ile hidrolizasyonu ………... 44
Şekil 4.3. Otohidrolize edilen tütün sapının Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu ……….. 45
Şekil 4.4. Otohidrolize edilen tütün sapının Trichodermalongibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu ………... 46
Şekil 4.5. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörü deneme planının Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu ………... 48
Şekil 4.6. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörü deneme planın Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu ………... 49
Şekil 4.7. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörü deneme planının Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu ………... 50
Şekil 4.8. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörü deneme planın Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu ……….... 51
Şekil 4.9. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu A: 8. saat, B: 24. saat .…………... 54
Şekil 4.10. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu A: 8. saat, B: 24. saat .... 55 Şekil 4.11. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu A: 8. saat, B: 24. saat ……….... 56
Şekil 4.12. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu A: 8. saat, B: 24. Saat .... 57
viii
Şekil 4.13. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun ksiloz verimine etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey grafiği ………...
70 Şekil 4.14. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma reseei
ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun seçiciliğe etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey
grafiği ………... 70
Şekil 4.15. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma
longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim
aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun ksiloz verimine etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey grafiği ………... 71 Şekil 4.16. Ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma
longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim
aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun seçiciliğe etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey grafiği ……….... 71 Şekil 4.17. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma reseei
ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun ksiloz verimine etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey grafiği ………... 72 Şekil 4.18. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma reseei
ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun seçiciliğe etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey grafiği ………... 72 Şekil 4.19. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma
longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim
aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun ksiloz verimine etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey grafiği ………... 73 Şekil 4.20. Tütün sapı konsantre otohidroliz likörünün Trichoderma
longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu sırasında enzim
aktivitesi ve substrat konsantrasyonunun seçiciliğe etkisi. A:Kontur grafiği; B: Yüzey grafiği ……….... 73 Şekil 4.21. Optimum koşullarda tütün ve ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz
likörlerinin Trichoderma longibrachiatum ve Trichoderma reseei
ix
Şekil 4.22. Otohidrolize edilen ayçiçeği sapı konsantre likörünün optimum koşullarda Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu... 81 Şekil 4.23. Otohidrolize edilen ayçiçeği sapı konsantre likörünün optimum
koşullarda Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu... 82 Şekil 4.24. Otohidrolize edilen tütün sapı konsantre likörünün optimum
koşullarda Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu... 83 Şekil 4.25. Otohidrolize edilen tütün sapı konsantre likörünün optimum
koşullarda Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu... 84
x
ÇİZELGELER DİZİNİ
Çizelge 2.1.
Sayfa
Türkiyedeki tarımsal ürünler ve atıkları ……… 4
Çizelge 2.2. Tokat ilinin tarımsal atıkları ve üretimi ………. 5
Çizelge 2.3. Lignoselülozik biyo kütleye uygulanan ön işlemler ……….. 13
Çizelge 2.4. Farklı mikroorganizmalar tarafından üretilen bazı ksilanazların özellikleri……… 26
Çizelge 3.1. Otohidroliz likörünün enzimle hidrolizasyonunda denenen bağımsız değişkenlerin değerleri ………... 32
Çizelge 4.1. Tütün ve ayçiçeği saplarının kuru ağırlıklarının yüzde olarak kimyasal kompozisyonu ………... 35
Çizelge 4.2. Önişlem görmüş hammaddenin kompozisyonu ……… 36
Çizelge 4.3. Tütün ve ayçiçeği otohidroliz likörlerinin bileşimi ………... 38
Çizelge 4.4. Tütün ve ayçiçeği otohidroliz konsantre likörleri bileşim …………. 39
Çizelge 4.5. Hidrolizasyon için kullanılan deneme planı...……… 40 Çizelge 4.6. Önişlem görmüş ayçiçeği ve tütün sapının susbtrat konsantrasyonu
ve enzim konsantrasyonu ………...
41 Çizelge 4.7. Deneysel tasarım ve konsatre ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz
likörünün Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu sonucu elde edilen değerler ………...
60 Çizelge 4.8. Deneysel tasarım ve ayçiçeği sapı konsantre otohidroliz likörünün
Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu sonucu
elde edilen değerler ………
61 Çizelge 4.9. Deneysel tasarım ve tütün sapı konsantre otohidroliz likörlerinin
Trichoderma reseei ksilanazı ile hidrolizasyonu sonucu elde edilen
değerler ………..
63 Çizelge 4.10. Deneysel tasarım ve tütün sapı konsantre otohidroliz likörünün
Trichoderma longibrachiatum ksilanazı ile hidrolizasyonu sonucu
elde edilen değerler ………
64 Çizelge 4.11. Konsantre ayçiçeği saplarının T. reseei ksilanazı ile ksiloza
hidrolizasyonu sonucu elde edilen ksiloz verimi ve seçicilik için ANOVA Çizelgesi ……….
xi
Çizelge 4.12 Konsantre ayçiçeği saplarının T. longibrachiatum ksilanazı ezimi
ile ksiloza hidrolizasyonu sonucu elde edilen ksiloz verimi ve seçicilik için ANOVA Çizelgesi ……….. 67 Çizelge 4.13. Konsantre tütün saplarının T. reseei ksilanazı ile ksiloza
hidrolizasyonu sonucu elde edilen ksiloz verimi ve seçicilik için
ANOVA Çizelgesi ………. 68
Çizelge 4.14. Konsantre tütün saplarının T. longibrachiatum ksilanazı ile ksiloza
hidrolizasyonu sonucu elde edilen ksiloz verimi ve seçicilik için ANOVA Çizelgesi ………
68 Çizelge 4.15. Konsantre ayçiçeği sapları otohidroliz likörünün Trichoderma
reseei ksilanazı ile ksiloza hidrolizasyonunda optimizasyonu için
kullanılan istatistik programı (Design Expert) tarafından önerilen optimum hidrolizasyon koşulları ………...
75 Çizelge 4.16. Konsantre ayçiçeği sapları otohidroliz likörünün Trichoderma
longibrachiatum ksilanazı ile ksiloza hidrolizasyonunda
optimizasyonu için kullanılan istatistik programı (Design Expert) tarafından önerilen optimum hidrolizasyon koşulları………. 76 Çizelge 4.17. Konsantre tütün sapları otohidroliz likörünün ksiloza Trichoderma
reseei ksilanazı ile hidrolizasyonunda optimizasyonu için
kullanılan istatistik programı (Design Expert) tarafından önerilen optimum hidrolizasyon koşulları ………... 77 Çizelge 4.18. Konsantre tütün sapları otohidroliz likörünün Trichoderma
longibrachiatum ksilanazı ile ksiloza hidrolizasyonunda
optimizasyonu için kullanılan istatistik programı (Design Expert) tarafından önerilen optimum hidrolizasyon koşulları ……… 78 Çizelge 4.19. Optimizasyon için kullanılan istatistik programı (Design Expert)
tarafından önerilen optimum fermantasyon koşullarınlarında yapılan deney sonuçlarının tahmin edilen verilerle karşılaştırılması....……... 85
1 1. GİRİŞ
Ayçiçeği (Helianthus annuus L.) dünyanın pek çok ülkesinde tarımı yapılan, bitkisel yağ sanayisinin başlıca hammaddesini oluşturan, oldukça önemli bir yağ bitkisidir. Ülkemizde üretimi yapılan yağlı tohumlu bitkiler arasında ekim alanı açısından ve yıllık yağ üretimi açısından ayçiçeği ilk sırada yer alır (Coşge, 2007). Türkiye İstatistik Kurumu (TUİK) verilerine göre, 2012 yılında ülkemizde 6 046 160 dekarlık alanda ayçiçeği üretimi yapılmıştır (Anonim 2012a). Mekanizasyona en uygun bitki olması, fazla işgücü gerektirmemesi ve verilen teşvikler nedeniyle değişik yörelerde yıldan yıla ayçiçeği üretimi artmaktadır (Anonim, 2013c).
Tütün (Nicotiana sp.), dünyanın birçok bölgesinde ve Türkiye’nin Karadeniz Bölgesinde yetiştirilen önemli bir bitkidir. Tütünün yetiştirilme amacı, yapraklarını sigara yapımında kullanmaktır. Tütün ve ayçiçeği Tokat ve yöresinde tarımı yapılan iki önemli bitkidir. Üretime bağılı olarak, Türkiye’de yıllık 3 000 000 tondan fazla ayçiçeği sapı, 300 000 tondan fazla tütün sapı oluşmaktadır (Anonim, 2007; Anonim, 2013a).
Tütün sapı, yaprakları alındıktan sonra tarlada kalan atıklardır (Erdoğan, 2007). Ayçiçeği sapı; ayçiçeği hasat edildikten (baş kesme işlemi) sonra tarlada kalan atıklardır (Kocabıyık ve Kayişoğlu, 2003). Oluşan tütün ve ayçiçeği sapları da, diğer tarımsal atıklar gibi ya yakılmakta ya da tarlada çürümeye bırakılmaktadır. Her iki değerlendirme yönteminin de, çevre ve ekosistem için zararı bulunmaktadır. Atıkların yaygın kullanım şekli hayvan yemi olarak kullanımıdır; ancak bu kullanımın önemli bir ekonomik değeri yoktur. Günümüzde artan çevresel kaygılar, araştırmacıların bu tip tarımsal atıkların gıda ve gıda dışı amaçlar için kullanılarak değerlendirilmesi üzerinde durmasına sebep olmuştur. Bu materyallerin yüksek değerli ürünlere dönüştürülmesiyle, bu atıklar hem doğaya zarar vermeden ortadan kaldırılmış olmakta, hem de kırsal kesimde çiftçiye yeni iş imkanı sunarak çiftçinin ek gelir elde etmesine yardımcı olur (Öztürk ve Başçetinçelik, 2006; Erdoğan, 2007; Bostancı, 2009; Günay, 2010; Akpınar ve ark., 2011b; Uysal, 2011; Sabancı, 2012; Sapcı, 2012). Lignoselülozik doğaya sahip bu tip tarımsal atıklar, karbonhidrat bakımından zengin olmasından dolayı şeker, biyo yakıt (etil alkol), ksilitol, laktik asit gibi katma değeri yüksek ürünler için önemli bir kaynak oluşturur (Akpınar ve ark., 2011b). Ksilan açısından zengin olan lignoselülozik
2
materyaller, özellikle ksiloz için önemli bir kaynaktır. Lignoselülozik materyalleden ksiloz üretimi kullanılması ve üretilen ksilozdan ksilitol, etanol, 2,3 dibütanol, laktik asit, gibi ürünlerin üretilmesi açısından önem taşımaktadır (Saha, 2003).
Daha önce laboratuarımızda yapılan çalışmalarda tütün ve ayçiçeği saplarının ksiloz ve ksilitol üretimi için potansiyel bir kaynak olarak kullanılabileceği görülmüştür (Akpınar ve ark., 2011b; Uysal, 2011). Ancak söz konusu çalışmalarda; ksiloz, atıklardan seyreltik asit hidrolizi ile üretilmiştir. Asit hidrolizi özellikle fermantasyon sürecinde mayalar için olumsuz etkisi olan furfural gibi ürünlerin fazla oluşmasına neden olduğu gibi, oluşan hidrolizatın da doğrudan fermantasyon amacıyla kullanılması uygun değildir. Fermantasyondan önce, hidrolizatın nötralize edilmesi gerekmekte ve bu işlem fazla miktarda alkali gerektirdiği gibi büyük miktarlarda nötralizasyon ürünleri oluşturmaktadadır. Bu ürünlerinde fermantasyondan önce uzaklaştırılması gerekmektedir. Tüm bu işlemler düşünüldüğünde pahalı bir ürün olan ksilitol üretim maliyetleri daha da artmaktadır (Uysal, 2011; Sabancı, 2012; Sapçı, 2012).
Ksiloz asit hidroliziyle üretildiği gibi enzim hidroliziyle de üretilebilir. Enzim hidrolizinin daha spesifik olması ve reaksiyonun ılımlı koşullarda gerçekleşmesinden dolayı son yıllarda daha dikkat çeken bir yöntem olmuştur. Enzimatik hidroliz fazla enerji gerektirmediği gibi, hidrolizasyon amacıyla asit gibi korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmaz, ayrıca hidrolizasyon sonunda atıklar veya yan ürünlerde oluştumamaktadır (Erdoğan ve Akpınar, 2008; Bostancı, 2009).
Literatürde enzimatik hidrolizle bazı atıklardan ksiloz üretimi ile ilgili çalışmalar mevcuttur; fakat ayçiçeği ve tütün saplarından enzimatik olarak ksiloz üretimi ile ilgili çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada tütün ve ayçiçeği saplarından ksilan, sıcak su (otohidroliz) yöntemi ile ekstrakte edilmiş ve oluşan ürünler karakterize edildikten sonra konsantre edilen hidrolizat, ksiloz üretim amacıyla Trichoderma reseei ve
Trichoderma longibrachiatum’dan elde edilen ksilanazlarla hidrolize edilmiştir.
Hidrolizasyon koşulları, substrat miktarı ve enzim aktivitesi bakımından optimize edilmiş, tütün ve ayçiçeği atıklarından Trichoderma reseei ve Trichoderma
longibrachiatum ksilanazları ile ksiloz üretim verimleri ve seçicilikleri
3 2. KAYNAK ÖZETLERİ
2.1. Tarımsal Atıklar
Türkiye zengin tarım potansiyeline sahip olduğundan çok çeşitli tarım ürünleri yetişmekte ve buna bağımlı olarak da yılda 60 000 000 tondan fazla tarımsal atık oluşmaktadır (Öztürk ve Başçetinçelik, 2006). Tarımsal atıklar; bitkisel üretim sonucu oluşan atıklar ve tarım ürünlerinin işlenmesi sonucu oluşan atıklar olmak üzere, iki grupta sınıflandırılır. Bitkisel üretim sonucu oluşan atıklar, orman, nadas alanı, meyve ve sebze ekili alanlarında yapılan, üretim sonucunda ürün olarak nitelendirilemeyen atıklar olarak değerlendirilir. Bitkisel üretim sonucu oluşan atıklar sömek, kabuk, çekirdek, budama atığı olarak gruplandırılabilir. Tarım ürünlerinin işlenmesi sonucu açığa çıkan atıklar ise, tarım ürünlerinin doğrudan kullanıma geçmeden önceki işlemler (öğütme, ayıklama, kurutma vb.) sonucu ortaya çıkan atıklardır. Bunlar sap, saman, kabuk, çekirdek gibi kullanımı olmayan atıklardır (Anonim 2013b). Çalışmamızda araştırılan atıklar ise tarımsal ürünlerin işlenmesi sonucu oluşan ayçiçeği ve tütüne ait tarımsal atıklarıdır.
Üretilen tarımsal ürünlerin atıkları: tarla ürünleri için atıklar; saman (buğday arpa, çavdar, yulaf, pirinç, soya ve yerfıstığı), sap (mısır, darı, tütün, pamuk ve ayçiçeği ) kabuk (pirinç ve yerfıstığı), sömek (mısır) ve çırçır atığı (pamuk), bahçe ürünleri için; çekirdek (kayısı, vişne, kiraz, şeftali, limon, portakal, mandarin ve greyfurt), budama (kayısı, vişne, zeytin, antepfıstığı, ceviz, badem, fındık, şeftali, limon, portakal, mandarin ve greyfurt); kabukdur (antepfıstığı, ceviz, badem ve fındık) ve pirinadır (zeytin) (Öztürk ve Başçetinçelik, 2006; Anonim, 2007).
TUİK 2012 yılı verilerine göre, ülkemizde yetiştirilen tarım ürünlerinin başında; buğday, arpa, ayçiçeği, mısır, gibi bitkiler gelmektedir (Anonim 2012a). Ayçiçeği için Gıda Tarım ve Hayvancılık Bakanlığı’nca belirlenmiş olan teşvik fiyatları 2011 yılında 23 kuruş/kg, 2012 yılında 24 kuruş/kg, 2013 yılında 24 kuruş/kg’dır (Anonim, 2013e). Ülkemizde ayçiçeğine verilen teşvikler nedeniyle, yıllık ayçiçeği üretimi artma göstermekte ve ortaya çıkan atık miktarı da üretimle doğru orantılı olarak artmaktadır.
4
Türkiye genelinde ve Tokat bölgesinde her yıl ortaya çıkan tarımsal atıkların çeşitleri ve yıllık üretim miktarları Çizelge 2.1 ve 2.2’de gösterilmektedir (Anonim, 2007; Anonim 2012b).
Çizelge 2.1. Türkiye deki tarımsal ürünler ve atıkları (Anonim, 2012a; Anonim, 2007).
Tarla ürünler
Atıklar Üretim(ton) Alan(ha) Toplam Atıklar (ton)
Referans
Buğday Saman 20.100.000 7.529.639.4 26.130.000* Anonim, 2012a Arpa Saman 7.100.000 2.748.766.4 8.519.999* Anonim, 2012a Ayçiçeği Sap 1.370.000 604.616 3.836.001* Anonim, 2012a Pamuk Sap, Çır çır atığı 2.320.000 488.496.3 6.391.599 * 487.199* Anonim, 2012a Mısır Sap, Koçan 4.600.000 622.609 12.307.538* 241.999 * Anonim, 2012a
Çavdar Saman 253.243 145.907 405.188 Anonim, 2007
Yulaf Saman 322.830 150.459 419.678 Anonim, 2007
Çeltik Saman, Kabuk 331.563 59.879 582.555 88.527 Anonim, 2007 Tütün Sap 181.382 222.691 362.763 Anonim, 2007 Yer fıstığı Saman, Kabuk 55.241 25.167 127.054 27.621 Anonim, 2007
Soya Saman 28.795 15.064 60.468 Anonim, 2007
5
Çizelge 2. 2. Tokat ilinin tarımsal atıkları ve üretimi (Anonim 2012b)
Tarla ürünler Atıklar Üretim(ton) Alan(ha) Atıklar(ton)*
Buğday Saman 331,092 1333,641 417,176
Arpa Saman 59,43 254,44 73,098
Çavdar Saman 1,278 5,360 1,540
Yulaf Saman 2,291 9,995 2,704
Mısır Sap, Koçan 19,972 34,001 59,916
Çeltik Saman, Kabuk 1,583 2,623 1,899
Tütün Sap 2,231 26,101 4,462
Ayçiçeği Sap 28,241 102,023 112,964
*Anonim 2007 de belirtilen rakamlara göre hesaplanmıştır
Yıllık oluşan tarımsal atık miktarıda üretim miktarı ile orantılı olarak değişmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi atıkların, yakılması ya da tarlalarda çürümeye bırakılması hem çevre kirliği açısından, hem de insan sağlığı açısından olumsuz sonuçlar doğurmaktadır. Ayrıca kontrolsüz yakma işlemleri, geniş tarla yangınlarına sebep olmakta ve doğal vejetasyonu tahrip etmektedir. Bütün bunlarla birlikte kontrolsuz yakma sonucunda, ortaya çıkan duman, atmosfere karışarak havanın kirlenmesine neden olmakta ve doğanın dengesini de bozmaktadır (Sayılı ve ark., 1994). Günümüzde araştırmalar tarımsal atıkların; bioyakıtlar (etanol, biyogaz vb.), kimyasallar (fenolik maddeler vb.), gıda ürünleri (diyet lifleri, tatladırıcılar, şekerler vb.) gibi katma değeri daha yüksek olan ürünlerin üretimi amacıyla değerlendirilmesine odaklanmıştır (Howard ve ark., 2003; Anonim 2012a; Anonim 2012b; Anonim 2013b).
2.2. Lignoselülozik Materyaller
Tarımsal ürünlerin işlenmesi sonucu arta kalan atıklar; lignin, selüloz ve hemiselüloz içerdiğinden dolayı genellikle lignoselülozik materyaller olarak adlandırılır. Lignoselülozik bileşiklerin doğada bol miktarda bulunması, çeşitli kimyasalların üretiminde kullanılabilme potansiyeline sahip olması ve pahalı olmaması
6
nedeniyle günümüzde dikkat çeken bir kaynağı oluşturmuştur ve bu yüzden araştırmaların lignoselülozik materyallerin değerlendirilmesi konusunda odaklanmasına neden olmuştur (Yang ve ark., 2007; Björn ve ark., 2011). Lignoselülozik maddeler, biyoyakıt üretimi için fermente olabilir şekerlerin hammaddesini oluşturur. Bunun yanı sıra prebiyotik (ksilooligosakkarit), ksilitol, 2-3, bütandiol, laktik asit, ferulik asit gibi maddelerin üretiminde de kullanılmaktadır (Foyle ve ark., 2007; Akpinar ve ark., 2008; Akpinar ve ark., 2009; Uysal, 2011; Sabancı, 2012; Sapci, 2012). Şekil 2.1’de bitki lignoselülozik yapısının şekli ve yapıyı oluşturan bileşenlerin molekül yapısı gösterilmiştir. Bu bileşenlerin oranı kaynağına göre değişmekle birlikte temel olarak ilk sırada selüloz (%50) yer alır. Bunu hemiselüloz (%20-35) ve lignin (%10-25) takip etmektedir (Saha, 2003).
Şekil 2.1. Lignoselülozik yapı (Rubin, 2008)
2.3. Selüloz
Selüloz yeryüzünde en fazla bulunan doğal polimerdir (Fenger ve Wegener 1984). Bitkiler dışında bakteri, algler ve yosunların da selüloz ürettiği bilinmektedir (Akpınar, 2003). Dallanmamış yapı gösteren selüloz molekülü, birbiriyle (1,4)-glukozidik bağı ile bağlanmış β-D-Glukoz birimlerinden oluşmaktadır (Şekil 2.2) (Fengel, 1985; Krassig, 1993).
7
Şekil 2.2. Selülozun molekül yapısı (Ljungdahl ve Eriksson, 1985)
Selülozun sahip olduğu molekül içi ve moleküller arası hidrojen ile Van Der Waals bağları selülozu oldukça kararlı yaparken, moleküller arası hidrojen ve Van Der Waals bağları da selüloz halkalarını bir araya getirerek kristalleri meydana getirir (Akpınar, 2003). Selülozun kristallenme derecesi %60–70 arasında değişmektedir. Bu kristal bölgeler birbirinden daha az kristal amorf bölgelerle ayrılmıştır. Bu nedenle kristal yapıdaki selüloz, su ve kimyasal çekimine sınırlı düzeyde sahiptir (Sjostrom, 1993). Molekül büyüklükleri selülozun kaynağına göre bağlı olmasına rağmen ortalama molekül ağırlığı 1 000 000 daltondur (Saldamlı, 2007).
Selüloz doğada neredeyse hiçbir zaman tek başına bulunmaz. Genellikle, diğer bitkisel bileşiklerle beraber bulunur (Kurtuluş, 2010). Odunsu yapıların dokusunda selüloz molekülleri ligninle beraber kristal mikrofibriller şeklinde düzenlenmiştir. Sebzelerin dokusunu oluşturan selüloz, hemiselüloz, pektin bileşikleri ve proteinlerle birlikte bulunur (Saldamlı, 2007). Selüloz, bitki hücre duvarına turgor basıncına karşı dayanabilecek bir kuvvet verir (Kurtuluş, 2010).
Selüloz gıda, boya, tekstil, sigara filtresi, film ve levha üretimi gibi çok geniş bir alanda kullanılmaktadır. Selüloz türevlerinden hidroksietilselüloz; kauçuk, boya, petrol kuyularında, etil selüloz; kaplama, mürekkep, hidroksipropil selüloz; gıda, ilaç endüstrisinde kullanılır. Selülozun türevlerinden gıdalarda en çok kullanılanı ise, karboksimetil selülozdur. Karboksimetil selüloz iyonlaşmış karboksil grupları nedeniyle; çözelti içinde molekülleri birbirlerini iter ve bu nedenle çözeltileri yüksek viskoziteye sahiptir. Bu özelliklerinden dolayı gıdalarda yapısal özelliklerin
O H OH H H H H O H OH O O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH 1 4 1 4 1 4 1 4 OH O H OH H H H H O H OH O O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH O H OH H H H H O H O OH 1 4 1 4 1 4 1 4 OH Se Glukoz
8
oluşmasında etkilidir (Kırcı ve ark., 2001; Saldamlı, 2007). Selülozun kontrollü hidrolizi ile elde edilen mikrokristal selüloz ise; gözenekli bir yapıya sahip olduğudan dolayı, su absorblama özeliğine sahiptir, ayrıca ısı ve asitlere karşı çok dirençlidir. Gıdalarda, tat-koku maddelerini taşıyıcı, toz ürünlerde yapışmayı önleyici ajan olarak kullanılır. Ayrıca koloidal formda köpük ve emilsüyonları stabilize etmek, gıdaların bileşiminde kullanılan yağ miktarını azaltmak, pektin ve nişasta jellerini ısıya karşı dirençli hale getirmek ve ayrıca buz kristallerinin büyümesini kontrol altına almak için kullanılır (Laka ve Chernyavskaya, 2007; Saldamlı, 2007).
İnsan sindirim sisteminde selülozu parçalayan selülaz enzimleri bulunmaz, fakat otçul hayvanların işkembesinde bulunan mikroorganizmalar selülozu parçalayabilir. Tekstil, gıda, kağıt, hayvan yemi gibi çeşitli alanlarda kullanılan selülazlar mikroorganizmalar (bakteri ve küf gibi), memeli olmayan hayvanlar ve bitkiler tarafından üretilebilir. Clostridium, Cellulomanas, Bacillus gibi bakteriler ve
Tricoderma, Fusarium, Humicola, Penicillium ve Aspergillus, Schizophyllum gibi
küfler selülaz enzimlerinin en etkili üreticileridirler (Saldamlı, 2007; Bostancı, 2009). Selülozun insan beslemesindeki önemi, besinsel lif özelliğine sahip olmasıdır. Son yıllarda lignoselülozik maddelerin fermantasyon ürünlerine dönüştürülmesinin gündeme gelmesiyle, selüloz özellikle etanol üretiminde potansiyel hammadde olarak ilgi görmeye başlamıştır (Saldamlı, 2007; Romani ve ark., 2012).
2.4. Lignin
Lignin, selüloz ve hemiselülozdan sonra doğada en fazla bulunan bir polimerdir. Parçalanma ürünlerinden anlaşıldığı gibi ligninin temel yapı taşı bir aromatik çekirdek ile bir propan zincirinden oluşmaktadır (Şekil 2.3). Ligninin yapısı koniferil alkol, koumaril alkol ve sinapil alkol olmak üzere üç monomerden oluşur (Hopkins ve ark., 2001; Yıldız, 2008). Heterojen yapıdaki lignin molekülünün yapısı Şekil 2.3’te gösterilmiştir. Fenil propan üyeleri çok çeşitli tarzlarda birbirlerine bağlanarak lignini meydana getirirler (Adosinda ve ark., 2002; Kurtuluş, 2010). Lignin molekülünün büyük kısmı merkez lignin molekülüne fenilpropanoid alt ünitelerinin doğrudan C-C bağı ile bağlanması ya da eter bağları ile bağlanması ile oluşur. Yaygın bağlantı
9
fenilgliserol-β-aril eter bağları ile olur ve fenilkumaran, diarilpropan ve bifenil bağları bunu izler. Kendine özgü bir yapıda; fakat düşük oranda da difenil eterleri ve pinoresinol bağlantıları da bulunmaktadır. Yapıda bulunan tüm bu bağlar hidrolizin çok zor olmasına ya da imkansız olmasına yol açar (Yıldız, 2008).
Lignin bir karbonhidrat olmamasına karşın doğada daha çok selüloz ve hemiselüloz ile bir arada bulunduğundan karbonhidratlarla beraber incelenir (Yıldız, 2008). Lignin polimeri, karbonhidrat polimerleri ile çok yakın ilişkili olduğundan ve hemiselülozla kovalent bağlı olduğundan, kısmi hidrolizasyon olmadan lignoselülozik materyallerden izole edilemez (Higuchi, 1990; Yıldız, 2008). Lignin hücrede sekonder çeper yapısında bulunur, hücre çeperini oluşturan selüloz misellerin arasını lignin doldurur ve böylece dokunun sertleşmesini sağlar (Adosinda ve ark., 2002; Kurtuluş, 2010).
Şekil 2.3. Ligninin yapısı (Silverstein, 2004)
2.5. Hemiselüloz
Lignoselülozik maddelerin yapısında selülozdan sonra en çok bulanan madde hemiselülozdur. Lignoselülozik materyallerin yaklaşık %20-35’ini oluşturur. Hemiselüloz heterojen bir polisakkarittir. Yapısı pentoz şekerlerden (ksiloz, arabinoz), heksoz şekerlerden (mannoz, glukoz, galaktoz) ve şeker asitlerden (üronik asit, ferulik
10
asit ve kumarik asit) oluşur (Girio ve ark., 2010). Ayrıca şekerlerin bazı hidroksil grupları asetil ve metil grupları içeririr. Hemiselülozun iskelet yapısı β-1,4 bağı ile bağlı şekerlerden oluşur ve β-1,2, β-1,3 ve β-1,6 noktalarında dallanma gösterir. Hemiselüloz, yapısındaki bu şekerlere göre isimlendirilir. Bazı hemiselülozların yapısı şekil 2.4’te gösterilmektedir (Obembe ve ark., 2006).
a-D-Galaktopiranoz b-D-Gülukopiranoz a-D-Ksilopiranoz a-D-Gülukopiranoz b-D-Mannopiranoz b-D-Ksilopiranoz a-L-Arabinopiranoz b-D-Galaktopiranoz a-L-Früktopiranoz Selüloz Ksiloglükan Glükoroarabinoksilan Galaktoglükomannan
Şekil 2.4. Farklı hemiselülozların yapısı (Girio ve ark., 2010)
2.5.1. Hemiselülozun kaynağına göre yapısı
Hemiselülozun yapısı elde edilen lignoselülozik materyalin kaynağına göre değişir (Şekil 2.4). Hemiselülozların yapısı, sert odunsu ve yumuşak odunsu bitkilerde önemli farklılıklar gösterir (Fengel ve Wegener, 1984). Sert odunsu bitkilerin hemiselülozları çoğunlukla ksilanları içermesine rağmen, yumuşak odunsu-bitkilerin yapısında bulunan hemiselülozları çoğunlukla glukomannanları içerir (Saha, 2003).
11
Ksilan heteroksilan ve homoksilan şeklinde ikiye ayrılır. Homoksilanın iskelet kısmı, β-(1,3) veya β-(1,3;1,4) glukozidik bağı ile biri birine bağlanmış D-ksilopiranoz ünitelerinden oluşmaktadır ve yalnızca deniz yosunlarında görülmektedir. Heteroksilanın yapısında D-glikopiranoz, D-ksilopiranoz, D-galaktopiranoz, L-arabinofuranoz, D-mannopiranoz şekerlerini D- glukopiranosilüronik asit ve asetil ile metil gruplarını bulundurur (Şekil 2.4) ve yapısında bulundurduğu şekerlere göre glukoronoksilan, (arabino) glukoronoksilan, (glukorono) arabinoksilan olarak adlandırılır (Erbingerova ve ark., 2005; Girio ve ark., 2010; Peng ve ark.,2012).
Sert odunsu bitkilerin hemiselülozları genellikle O-asetil-4-0-metilglükoronoksilan yapısındadır. Glukuronoksilanların ana iskeletini β-(1–4) glukozitik bağı ile bağlanmış β-D ksiloprinozil üniteleri oluşturur ve yüksek oranda asetil grubu içerir. Asetil grupları ksilapiranozun C-2 yada C-3 pozisyonlarında bulunur. D-ksilopiranoz ünitelerin 2. pozisyonundaki hidroksil gruplarına 4-O-metil-α-D-glukopiranozil üronik asit bağlanmıştır (Erbingerova ve ark., 2005; Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012). Yapıyı oluşturan ksiloz üniteleri arasındaki glikozidik bağlar, asitler tarafından kolayca hidrolize olurken üronik asit ile ksiloz arasındaki bağlar çok dirençlidir (Erbingerova ve ark., 2005; Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012).
Yumuşak odunsu bitki hemiselülozları glukomanan, galaktoglukomanan, arabinagalaktan, arabinoglukuronoksilan halindedir. Çimen ve otsu bitkilerdeki hemiselüloz, ksiloglukan, arabinoglukuronoksilan ve glukuronoarabinoksilan; tahılların yapısındaki hemiselülozlar ise arabinoglukuronoksilan ve glukuronoarabinoksilandır (Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012).
Arabinaksilan; sert odunsu bitkilerin ksilanlarına benzer; fakat L-arabinoz miktarları çok yüksektir. Arabinoksilan β-(1,4) ksiloz piranoz ünitelerinden oluşan lineer iskelet üzerindeki ksiloz ünitelerine C-2, C-3 ya da her ikisi ile C-2 ve C-3 pozisyonlarında arabinofüranozun bağlanması ile oluşur, bunun yanı sıra α-L-arabinofüranozun C-5 pozisyonu ferulik ve p-kumarik gibi fenolik asitlerle esterleşmiş halde de bulunabilir. Arabinoksilan, buğday, arpa, çavdar, yulaf, pirinç ve mısır gibi tahıllarda nişasta endosperminde ve tahıl tanelerinin diğer tabakalarında ve pangola çim ve ray çim gibi bitkilerde bulunur (Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012).
Arabinoglukuronoksilan ve glukuronoarabinoksilan ksiloz ana iskeletinin 2. ve 3. pozisyonlarına sırasıyla 4-O-metil-D-glukuronik asit ve α-L-arabinofüranozun
12
bağlanması ile oluşur. Her iki yapı da birbirine benzer olmasına rağmen glukuronoarabinoksilan yaklaşık on kat daha fazla arabinoz içerir. Arabinoglukuronoksilan yapısınana iğne yapraklı bitkilerde çok rastlanmaktadır ve mısır koçanı, sisalde (bitki türü) ve çeşitli buğday türü saplarından elde edilmektedir. Glukuronoarabinoksilan yapısı, mısır, buğday, pirinç kepeği ve tahıl tanelerinin endosperm dışındaki dokularında bulunur (Erbingerova ve ark., 2005; Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012).
Mannan tipli polisakkaritleri glukomanan ve galaktomananlar oluşturur. Glukomannan; glukopiranoz ve mannopiranoz ünitelerinin β-1,4 bağı ile bağlanması ile oluşur ve sert odunsu dokularda, ksilana ek olarak %2-5 oranında bulunur. Glukomannanı oluşturan mannoz/glukoz monomerleri 1:2 veya 1:1 oranındadır; fakat bu oran kaynağına bağlı olarak değişebilir. Galaktomannanlar; β-(1,4) bağı ile bağlamış lineer yapıdaki mannopiranozlara, α-(1,6) glukozidik bağı ile bağlanan D-galaktopiranoz birimlerinden oluşmaktadır (Erbingerova ve ark., 2005; Girio ve ark., 2010; Peng ve ark., 2012).
2.5.2. Hemiselülozun eldesi ve lignoselülozik materyallere uygulanan ön işlemler
Lignoselülozik bileşikler çok kompleks yapıda oldukları için farklı ürünler olarak değerlendirilmesi için, bazı ön işlemler gerekmektedir. Hücre duvarının yapısında hemiselüloz, selüloz ve lignin bileşik halinde bulunmaktadır. Bu yüzden lignoselülozik materyallerin kullanılabilir hale getirilmesi için bir takım ön işlemlere ihtiyaç duyulur. Bu ön işlemlerin amacı; lignin, selüloz ve hemiselüloz yapısını parçalayarak yapıdan hemiselülozu uzaklaştırmak veya selüloz kristalliğini azaltarak biyo kütleyi enzimatik hidrolize duyarlı hale getirip şeker oluşumunu ya da şeker oluşturma yeteneği hızlandırmaktır (Saha, 2003).
Uygulanan ön işlemler karbonhidratların kaybını ve bozulmasını önlemeli, hidroliz ve fermentasyon işlemlerini engelleyici yan ürünlerin oluşumuna neden olmamalı, düşük maliyette saf ürün elde edilmesini sağlamalıdır (Saha, 2003; Kurtuluş, 2010). Lignoselülozik materyallere uygulanan çeşitli ön işlemler Çizelge 2.3’te gösterilmiştir.
13
Çizelge 2.3. Lignoselülozik biyo kütleye uygulanan ön işlemler (Saha, 2003)
Yöntem Örnek
Termo- mekaniksel Kesme, öğütme
Otohidroliz Su buharı, yüksek basınç
Asit uygulaması Sulu asit (H2SO4, HCI), Konsantre asit (H2SO4, HCI)
Alkali uygulaması Sodyum hidroksit, amonyum, alkali
hidrojen peroksit
Organik solvent uygulaması Metanol, etanol, bütanol, fenol
2.5.3. Hemiselüloz ve parçalanma ürünlerinin kullanım alanları
Hemiselüloz, yüksek heterojenik özelliği ve düşük suda çözünür özelliklerinden dolayı selüloz ve ligninin kullanıldığı alanda kullanılmaz. Hemiselüloz ve parçalanma ürünleri çeşitli dallarda oldukça geniş bir kullanım alanına sahiptir. Hemiselülozlar; absorbant, jelleştirici ajan, stabilizör, emülsifiyer, kalınlaştırıcı gibi gıda katkısı olarak gıdalarda kullanıldığı gibi kozmetik alanında da kullanılmaktadır. Tıp alanında ülser önleyici, öksürük kesici, bağışıklık uyarıcı ve antitümör özelliklerinden dolayı da kullanımı araştırılmaktadır (Peng ve ark., 2012).
Hemiselülozlar, filmlere dönüştürülerek, gıda ambalajlanmasında da kullanılabilir. Gıda ambajları olarak, temeli petrokimyasal maddelere dayanan plastik malzemeler kullanılır. Bunlar yüksek mekanik direnç ve elastikiyete sahip olma gibi özelliklerinin yanı sıra, bakteriler tarafından tamamen parçalanmadığından dolayı ciddi çevresel problem oluşturmaktadır. Bundan dolayı, yenilenebilir tarımsal atık materyaller gibi bitki kaynaklı biyokütlelerden bakteriler tarafından tamamen parçalanabilen biopolimerlerin üretimi ilgi görmektedir (Göksu ve ark., 2007). Hemiselülozun film amacıyla kullanımı, hem gıda ambalajlamasında, hem de biyomedikal uygulamalarda tercih edilmektedir (Hansen ve Plackett, 2008). Hemiselüloz filmlerinin oksijen geçirebilir yapıda olması, bu filmlere gıda paketlemede önemli karakteristik özellik kazandırmıştır ve diğer amiloz ve amilopektin gibi biyopolimer filmlerle karşılaştırldığı zaman da bunları daha da değerli kılmıştır (Hansen ve Plackett, 2008). Literatür
14
araştırmalarında kavak, huş ağacı, mısır koçanı ve çimenden elde edilen ksilandan film üretimine dair çalışmalara rastlanmıştır (Göksu ve ark., 2007). Hemiselülozdan film yapımı araştırma aşamasında olup, henüz ticari olarak henüz kullanılmamaktadır (Hansen ve Plackett, 2008).
Hemiselülozun modifikasyonlarına olan ilgi, selüloz ve nişasta gibi mevcut ticari polisakkaritlerle karşılaştırıldığında oldukça düşüktür (Ebringerova ve ark., 2005; Bostancı, 2009). Ksilan türevlerinden karboksimetil ksilan kağıt astarlama, deterjan, ve yapıştırıcı olarak kullanılmaktadır (Peng ve ark., 2012).
Hemiselülozun parçalanma ürünü olan ksilooligosakkaritler gıdalarda prebiyotik olarak kullanılmaktadır (Peng ve ark, 2012). Ksiloolisakkaritler ksiloz ünitelerine sahip şeker oligomerleridir ve prebiyotik etkiye sahiptir. Mide-bağırsak sistemi tarafından hidrolize edilip absorbe edilemediği için bağırsakta yaşayan bakterilere substrat olarak hizmet eder ve bağırsaktaki probiyotik aktiviteyi ve gelişimi etkiler. Ksiloolisakkaritler koroner kalp hastalığına yol açan, düşük yoğunluklu kolestrol (LDL) düzeyinin kanda azalmasına neden olur, sindirim sistemi sağlığının sürdürülmesine ve kalsiyum ve magnezyum minerallerinin biyolojik yararlılığını artırarak çözünmeyen minerallerin çözünmesine yardımcı olur, kemik erimesi hastalıklarına iyi gelmesi ve kolan kanseri riskini azaltma gibi çeşitli fizyolojik özelliklere sahiptir (Akpınar ve ark., 2009).
Hemiselülozlar, tamamen kendini oluşturan şekerlere hidroliz edilebilir ve hidrolizasyon ürünleri yakıt etanole, 5- hidroksilmetilfurfural, furfural, laktik asit, 2,3 bütilen glikol ve ksilitole dönüştürülebilir (Saha, 2003). 2,3-bütandiol (2,3-bütilen glikol) hemiselülozun parçalanma ürünlerinden üretilen bir üründür ve sıvı yakıt, çözücü, çeşitli sentetik polimer ve reçinelerin ön maddesi olarak kullanılır (Saha, 2003). Hemiselülozun parçalanması ile elde edilen ürünlerden birisi de etanoldür. Etanol; alkollü içkilerde, kimya sanayinde, fuel-oil yanında kazan yakıtı veya benzinin yanında araba yakıtı olarak da kullanılmaktadır (Telli Okur, 2003; Okkay, 2007). Yenilenebilir kaynaklardan etanol üretim prosesinin, atmosfere karbondioksit emisyonunun düşük olması nedeniyle, etanol çevreye karşı yararlı bir enerji kaynakdır (Saha, 2003). Etanol çözücü olarak ve bazı kimyasalların üretiminde ara hammadde olarak kullanılmaktadır. Ayrıca ilaç, plastik, vernik, cila, parfüm, kozmetik ve plasikleştirici üretiminde önemli bir hammaddedir. Motor yakıtlarına oktan sayısını
15
yükseltmek amacıyla belirli oranlarda (%2-3) katılır ve antifriz olarak da kullanılır (Telli Okur, 2003).
Lignoselülozik materyallerin kaynağına bağlı olarak hidroliz sonunda oluşan hidrolizat; ksiloz, arabinoz, glukoz, galaktoz, arabinoz, mannoz, fruktoz ve ramnozdan oluşur. Geleneksel Saccharomyces cerevisiae ve Zymomonas mobilis glukozu çabuk ve etkili şekilde etanole fermente edebilmelerine rağmen, ksiloz ve arabinoz gibi diğer şekerleri etanole fermente edemezler. Pachysolen tannophilus, Pichia stipitis ve
Candida shehate mayaları ksilozu etanole fermente edebilme yeteneğine sahiptir.
Kullanılan mikroorganizmaların düşük etanol toleransı olması, fermantasyon hızının düşük olması, lignoselülozik materyallerin hidrolizasyonu ve ön işlemi sırasında üretilen inhibitörler ticari olarak ksilozdan etanol üretimini sınırlanmaktadır (Saha, 2003).
Hemiselülozun parçalanma ürünlerinin bir diğer kullanım alanı da ferulik asit üretimidir. Ferulik asit sağlık, gıda ve kozmetik alanında büyük ilgi görmektedir. Ferulik asit gıda endüstrisinde koruyucu katkı maddesi, jel oluşturma ve lezzet verici olarak, sağlık açısından antioksidan, antimikrobiyal ve anti-inflamatuvar olarak ve kozmetik sanayinde de koruyucu ajan olarak kullanılmaktadır. Ayrıca ferulik asit vanilya üretiminde de kullanılmaktadır (Saha., 2003; Bostancı, 2009; Sapcı, 2012).
Laktik asit; her insanın vücudunda oluşan doğal organik bir bileşiktir. Laktik asit gıda, ilaç ve kozmetik endüstrisinde kullanılır. Geçmişte, çoğunlukla sütten üretilen laktik asitin, günümüzde mikrobiyal fermantasyonla üretimi tercih edilmektedir. Lignoselülozik maddeler bol, ucuz ve yenilenebilir olduklarından dolayı laktik asit üretimi için ideal bir kaynaktır (Saha., 2003; Bostancı, 2009). Laktik asit ekşi tatta, kokusuz bir maddedir. Su, alkol ve eterle kolaylıkla karışabilir. Kloroformda çözünmez. İyi bir çözücüdür, zayıf asittir ve kolaylıkla polimerleşir. Laktik asitin bir polimeri olan polilaktik asit aynı zamanda petrol esaslı plastik yerine de kullanılabilme potansiyeline sahiptir. Gıdalarda koruyucu olarak kullanılan laktik asidin etkisi genelde ortamın pH derecesini düşürmeye bağlı olarak gelişir. Laktik asit en fazla turşu, salamura, sebze ve zeytin ürünlerinde kullanılır (Yüksekdağ ve Beyatlı, 2003; Çoşkun, 2006).
Lactobacillus gibi laktik asit bakterileri doğal olarak laktik asit üretebilir. Laktik asit
bazı bakteriler tarafından üretilebileceği gibi, bazı mayalar tarafından da üretilebilmektedir (Saito ve ark., 2012). Mayalar tarafından laktik asit üretimi son
16
zamanlarda daha fazla ilgi görmeye başlamıştır; çünkü mayalar düşük pH’lara karşı daha dirençlidir. Bitkisel biyokütleden elde edilen substratlar ksiloz yanında glukoz gibi başka şekerler de içerir. Rhizopus oryzae gibi mayalar glukozdan L(+) laktik asit ürettiği gibi, ksilozdan da laktik asit üretebilme yeteğine sahiptir (Saito ve ark., 2012). Çeşitli araştırmalarda buğday sapı, mısır koçanı, kağıt atığı gibi lignoselülozik materyallerden laktik asit üretilebileceği görülmüştür (Saito ve ark., 2012).
Ksilandan elde edilen, ksilozun dehidrasyonu sonucu üretilen ürünlerden biri de furfuraldır. Ksilan asit katalizörü eşliğinde ksiloza dönüştürülürken, ortamdaki sıcaklık ve asitin etkisiyle oluşan ksiloz, furfural gibi dehidrasyon ürünlerine dönüşür. Tarımsal atıklardan %15–23 verimle furfural elde edilebilmektedir (Tozoğlu ve ark., 2009). Furfuralın sayısız ardışık bileşiklerinden biri de furfural alkol olup, hidrojenasyon yoluyla elde edilmektedir. Bu ürünler ise değişik viskozitelere sahip sıvılar olup, direnç özellikleri arttırılmış plastiklerin üretiminde kullanılmaktadır. Bunun dışında furfuraldan poliüretan, naylon 6,6 furan ve tetra hidrofuran (THF) elde edilebilir. Tetra hidrofuran özellikle polivinil klorit (PVC) için değerli bir solvent olup, çeşitli furan bileşiklerinin üretiminde tercih edilmektedir. Tetrahidrafurfuril alkol ve dihidropiran ise polyester ve poliamid üretiminde baslangıç materyali olarak kullanılmaktadır (Tozoğlu ve ark., 2009).
Hemiselülozun parçalanma ürünlerinin diğer kullanım alanı da ksilitol üretimidir. Ksilitol son yıllarda büyük önem kazanmış doğal bir tatlandırıcı ve fonksiyonel bir gıda bileşenidir (Saha, 2003). Üretim yöntemi ne olursa olsun, ksilitol üretimi; bu tezin de konusunu oluşturan ksilandan ksiloz üretimi ile başlar. Bu konu ksiloz ve ksilitol bölümünde daha detaylı bir şekilde açıklanmıştır.
2.6. Ksiloz ve Ksilitol
Bir pentoz şekeri olan ksiloz, serbest halde ise kiraz şeftali, armut ve erik gibi meyvelerin yapısında bulunur (Saldamlı, 2007). Bitki dokularında genelikle ksilanın bileşiminde bulunur ve ksilanın hidrolizasyonu ile üretilir (Ergun ve Gündüz, 1999). Ksilan bakımından zengin atıkların hidrolizasyonunda, ksilozun yanında hammaddenin yapısında doğal olarak bulunan glukoz, asetik asit ve hidrolizasyonun daha ileri gitmesi sonucu, furfural gibi bileşikler oluşabilir. Hidrolizasyon sırasında üretilen ksiloz miktarı
17
hammadde türüne, sıcaklık, asit konsantrasyonuna ve hidrolizasyon süresine bağlı olarak değişebilir. Hidrolizasyon sırasındaki asit konsantrasyonu şeker ürünleri üzerinde önemli bir parametre iken; sıcaklık şeker bileşimi ve şeker parçalanma ürünleri üzerinde çok etkili olmaktadır. Elde edilen ksiloz daha sonra kimyasal ve biyoteknolojik prosesler ile ksilitol, laktik asit ya da etanol gibi değişik bileşikler üretmek için kullanılan önemli bir şekerdir (Roberto ve ark., 2003; Rafiqual ve Mimi Sakinah., 2012a).
Ksilozum esas kullanım alanı ksilitoldür. Ksilitol, doğada meyve ve sebzelerin yapısında bulunan beş karbonlu bir şeker alkolü olup meyvelerde, sebzelerde, deniz yosunu, mantar ve mayalarda bulunur ve doğal olarak bu kaynaklardan elde edilebilir; ancak bu işlemin pahalı olması ve elde edilen ksilitol miktarının az olması, başka yöntemlere yönelmeye teşvik etmiştir (Pepper ve Olinger, 1988; Artık ve ark., 1993; Saha., 2003; Akpınar ve ark., 2010a; Deutschmann ve ark., 2012; Rafiqual ve Mimi Sakinah, 2012b). Genellikle ksilitol, D-ksiloz ünitelerinden oluşmuş bir polisakkarit olan ksilanın, ksiloza hidrolizasyonu ve takiben ksilozun katalitik hidrojenizasyonuna dayanan bir prosesle üretilir (Artık ve ark., 1993; Hasyierah ve ark., 2008).
Ksiloz elde edildikten sonra kimyasal ve biyokimyasal olarak ksilitol üretilebilir. Kimyasal olarak ksilitol üretimi ksilozun katalitik indirgenmesi ile olur (Artık ve ark., 1993; Saraçoğlu ve Çavuşoğlu, 1999). Kimyasal işlemin olumsuz tarafları yüksek basınç ve yüksek sıcaklık uygulanması ile pahalı katalizör (Raney-Nikel) kullanılmasıdır. Bunun yanı sıra hemiselüloz hidrolizi sonucu elde edilen yan ürünlerin birkaç işlemle uzaklaştırılması gerekir ve bu işlem pahalıdır. Kimyasal yöntemle üretiminde yaşanan problemler nedeni ile ksilitolun fermentasyon yoluyla üretimi daha çok ilgi görmeye başlamıştır. Biyoteknolojik yöntemlerin maliyeti diğer yöntemlere göre daha düşüktür, aynı zamanda güvenilir ve çevre kirliliğine neden olmayan bir yöntemdir (Hasyierah ve ark., 2008; Uysal, 2011; Sabancı, 2012; Sapcı, 2012).
Ksilitolün viskositesi, molekül ağırlığı diğer şeker alkollerinden daha düşüktür ve viskozitesi sıcaklık arttıkça azalmaktadır. Yoğunluğu, aynı konsantrasyondaki sakkaroz ve sorbitole oranla daha düşüktür. Kalori değeri 4,06 kcal/g’dır. Ksilitol aldo ve keto gruplarını içermediğinden Maillard tipi esmerleşme reaksiyonlarına katılmamaktadır (Artık ve ark., 1993).
18
Ksilitol diyabetikler için uygun bir tatlandırıcıdır; çünkü insülinden bağımsız olarak, karaciğerde metabolize olur (Branco ve ark., 2011) ve ani kan şekeri yükselmesine sebep olmaz. Ksilitol sindirim sistemi tarafından tamamen emilememesi ve enerjisinin düşük olması nedeniyle obezite riskini azaltır. Tatlılık derecesi sukroza benzer ve diğer şeker alkollerinden (sorbitol, arabitol, manitol) daha yüksektir. Bu sebeple birçok gıda ürününde tatlandırıcı olarak kullanılmaktadır (Artık ve ark.,1993; Branco ve ark.,2011; Rafiqual ve Mimi Sakinah, 2012a). Bazı ülkelerde de diyabet ürünleri bileşiminde kullanılır (Saha., 2003; Bostancı ., 2009; Deutschmann ve ark., 2012).
Birçok mikroorganizmanın ksilitolü kullanma özelliği yoktur. Ağız mikroflorası tarafından fermantasyona uğratılamaz; ksilitol bu özelliğinden dolayı ağız sağlığı açısından büyük önem taşır aynı zamanda ağızda plak oluşumunu azaltığından dolayı şekerlemelerde, sakızlarda, alkolsüz içeceklerde, çeşitli ilaçlarda, pastillerde sukroz yerine ksilitol kullanılabilir (Artık ve ark.,1993; Saha, 2003; Uysal, 2011; Sapcı, 2012; Deutschmann ve ark., 2012). Ksilitol vücut ısısında çözünebilir, ağızda hoş bir serinlik ve tat bırakır. Ayrıca orta kulak iltihaplarını önleyici yözelliklerinin olması, şurup, tonik ve vitamin bileşimlerinde tatlandırıcı olarak kullanılabildikleri için ilaç sanayisinde kullanılmaktadır (Akpınar ve ark., 2011; Branco ve ark., 2011; Uysal, 2011; Rafiqual ve Mimi Sakinah, 2012a; Sapcı, 2012).
2.6.1. Ksilozun elde edilme yöntemleri
Lignoselülozik kaynaklardan ksiloz üretimi için farklı yöntemler mevcuttur. Bunlar arasında en yaygın kullanılan yöntem seyreltik asit hidrolizasyonudur; ancak yöntemin spesifik olmaması, hidrolizasyon sonucu ek işlemler gerektirmesi ve korozif kimyasallare ihtiyaç duymasından dolayı enzimatik olarak ksiloz üretimide son yıllarda araştırılmaktadır.
19 Asit Hidrolizi
Ksiloz üretiminde ekonomik olması, kolay olması, hızlı ve etkili bir yöntem olmasından dolayı lignoselülozik materyallerin seyreltik asit hidrolizi yaygın olarak kullanılmaktadır. Asit hidrolizi konsantre asit/düşük sıcaklık ya da seyreltik asit/yüksek sıcaklık şeklinde kullanılan bir yöntemdir (Saha., 2003; Girio ve ark., 2010). Asit hidrolizinde yaygın olarak kullanılan asitler HCl, H2SO4 ve TFA gibi mineral asitleridir. Bu asitler arasında yaygın olarak kullanılan H2SO4’dür; çünkü hidrolizasyonun sonunda nötralizasyon sonucunda ürünlerin kolay uzaklaştırılmasından dolayı tercih edilmektedir (Girio ve ark., 2010).
Seyreltik asitle lignoselülozik materyallerin hidrolizasyonu yüksek sıcaklık (160 ºC’den büyük) /düşük konsantrasyon (%5-10,w/w) düşük sıcaklık (160 ºC’den küçük)/ yüksek konsantrasyon (%10-40,w/w) olmak üzere iki şekilde yapılabilir. Yüksek sıcaklıkta seyreltik asit uygulamaları genellikle hemiselülozun amorf ve dallanmış yapısından dolayı kolaylıkla ksiloz, arabinoz gibi suda çözünebilir şekerleri hidroliz eder iken; selüloz ve lignin aynı koşullarda hidrolize olmaz ve katı kısımda çoğunluğu lignin olacak şekilde selüloz ve lignin kalır. Düşük sıcaklıkta konsantre asit uygulamasında hem hemiselüloz hem de selüloz hidroliz edilebilir. Bu nedenle ksiloz üretiminde yüksek sıcaklıkta seyreltik asit uygulaması kullanılmaktadır (Saha., 2003; Girio ve ark., 2010).
Asit hidrolizasyon işlemi, lignoselülozik materyallerin asit hidrolizi sırasında bünyesinde bulunan polisakkaritlerin yapısındaki diğer şekerlerinde hidrolize olmasına neden olması, asitin korozif etkisi, hidrolizasyon sonucu istenmeyen atıkların ve nötralizasyon ürünlerininin oluşumuna neden olması gibi bazı dezavantajlara sahiptir (Saha., 2003; Bostancı., 2009; Girio ve ark., 2010). Ayrıca seçici bir yöntem olmadığından, elde edilen hidrolizatta, ksilozun yanında lignoselülozik biyokütlenin yapısında doğal olarak bulunan diğer şekerler (glukoz veya arabinoz gibi) ortaya çıkmaktadır. Özellikle ortamda glukozun fazla miktarda bulunması, ksilozun mikrobiyal fermantasyonunda rol oynayan bazı mayaları olumsuz etkilemektedir (Parajó ve ark., 1998). Lignoselülozik materyallerin hidrolizasyonu esnasında; ksiloz parçalanma ürünü olarak açığa çıkan furfural, heksoz parçalanma ürünü olan 5-hidroksi metil furfural ve bunun bozunma ürünü olan levülinik asit ve formik asitin de mayalar üzerine toksik
20
etkisi bulunmaktadır. Ligninin parçalanması ile oluşan fenolik bileşiklerin ve hemiselülozun yapısından kaynaklanan ve hidrolizasyon esnasında açığa çıkan asetik asitin de, fermantasyon mayaları üzerine olumsuz etkisi bulunur. Fenolik bileşenler hem hücre büyümesini hemde şeker kullanımını düşürür. Asetik asit de, ortam pH’sını düşürerek, fermantasyon mikroorganizmaları üzerine olumsuz etki yaratmasının yanı sıra formik asit ve levulinik asit gibi asitlerle beraber toksik etki yaratır (Parajo ve ark., 1998; Arslan, 2007). Şekil 2.5’de lignoselülozik maddenin asit hidrolizinde oluşan bileşenler gösterilmiştir (Arslan, 2007). Yukarda belirtlilen nedenlerden dolayı ksiloz üretimi için daha seçici üretim yöntemleri her zaman araştırılmaktadır.
Şekil 2.5. Lignoselülozik materyallerden asit hidrolizi ile oluşan bileşenler (Arslan, 2007).
Literatürde; Sun ve ark., (2002) ile Akpınar ve ark., (2011a) pamuk sapından 140°C’de %6’lık H2SO4 konsantrasyonunda 15 dakika hidrolizinden, Akpınar ve ark.
21
(2011b) ayçiçeği ve tütün saplarından sırasıyla 120°C’de 30 dk %4 H2SO4 ve133°C’de 27 dk %4,9 H2SO4 ile ksiloz üretmişlerdir. Tellez- Luis ve ark. (2002) 122 ºC’de 3 farklı H2SO4 konsantrasyonunda (%2, 4, 6) sorghum sapından, Rafiqual ve Mimi Sakinah (2012b) meranti ağacı talaşının 125°C’de, 60 dk, %4 H2SO4 ile hidrolizinden 17,9 g/l ksiloz, Canettieri ve ark.(2007) okaliptus ağacından, 157°C’de 20 dk %0,65 H2SO4 ile hidrolizinden 1,65 g/l glukoz, 13,65 g/l ksiloz, 1,55 g/l arabinoz, 3,10 g/l asetik asit elde edilmiştir.
Enzimatik Hidroliz
Ksilan, asitle hidroliz edildiği gibi, enzimle de hidroliz edilebilir. Ksilanın enzimatik hidrolizi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığı zaman daha spesifiktir. Hidrolizasyon daha ılımlı koşullarda gerçekleşir. Enzimatik hidrolizde, korozif kimyasallara ihtiyaç duyulmaması, asit hidrolizi gibi işlem sonunda nötralizasyon gerektirmemesi, zararlı yan ürünler ya da atıkların da oluşmamasından dolayı enzimatik hidroliz, asit hidrolizine tercih edilmektedir. Enzimatik hidrolizde enerji ihtiyacı düşüktür (Bostancı, 2009; Otieno ve Ahring, 2012).
Lignoselülozik biyokütlede ksilan genellikle ksilan-lignin kompleksi şeklinde bulunduğundan hidrolizasyona karşı dirençlidir; bu nedenle ilk önce ksilanın lignoselülozik biyokütleden izole edilmesi ve bunu takiben ksilanın enzimatik hidrolizinin gerçekleştirilmesi geekmektedir (Vazquez ve ark., 2000; Moure ve ark., 2006; Erdoğan ve Akpınar, 2008). Lignoselülozik materyallerden ksilanın izolasyonunda, NaOH, KOH, Ca(OH)2, NH3 ve H2O2 ya da bu bileşiklerin karışımından oluşan alkaliler kullanılabilir (Pellerin ve ark., 1991; Zilliox ve Debeire, 1998; Sun ve ark., 2002; Yoon ve ark., 2006). Ksilan polimerlerin pH stabilitesinden dolayı, lignoselülozik materyallerden ksilanın alkali ile izolasyonu sıkça tercih edilen bir yöntemdir (Vazquez ve ark., 2000); ancak bu işlem nötralizasyon işlemi gerektirmekte ve bu şekilde maliyetleri daha artırmakta, hem de çevre açısından alkali kirliliğine yol açmaktadır (Günay, 2010).
Ksilan izolasyonunda kullanılan bir diğer yöntem de otohidrolizdir. Otohidroliz yönteminde biyokütlenin yüksek sıcaklıklarda (130ºC–230ºC) su eşliğinde muamelesi, suyu oto iyonize ederek ksilanın parçalanmasına ve ksilanın deasetilasyonuna (asetik
22
asit üretimi ile ortamdaki hidronyum iyonunun artmasına) neden olur (Vegas ve ark., 2006). Otohidroliz yöntemi ile ksilan hidrolizinde geniş polimerizasyon derecesi aralığında ksilan ve ksilan parçalanma ürünleri (ksilooligosakkaritler) oluşur. İşlem sonunda elde edilen ürünlerin 1/4 kadarı molekül ağırlığı çok küçük moleküller (monosakkarit), geri kalan kısmı ise büyük polimerizasyon dereceli oligomerlerdir (Günay, 2010). Üretilen ksilan parçalanma ürünlerinin polimerizasyon dereceleri oldukça büyük olduğundan (polimerizasyon derecesi>10); ksilanın yüksek sıcaklıklarda suyla özütlenmesi veya buharla özütlenmesi ya da otohidroliz yöntemi olarak da bilinir (Garrote ve ark., 2002; Moure ve ark., 2006). Yapılan çalışmalarda bu yöntemle, lignoselülozik materyallerdeki hemiselülozun %55-85 düzeyinde çözünür hale getirildiği, selüloz ve lignini önemli ölçüde etkilemediği görülmüştür (Garrotte ve ark., 2002; Girio ve ark., 2010). Otohidroliz işlemi sonunda; düşük düzeyde fermantasyon inhibitörü içeren hemiselüloz hidrolizatı ile selüloz ve lignince zengin katı kısım elde edilir (Girio ve ark., 2010) ve oluşan hemiselüloz hidrolizatı da ksilanazlar için uygun bir substrat olarak hizmet edebilir.
2.7. Ksilanazlar
Ksilanın enzimatik hidrolizasyonu ksilanazlar tarafından gerçekleştirilir. Ksilan çok karmaşık bir moleküldür. Bu nedenle ksilanın hidrolizi için farklı enzimlere ihtiyaç duyulur. Ksilan molekülünün hidrolizini gerçekleştiren enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi denir (Grio ve ark., 2010). Şekil. 2.6’da bu enzimlerin etki mekanizmaları gösterilmiştir. Endo 1,4-β-D ksilanazlar (1,4-β-D ksilanksilanohidrolazlar, EC 3.2.1.8), ksilan ana zincirinin hidrolizinden sorumlu enzimlerdir ve ksilan zincirini rastgele hidrolize ederler. β-D ksilozidazlar (1,4- β-D ksilanksilohidrolazlar) kısa zincirli ksiloz-oligosakkarit zincirlerini hidrolize ederler. α-L-arabinofuranozidaz (EC 3.2.1.55) ksilan yapıda bulunan α-L-araninofuranozil ucunu hidrolize eder. α-D-glukuronizidaz ( EC 3.2.1.139) ksiloz ile D-glikoronik asit veya 4-O-metileter arasındaki α -1,2-glukozidik bağlarını hidrolize eder. Ksilanlar karbonhidrat yapısındaki substituentlerinin yanı sıra kumarik asit, ferulik asit ve asetik asit gibi substituente sahiptirler. p-Kumarik asit esteraz (EC 3.1.1.1) ksilanlardaki p-kumarik ester bağlarını hidrolize eder (Collins ve ark., 2005; Polizeli ve ark., 2005; Dobrev ve
23
Zhekova, 2011). Ferulik asit esteraz (EC 3.1.1.72) ferulik asidi ksiloza bağlayan ester bağını hidrolize eder. Asetil esterazlar (EC 3.1.1.72), D-ksiloz zincirinin ikinci ve üçüncü poziyonundaki oksijenlerine bağlı bulunan asetil ester gruplarını yapıdan uzaklaştırarak, ksilan ana zincirinin parçalanmasına katkıda bulunur. Arabinofuranozidazların da asetil esterazlar gibi ana zinciri parçalamaya yönelik enzimlerle uyumlu çalıştıkları belirtilmiştir (Collins ve ark., 2005; Polizeli ve ark., 2005; Akel, 2009; Dobrev ve Zhekova, 2011).
Şekil 2.6. Ksilanazların ksilan iskeletindeki rolleri (Erdoğan ve Akpınar, 2008).
Ksilanaz enzimi asıl olarak mikroorganizmalardan ve hücre duvarının bozulan kısımından, bazı tohumların filizlenmesi esnasında üretilir. Ksilanazlar deniz alglerinde, protoza, kabuklu böcekler, salyangoz ve kara bitkilerinin tohumlarında bulunabilir (Polizeli ve ark., 2005). Son yıllarda, doğal kaynakları koruma ve çevresel sorunları önleme ayrıca ticari açıdan uygun olması nedeniyle mikroorganizmalar tarafından ksilanaz üretimine olan ilgi giderek artmaktadır (Dobrev ve Zhekova, 2011).
