T.C
DÜZCE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ KULAK BURUN BOĞAZ HASTALIKLARI
ANABİLİM DALI
RATLARDA MİRİNGOTOMİ SONRASI OLUŞAN
MİRİNGOSKLEROZ GELİŞİM SÜRECİNE OMEGA-3 YAĞ
ASİTLERİNİN ETKİSİ
TIPTA UZMANLIK TEZİ
Dr. Mehmet MEMİŞ
T.C
DÜZCE ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ KULAK BURUN BOĞAZ HASTALIKLARI
ANABİLİM DALI
RATLARDA MİRİNGOTOMİ SONRASI OLUŞAN
MİRİNGOSKLEROZ GELİŞİM SÜRECİNE OMEGA-3 YAĞ
ASİTLERİNİN ETKİSİ
TIPTA UZMANLIK TEZİ
Dr. Mehmet MEMİŞ
DANIŞMAN: Prof. Dr. Ender GÜÇLÜ
i ÖNSÖZ
Tıpta uzmanlık eğitimimde bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen, bize ilham kaynağı olan kıymetli hocalarım Prof. Dr. Ender Güçlü’ye, Doç. Dr. Hüseyin Yaman’a, Doç. Dr. Süleyman Yılmaz’a, Yrd. Doç. Dr. İlhan Ünlü’ye teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmamın histopatolojik değerlendirmesini yapan Yrd. Doç. Dr. Murat Oktay ve istatistiksel analizinde desteklerini esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Mehmet Ali Sungur’a teşekkürlerimi sunarım.
Birlikte görev yaptığımız araştırma görevlisi arkadaşlarım, odyometri teknisyenleri, ameliyathane ve servis hemşireleri ve personel arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım.
Meşakkatli eğitim hayatım boyunca beni biran olsun yalnız bırakmayan aileme, sabır ve özverisi ile maddi ve manevi hep destekçim olan çok değerli eşime sonsuz teşekkürlerimi sunarım.
ii ÖZET
Miringoskleroz timpanik membranın lamina propriasında meydana gelen kollajen yapının hiyalin dejenerasyonu ve kalsifikasyonu sonucu oluşan bir patolojidir. Timpanik membran hasarı sonrasında, efüzyonlu otitis media tedavisinde yapılan miringotomi sonrası ve ventilasyon tüpü uygulamaları sonrasında görülür. Timpanik membran hasarı oluşturularak deneysel miringoskleroz oluşumunu
inceleyen pek çok çalışma mevcuttur. Bu çalışmalarda miringoskleroz gelişimi farklı yönleriyle ortaya konmuştur. Miringotomi sonrasında oluşan inflamasyon, artan oksijen konsantrasyonuna bağlı oluşan serbest oksijen radikalleri fibrozis ve kalsifikasyon ile seyreden miringoskleroz gelişimine neden olur. Miringoskleroz gelişimini önlemek için pek çok antioksidan, antiinflamatuar ve antifibrotik ajan ile çalışmalar yapılmıştır.
Omega-3 yağ asitlerinin antioksidan, antiinflamatuar ve antifibrotik etkileri yapılan çok sayıda çalışma ile kanıtlanmış olmasına rağmen timpanik membran perforasyonlarının iyileşmesi ya da miringoskleroz gelişimi ile ilgili literatürde çalışmaya rastlanmadı.
Çalışmamızda omega-3 yağ asitlerinin miringoskleroz gelişimi üzerine etkileri araştırıldı. Çalışmamızda 24 adet Wistar-Albino rat kullanıldı. Standart miringotomi yapıldıktan sonra ratlar rastgele her grupta 6 rat olacak şekilde 4 gruba ayrıldı. Birinci gruba tedavi verilmedi. İkinci gruba miringotomi sonrası topikal serum fizyolojik, 3. gruba topikal omega-3 ve 4. gruba da orogastrik gavaj yoluyla sistemik omega-3 verilmiştir.
On dört günlük iyileşme süresi sonrasında ratlar sakrifiye edildi. Otomikroskopik muayene yapılmasının ardından ratların timpanik membranları histopatolojik inceleme yapılmak üzere çıkartıldı. Histopatolojik olarak timpanik membran kalınlığı ölçüldü, inflamasyon ve miringoskleroz skorlaması yapıldı.
Çalışma sonucunda kontrol grubu ile topikal omega-3 uygulanan grup arasında ve kontrol grubu ile oral omega-3 uygulanan grup arasında timpanik membran kalınlıkları açısından anlamlı fark görülse de inflamasyon skoru ve miringoskleroz açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmedi. Omega-3
iii
yağ asitlerinin miringotomi sonrası oluşan mirinoskleroz gelişimini önleyici bir etkisi görülmedi.
Anahtar kelimeler: Antioksidan, miringoskleroz, miringotomi, omega-3, timpanik
iv SUMMARY
Myringosclerosis is defined as hyaline degeneration and calcification of collagen fibers pathologically located in lamina propria of tympanic membrane. It may be observed after tympanic membrane injury, myringotomy for the treatment of otitis media with effusion or ventilation tube insertions. There are many studies about experimental myringosclerosis after performing tympanic membrane injury. In these studies, development of myringosclerosis is evaluated in different aspects. Inflammation after myringotomy operation and the development of free oxygen radicals by way of increasing oxygen concentration and calcification result in myringosclerosis. In order to prevent myringosclerosis a lot of antioxidant, anti-inflammatory and antifibrotic agents have been studied.
Omega-3 fatty acids are well known antioxidant, anti-inflammatory and antifibrotic agents. These effects are proved in so many studies but our knowledge it has never been studied in tympanic membrane perforations and development of myringosclerosis.
In our study, the effects of omega-3 fatty acids on myringosclerosis development were investigated. 24 Wistar-Albino rats were used. After performing standard myringotomies, rats were randomly divided into 4 groups consisting of 6 rats in each. First group received no treatment. Second group was subjected to topical saline. Third group was subjected to topical omega-3 and the fourth group was subjected to systemic omega- 3 by way of orogastric lavage.
Rats were sacrified after treatment of 14 days. After audiomicroscopic examination, the tympanic membranes of rats were excised for histopathological examination. Thickness of tympanic membranes, inflammation and myringosclerosis scores were recorded.
At the end of the study, a statistically significant difference between control group and topical omega-3 group was noted in the tympanic membrane thicknesses. There was also a statistically significant difference between control group and systemic omega-3 group in the tympanic membrane thicknesses. But
v
there was no statistical relation between inflammation scores and myringosclerosis of the groups.
In our study, we could not find any protective effect of omega-3 fatty acids on myringosclerosis development after myringotomy.
Keywords: Antioxidant, myringosclerosis, myringotomy, omega-3 fatty acid,
vi SİMGE VE KISALTMALAR
AA Araşidonik Asit
AİBÜ Abant İzzet Baysal Üniversitesi CAPE Kafeik Asit Fenetil Esterin cGMP Siklik Guanil Monofosfat DHA Dokosaheksaenoik Asit EPA Eikosapentaenoik Asit GBE Ginkgo Biloba Ekstresi IL-1 İnterlökin 1
NO Nitrik Oksit
NOS Nitrik Oksit Sentaz PF Pars Flaksida PKG Protein Kinaz G PT Pars Tensa
PUFA Çoklu Doymamış Yağ Asidi SOD Süperoksit Dismutaz
SOR Serbest Oksijen Radikali
TGF-β Transforming Growth Faktör Beta TM Timpanik Membran
TNF Tümör Nekrozis Faktör
VLDL Çok Düşük Dansiteli Lipoprotein ω- 3 Omega-3
vii RESİMLER VE ŞEKİLLER
Şekil 1: Rat ve insan timpanik membranının şematik karşılaştırılması Şekil 2: Omega-3 yağ asitlerinin kimyasal yapısı
Şekil 3: Omega-3 yağ asitlerinin fibrozis önleyici mekanizması
Şekil 4: Miringosklerotik lezyonların otomikroskopik bakı altında şematik skalası
Resim 1: Rat timpanik membranının medial yüzü
Resim 2: Otomikroskopik bakı ile miringotomi yapılmış rat timpanik membranı Resim 3: Hazırlanan timpanik membranın medial yüzden görünümü
Resim 4: Miringotomi grubuna ait bir kesit. Kalın kollajen lifler içeren kalınlığı,
artmış timpanik membran dokusu. (HEx200)
Resim 5: Miringotomi+ Topikal ω-3 grubuna ait kesit. Timpanik membran kalınlığı
azalmış ve fibrozis izlenmemekte. (HEx200)
Resim 6: Miringotomi+ SF grubuna ait kesit. Kalın kollajen fibriller içeren kalın bir
timpanik membran
Resim 7: Miringotomi grubuna ait kesit. Yoğun inflamasyon ve ödem görülen
viii TABLOLAR
Tablo 1: Patolojik stres sonrası fibrozis oluşum şeması
Tablo 2: Otomikroskopik olarak değerlendirilmiş miringoskleroz bulguları
Tablo 3: Gruplandırılmış otomikroskopik miringoskleroz bulguları Tablo 4: Histopatolojik sonuçların tamamının dökümü
Tablo 5: Grupların ölçülen ortalama kalınlıkları ve standart sapmaları Tablo 6: Gruplardaki lamina propriadaki inflamasyon düzeyinin dağılımı
Tablo 7: Histopatolojik miringoskleroz bulguları
ix İÇİNDEKİLER Sayfalar ÖNSÖZ……….……..……... i TÜRKÇE ÖZET………... ii İNGİLİZCE ÖZET………... iv SİMGELER VE KISALTMALAR………...………... RESİMLER VE ŞEKİLLER……… TABLOLAR ……… vi vii vii İÇİNDEKİLER………...………... ix 1. GİRİŞ VE AMAÇ……….. 1 2. GENEL BİLGİLER………... 2
2.1. Timpanik Membranın Yapısı………... 2
2.1.1. Anatomik yapı………... 2
2.1.2. Histolojik yapı………...………. 4
2.2. Timpanik Membranda Yara İyileşmesi ve Miringoskleroz Oluşumu………... 4
2.3. Hücresel Düzeyde Oksidatif Stres ve Fibrozis Oluşum Mekanizması……… 6
2.4. Omega-3 Yağ Asidi………. 7
2.5. Omega-3 Yağ Asidinin Fibrozis Önleyici Özelliği…...…... 8
3. GEREÇ ve YÖNTEM …...……….………. 10 3.1. Miringotomi……….………. 11 3.2. Çalışma Grupları ………...……... 12 3.3. Histolojik İnceleme ……….. 14 3.4. İstatistiksel Analiz…………...……….. 17 4. BULGULAR……...………. 17 4.1. Otomikroskopik Değerlendirme………... 17 4.2. Histopatolojik Değerlendirme…………..………. 20
x
4.2.2. Lamina propriadaki inflamasyon düzeyi ….………. 21 4.2.3. Miringoskleroz ………...………... 5. TARTIŞMA………. 6. SONUÇ ………... 23 24 31 7. KAYNAKLAR……… 32 8. EKLER………. 39
1 1. GİRİŞ VE AMAÇ
Miringoskleroz timpanosklerozun en sık görülen şekli olup timpanik membranın (TM) lamina propriasındaki kollajen yapının hiyalin dejenerasyonu ve kalsifikasyonu sonucu meydana gelmektedir (1-7). Genellikle efüzyonlu otitis media tedavisinde uygulanan miringotomi ve ventilasyon tüpü uygulaması sonrası ortaya çıkar. Travmatik ya da otitis mediaya bağlı timpanik membran perforasyonları ve çeşitli kimyasal ajanlara bağlı da oluşabilmektedir. Miringoskleroz genellikle asemptomatik olsa da büyük boyutlara ulaşan sklerotik plaklar işitme kayıplarına neden olabilir (2,5,8).
Miringoskleroz etyopatolojisi kesin olarak ortaya koyulamamış olsa da son yıllarda üzerinde en çok durulan etken aşırı inflamatuar reaksiyon sonucu oluşan kollajen doku hasarıdır (3,4). Timpanik membranda artmış inflamatuar reaksiyonun nedeni ise orta kulaktaki artmış oksijen konsantrasyonuna bağlı olarak oluşan serbest oksijen radikalleridir (SOR). Sağlıklı insan ve hayvanlarda %5-10 arasında olan orta kulak oksijen konsantrasyonu, timpanik membran perforasyonlarında ya da tedavi amacıyla yapılan miringotomi ve ventilasyon tüpü uygulamaları sonrasında artarak atmosferdeki oksijen konsantrasyonuna ulaşmaktadır (3,4,8-15).
Miringosklerozu önlemede asıl hedef inflamasyonu azaltmak, inflamatuar sürece bağlı olarak oluşan SOR miktarını azaltmaktır. Bu maksatla selenyum, N-asetil sistein, L-karnitin, askorbik asit, E vitamini, gingko biloba, N-nitro L-arjinin metil ester, deksametazon gibi çeşitli antioksidan ve antiinflamatuarlar deneysel olarak kullanılmış ve etkinliği gösterilmiştir (5,11,12,16,17).
Akut otitis media ve efüzyonlu otitis media sonrası oluşmuş perforasyon sonucu orta kulakta artan oksijen konsantrasyonu ya da Streptococcus pneumoniae enfeksiyonunda üretilen hidrojen peroksit nedeniyle SOR oluşumu artar. Yine bağ dokusunda artan makrofajlardan da SOR salınımı olur. Süperoksitler ve nitrik oksit (NO) birleşmesiyle oluşan peroksinitritler hücresel hasardan sorumlu olan serbest radikaldir (2).
Eikosapentaenoik asit ve dokosaheksaenoik asit omega-3 yağ asitleridir. Antiinflamatuar etkileri ile inflamasyonu azaltır ve SOR üretimini azaltırlar. Yine
2
antiinflamatuar etkileri ile fibrozisi azalttığı gösterilmiştir. Antioksidan etkileri ile de oksidatif stres sonucu oluşan hücresel hasarı azaltırlar (18). Yapılan çalışmalarda miringotomi sonrası 9. saatte miringoskleroz gelişmeye başladığı görülmüştür (2,19). Biz de yaptığımız çalışmada omega-3 yağ asitlerini miringotomiden hemen sonra, 12. saatte ve 24. saatte uygulayarak oksidatif stresin doku hasarını arttıcı ve miringoskleroz oluşturma etkisini baskılamayı amaçladık.
2. GENEL BİLGİLER
2. 1. Timpanik Membranın Yapısı 2. 1. 1. Anatomik yapı
Timpanik membran, skuamöz kemik tarafından oluşturulan attik ve timpanik kemik tarafından oluşturulan hipotimpanum lateral duvarı ile birlikte orta kulağın lateral sınırını oluşturmaktadır. Yetişkin bir insanda yaklaşık 8 mm genişliğinde, 10 mm yükseliğinde ve 0,1 mm kalınlığında eliptik bir koni şeklindedir. 360 derecelik koninin tabanı yaklaşık 270 derecelik bölümünde fibröz anüler ligament tarafından anüler sulkus denilen kemik yapıya sıkıca tutunmaktadır. Yukarısında ise anüler sulkus ve fibröz anulus yoktur. Timpanik membranın anüler sulkusa tutunan alt bölümüne pars tensa (PT), tutunmayan üst kısımdaki üçgen bölümüne pars flaksida (PF) ya da Sharapnel membranı denir. Pars flaksida anterior ve posterior malleolar kıvrımlar tarafından sınırlandırılır (20-22).
Timpanik membranın titreşen alt kısmını oluşturan pars tensanın orta bölümünde manubrium mallei yer almaktadır. Manubrium malleinin uç kısmı olan umbodan malleus eksenine dik çizildiğinde timpanik membran hayali olarak dört kadrana ayrılmış olur. Bunlar ön-üst, ön-alt, arka-üst ve arka-alt kadranlardır (21-22). Rat ve insan timpanik membranın anatomik özellikleri arasında bazı farklılıklar bulunmaktadır (23, Şekil 1):
1. Ratlarda pars flaksida pars tensanın %25-29’u kadarken, insanda bu oran %2-3’tür.
3
2. Ratlarda malleus kısa kolu posteriora doğru uzanırken, insanda anteriora doğru uzanır.
3. Ratlarda manubrium mallei inferiora doğru dik uzanırken, insanda ise önden arkaya doğru uzanır.
4. Ratlarda membranın ön arka çapı 2,2-2,4 mm iken, insanda bu çap yaklaşık 9-10 mm dir.
RAT İNSAN
4
Resim 1: Rat timpanik membranının medial yüzü
2. 1. 2. Histolojik yapı
Timpanik membran histolojik olarak 3 tabakadan oluşur. Dışta dış kulak yolu ile devamlılık gösteren çok katlı yassı epitel tabakası, içte timpanik kavite mukozası ile devamlılık gösteren tek katlı yassı epitel tabakası, ortada ise fibröz dokulardan oluşan kollajen liflerinin bulunduğu lamina propria tabakası bulunmakatadır. Lamina propria tabakası PT’de gerginlik, esneklik ve dayanıklılığı arttıran dışta radiyal içte sirküler liflerden oluşan düzenli bir kollajen yapıya sahiptir. Kollajen lifler arasında fibroblastlar, endotelyal hücreler ve sinirler yer almaktadır.
PF’da bağ doku daha kalın olmasına rağmen kollajen ve elastin liflerin gevşek ve düzensiz yerleşmesinden dolayı PT’den daha dayanıksızdır (20,21,23,24).
Rat ve insan timpanik membranlarının lamina propriaları kollajen liflerinin diziliş şekli açısından büyük benzerlikler göstermektedir. Bu nedenle timpanik membran ile ilgili yapılan çalışmalarda genellikle rat tercih edilir (23,24).
5 2. 2 Timpanik Membranda Yara İyileşmesi ve Miringoskleroz Oluşumu
Timpanik membranın epitel yapısı çok güçlü proliferasyon ve migrasyon yeteneğine sahip olduğu için membranda gelişen akut perforasyonların büyük bir kısmı kendiliğinden iyileşir (25,26).
Timpanik membran perforasyonundan sonraki 2 gün içerisinde perforasyon kenarlarından dış epitel tabakasından proliferasyon başlar. Timpanik membranın epitelizasyon ve migrasyon özelliği kapanmada en önemli rolü oynamaktadır (28-30).
Wang ve ark. (31) yapmış oldukları çalışmada perforasyon sonrası epitelyal proliferasyonun ve artmış mitotik aktivitenin perforasyon kenarlarından değil de anulus ve manubrium mallei etrafından başladığını ortaya koymuştur. Timpanik membran, periferinden başlayan bu mitotik aktivite, epitelyal proliferasyon ve migrasyon sayesinde perforasyonu onarmaya çalışır (26,27,29).
Genel olarak yara iyileşme süreci inflamasyon, proliferasyon ve remodelasyon olmak üzere 3 aşamadan oluşur. Yaralanan alana önce trombositler göç eder trombüs oluşur, ardından vazokonstrüksiyon gelişir ve hemostaz sağlanır. Yara yerine ulaşan nötrofiller inflamatuar süreci başlatır. Salgıladıkları interlökin-1 (IL-1), tümör nekrotizan faktör (TNF), komplemanlar gibi sitokinler nedeniyle inflamatuar hücreler olan makrofajlar, lenfositler ve fibroblastlar yara yerine göç eder. Makrofajlar fagositoz yaparak aktif hale geçer, çeşitli sitokinler salgılayarak anjiyogenez ve fibroplaziyi başlatır. Sitokin uyarısı sonrası yara yerine gelen lenfositlerden salınan lenfokinler yara yerine fibroblast göçünü arttırır ve kollajen sentezini sağlar. Hasar sonucu oluşmuş defekti kapatmak için granulasyon dokusu oluşur. Epitelizasyon için yatak oluşturan granülasyon dokusunda fibroblastlar tarafından kollajen sentezi olur. Epitel hücreleri, fibroblastlar ve makrofajlar tarafından salgılanan kollajenaz enzimi ile kollajen bir taraftan da yıkılıp, remodelize olarak matür skar dokusu oluşumu gerçekleşir (30,32,33).
Timpanik membran peforasyonunun iyileşme sürecinde hemostaz ve inflamasyon fazları aynıdır ancak proliferasyon ve migrasyon fazları farklılıklar gösterir. Diğer dokularda önce granulasyon dokusu oluşur, ardından granulasyon
6
üzeri canlı epitel dokusu ile kapatılır. Epitelizasyon ardından remodelasyon fazı başlar ve matür skar dokusu meydana gelir. Timpanik membranda ise perforasyon ardından önce epitelizasyon başlar ve defekt kapatılır. Ardından fibrozis gelişir. Fibrotik dokunun remodelasyonu ile daha ince bir zar yapısı oluşur. Timpanik membranın sağlam kısımlarında ise inflamasyon sonrası artmış fibroblastik aktivasyon ve kollajen sentezi nedeniyle kalınlaşma görülür (30,34).
Miringoskleroz timpanik membranın yara iyileşmesinin farklı dönemlerinde ortaya çıkabilir, geri dönüşümsüzdür. Perforasyondan dokuz saat sonra miringoskleroz oluşmaya başladığını gösteren çalışmalar mevcuttur (35). Perforasyon sonrası inflamasyonun 9. saatinde kollajen tabakada yoğun makrofaj infiltrasyonu görüldüğü için miringoskleroz gelişimi ile yakından ilişkili olduğu düşünülmüştür. Makrofajlardan salınan NO, IL-1 VE Transforming Growth Faktör Beta (TGF-β) gibi medyatörler nedeniyle fibroblastik aktivite artmakta, artmış kollajen sentezi nedeniyle membranda hiyalinizasyon oluşmakta ve hiyalenize alanların kalsifikasyonu ile miringoskleroz gelişmektedir (35).
Santos ve ark. (36) miringoskleroz gelişimine neden olan inflamasyon sürecini 5 faza ayırmışlardır. Bunlar; eksudayon, granulasyon, fibrozis, hiyalenizasyon ve kalsifikasyondur. Az sayıda fibroblast ve yoğun kollojen liflerini içeren hiyalen plaklarının oluştuğu faz hiyalenizasyon fazıdır. Hiyalin plaklara kalsiyum ve fosfor depositlerinin çökmesi kalsifikasyon fazında görülür. Hiyalenizasyon ve kalsifikasyon fazları geri dönüşümsüzdür.
2. 3 Hücresel Düzeyde Oksidatif Stres ve Fibrozis Oluşum Mekanizması
Dokularda herhangi bir nedenle oluşmuş hasar sonrası oluşan inflamasyon fazında makrofajlardan ve polimorf nüveli lökositlerden salınan sitokinlerin hücresel etkileri nedeniyle serbest oksijen radikalleri (SOR) oluşmaktadır. SOR’un dokularda yaptığı toksik etkiler büyük oranda süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon peroksidaz enzim sistemleri sayesinde önlenebilir. Fizyolojik bir yara iyileşmesinde fibroblastlar, endotel hücreleri, epitel hücreleri ve diğer hücreler tam bir uyum halinde olmalıdır. Eğer bu antioksidan sistemler çalışamazsa hücreler arası uyum bozulur, yara iyileşmesi artmış fibrozis ile sonlanır (37-39). Kronik doku hasarında;
7
epitel-endotel bağlantısı bozulur, TGF-β salınımı artar, SOR indüksiyonu olur, kollajen üreten hücreler aktive olur, miyofibroblastlar aktive olur böylece fibrozis artmış olur. Oksidatif stres TGF-β sentezini arttırır, fibroblastları aktive ederek fibrozis gelişmesinde önemli rol oynamaktadır (39).
Patolojik stres sonrası total β miktarı artar, bununla birlikte inaktif TGF-β1 aktif TGF-TGF-β1’e dönüşür. Aktif TGF-TGF-β1 artışı yara dokusundaki fibroblastların miyofibroblastlara dönüşümünü arttırır. Bu da ekstra sellüler matriks (ESM) artışı ve fibrozis ile sonuçlanır (40) (tablo 1).
8 2.4. Omega-3 Yağ Asidi
Esansiyel yağ asitleri insan vücudunda üretilmeyen dışarıdan alınan önemli bileşenler olup omega-3 ve omega-6 olarak iki gruba ayrılır. Molekülün karbon zincirinin (omega ya da ω) metil grubundan itibaren sayılınca ilk karbon-karbon çift bağı 3. sırada ise omega-3, 6 sırada ise omega-6 olarak adlandırılır (41) (şekil 1).
Şekil 2: Omega-3 yağ asitlerinin kimyasal yapısı (41)
Esansiyel yağ asitleri içerdikleri 2 veya daha fazla çift bağ nedeniyle çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) olarak da isimlendirilirler (41). PUFA’lar omega-3 ve omega-6 olarak 2 gruba ayrılır. En aktif formu araşidonik asit olan omega- 6 daha çok et ürünleri ve bitkisel yağlarda bulunmaktadır. Araşidonik asit prostoglandin, lökotrien ve tromboksan sentezinde kullanılır. Omega-3 daha çok deniz ürünleri ve balık yağında bulunur. Yüksek oranda dokosaheksaenoik asit (DHA) ve eikosapentaenoik asit (EPA) içerir. DHA daha çok beyin ve retina hücreleri, sperm hücresi gibi hücrelerin membran fosfolipidleri içerisinde bulunurken EPA, araşidonik aside benzer bir yolla siklooksijenaz ve lipoksijenaz enzim sistemine katılır (42). Esansiyel yağ astilerinin hücre membranın akışkanlığı ve fleksibilitesi ile doğrudan ilişkili olması yanında omega-3, oksidatif stresi azaltır ve antiinflamatuardır (43).
Omega-3 yağ asitlerinin bazı etkileri özetle aşağıda sıralanmıştır (44):
- Omega-6 yağ asitleri ile etkileşimi sonucu inaktif lökotrien ve tromboksan oluşumu.
- İnterlökin-1, interlökin-2, tümör nekrozis faktör (TNF) gibi bazı medyatörlerin salınımında azalma.
- Plazma trigliserid ve çok düşük dansiteli lipoprotein (VLDL) düzeylerinde azalma.
9
- Eikosanoidlerdeki değişiklikler, kan viskozitesindeki değişiklikler, hormonal-hücresel cevapta değişiklikler, renin salınımı üzerine etkiler, vazopressör hormonlara cevapta azalma sonucu hipotansiyon oluşturma. - Fibrinojen konsantrasyonunu azaltarak plazma vizkozitesinde azalma. - Faktör 7, von Willebrand düzeylerini azaltır ve fibrinolizisi arttırarak
kanama zamanını uzatır.
- Nitrik oksit düzeyinı arttırarak arter kompliyansını arttırır.
- Hücresel adezyon molekülleri (selektinler) üzerinde azaltıcı etkisi mevcuttur.
2. 5. Omega-3 Yağ Asitlerinin Fibrozis Önleyici Özelliği
Hücresel inflamasyonda primer medyatörleri olan eikosanoidler (protaglandinler, lökotrienler, tromboksanlar) araşidonik asitten (AA) üretilir. Omega-3 yağ asidi olan EPA, AA üretimini sağlayan delta-5 desaturaz enzimini inhibe ederek antiinflamatuar etki gösterir. EPA, AA’ları membran fosfolipitlerinden serbestleştiren fosfolipaz A2 enzimi için AA ile yarışır. Hücrede EPA oranı arttıkça serbest araşidonik asit miktarı azalır ve hücresel inflamasyon azalmış olur. DHA’lar ise AA oluşumunda görev alan gama linoleic asit sentezini azaltarak AA miktarını azaltır. Yine araşidonik asit miktarı azalması hücrede inflamatuar medyatörlerin oluşumun azaltır ve bu yolla hücresel inflamasyonu azaltır (45-46).
Hücre zarında TGFβ reseptör 1 ve reseptör 2 isimli 2 adet reseptör bulunmaktadır. Oksidatif stres anında aktif hale geçen TGF-β1 bu reseptörlere bağlanır. Bu bağlantı sonrası bir hücre içi protein olan SMAD 2 ve 3 proteinleri fosforillenir ve pSMAD 2 ve 3 oluşur. pSMAD 2/3 SMAD 4 ile birleşerek nükleer transkripsiyon faktörlerini tetikler ve fibroblastlar miyofibroblastlara dönüşür, kollajen üretimi artar ve fibrozis oluşur. TGF-β1 tarafından indüklenen kollajen sentezi ve fibroblast transformasyonu, hücre içi ikinci haberci olan siklik guanil monofosfat (cGMP) ve protein kinaz G (PKG) ile bloke olur. Hücre membranını yapısında yer alan caveolin-1 nitrik oksit sentazı (NOS), bloke ederek nitrik oksit (NO) üretimini azaltır. Omega-3 yağ asitlerin hücre membranı yapısına katılmasıyla
10
NOS ekspresyonu artar ve NO üretimi artar. Artan NO cGMP ve PKG sinyal yolunu aktive eder, hücre içi haberciler olan pSMAD proteinlerinin nükleusa geçişleri bloke olur, kollajen üretimi azalır, fibroblastların miyofibroblastlara dönüşümü azalır böylece fibrozis azaltılmış olur (40) (Şekil 3).
11 3. GEREÇ VE YÖNTEM
Çalışma Abant İzzet Baysal Üniversitesi (AİBÜ) Hayvan Araştırmaları Yerel Etik Kurulu onayı (13.02.2013 tarih ve 25 sayılı yazı) alınarak AİBÜ Deney Hayvanları Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde 01.05.2013- 15.05.2013 tarihleri arasında yapılmıştır. Çalışmada kullanılan ağırlıkları 250-300 gram aralığında olan 10-14 haftalık, daha önce herhangi bir deneyde kullanılmamış 24 adet Wistar- Albino cinsi rat AİBÜ Deney Hayvanları Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde üretilmiştir. 30 cm x 50 cm plastik kafeslerde 6 (altı) hayvan olacak şekilde barındırılmıştır. Bütün hayvanlar kontrollü çevresel şartlarda (20-23 o
C, 12 saat aydınlık/karanlık, %50 nem) yem ve su kısıtlaması olmaksızın kontrol altında tutuldu. Operasyondan 5 saat önce hayvanların beslenmesi kesildi.
3. 1. Miringotomi
İntraperitoneal 50 mg/kg ketamin hidroklorür (Ketalar®, Pfizer Warner Lambert, ABD) ve 5 mg/kg ksilazin hidroklorid (Ksilazol®, Provet Veteriner Ürünleri Sanayi İstanbul, Türkiye) enjeksiyonu ile yapılan anestezi altında otomikroskopik olarak muayene edilen ve her iki timpanik membranı normal olduğu görülen 24 adet rat çalışmaya dahil edildi. Ratlar randomize olarak her grupta 6 rat olacak şekilde 4 gruba ayrıldıktan sonra bilateral timpanik membranlarına otomikroskopik bakı ile steril pik kullanılarak arka üst kadrana standart miringotomi yapıldı (Resim 2).
12 Resim 2: Otomikroskopik bakı ile miringotomi yapılmış rat timpanik membranı
3. 2. Çalışma Grupları
Toplam 24 adet ratın her iki timpanik membran arka üst kadranına otomikroskopik bakı altında miringotomi yapıldıktan sonra ratlar 4 gruba ayrıldı.
Miringotomi Grubu (M): Toplam 6 adet ratın 12 adet timpanik
membranlarına standart miringotomi sonrası herhangi bir işlem yapılmadı.
Miringotomi + Topikal Serum Fizyolojik Grubu (M+ SF): Toplam 6 adet
ratın her iki timpanik membranına standart miringotomi sonrası 0, 12 ve 24. saatte SF emdirilmiş gelfoam (Stypro® Haemostypticum, Kleinostheim, Germany) perforasyon üzerine gelecek şekilde yerleştirildi.
Miringotomi + Topikal Omega-3 Grubu (M+ T ω-3): Toplam 6 adet ratın
her iki timpanik membranına standart miringotomi yapıldıktan sonra 0, 12 ve 24. saatte 10 mikrolitre omega- 3 (Marincap®, Koçak Farma) emdirilmiş gelfoam perforasyon üzerine yerleştirildi.
13 Miringotomi + Oral Omega-3 Grubu (M+O ω-3): Toplam 6 adet ratın her
iki timpanik membranına standart miringotomi sonrası 1mg/gr yaklaşık 0,6 mililitre (ml) omega- 3 orogastrik gavaj yoluyla 14 gün boyunca günde 1 kez uygulandı.
Miringotomi işlemi uygulandıktan sonra ratlar 14 günlük iyileşme dönemine bırakıldı. Ratlara omega- 3 ve serum fizyolojik dışında herhangi bir farmakolojik ajan uygulanmadı. Ratlar 14 gün boyunca palet yemlerle standart laboratuar koşullarında serbest olarak beslendi.
On dört günlük iyileşme döneminin ardından ratlar otomikroskopik olarak muayene edilerek miringoskleroz skorlaması yapıldı. Muayenede miringoskeroz yoksa (0), manubrium mallei komşuluğunda yerleşmiş miringoskleroz varlığı (+), manubrium mallei ile birlikte ön-üst kadranda da miringoskleroz varsa (++), manubrium malleiden başlayan ve anulus boyunca uzanan sklerotik lezyon varsa (+++) olarak skorlandı (11) (şekil 4).
Miringoskleroz (+) Miringoskleroz (++) Miringoskleroz (+++) Şekil 4: Miringosklerotik lezyonların otomikroskopik bakı altında şematik skalası
(11)
Ratlara otomikroskopik değerlendirme yapılıp miringoskleroz skorlaması yapıldıktan sonra yüksek doz intraperitoneal Pentotal (Pental® İ.E. Ulagay İlaç Sanayi, İstanbul, Türkiye) (80 mg/kg) enjeksiyonu ile dekapite edildi. Dekapitasyonun ardından timpanik bulla bulunana kadar cilt ve cilt altı dokular diseke edildi. Timpanik bulla çıkartıldıktan sonra bullaya sagital insizyon yapıldı ve
14
timpanik membran çevresindeki 1-2 mm kemik anulus ve 1 mm’lik dış kulak yolu ile birlikte çıkartıldı (Resim 2).
Resim 3: Hazırlanan timpanik membranın medial yüzden görünümü
3. 3. Histopatolojik İnceleme
Çalışmanın histopatolojik değerlendirme bölümü Düzce Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı‘nda yapıldı. Değerlendirme hangi gruba ne tedavisi verildiğini bilmeyen bir patolog tarafından yapılmıştır.
Örnekler %10’luk fosfat tamponlu formalin ile 1 gün tespit edildi. Sıralı alkol, ksilen ve parafin aşamaları ile dehidratasyon işlemi yapıldı ve örnekler miringotomi alanından geçen ve manubrium malleiye dik olarak uzanan bir kesi ile ikiye ayrıldı. Sonra parafin bloklar hazırlandı. Parafin bloklardan mikrotom ile elde edilen beş mikrometre kalınlıkta kesitler alınıp hemotoksilen eosin ile boyanan lamlar, Nikon marka Eclipse i80 model ışık mikroskobunda incelendi. Nikon
DS-Fi-15
1 fotoğraf makinesi ile fotoğraflar çekildi (Resim 4-7). Nikon Nis element v3,1 programı ile fotoğrafların kalibrasyonu ve ölçümleri yapıldı.
Parafin bloklardaki örneklerden mikrotom ile 10 ayrı noktadan kesitler alınıp hemotoksilen eosin ile boyandı. Nikon Eclipse 80i ışık mikroskobunda incelendi, Nikon DS-Fi-1 fotoğraf makinesi ile fotoğraflar çekildi. Nikon Nis element v3,1 programı ile kalibrasyonu ve ölçümleri yapıldı. Bu ölçümlerin ortalamaları timpanik membran kalınlığı olarak kabul edildi. Timpanik membran lamina propriasındaki sklerotik değişiklikler 0-2 arası puan verilerek semikantitatif olarak değerlendirildi. Miringoskleroz yok ise 0 puan, ayrı ayrı yerleşmiş seyrek sklerotik lezyonlar 1 puan, geniş sklerotik lezyonlar 2 puan olarak değerlendirildi. Timpanik membran lamina propriasında gözlenen inflamasyon 0-3 puan verilerek skorlandı. İnflamasyon yoksa 0, hafif inflamasyon 1, orta derece inflamasyon 2, şiddetli inflamasyon 3 olarak skorlandı.
3. 4. İstatistiksel Analiz
Değerlendirmede timpanik membran kalınlıkları mikrometre cinsinden ölçüldü. Otomikroskopik bakıda miringoskleroz düzeyi ve histopatolojik olarak lamina propriadaki inflamasyon düzeyi 0 ve 1 (yok ve hafif) ile 2 ve 3 (orta ve ağır) olarak skorlandı. Histopatolojik miringoskleroz düzeleri ise 0, 1 (yok, seyrek) ve 2 (geniş) olarak skorlandı.
Sürekli değişkenler bakımından grupların karşılaştırılmasında Tek Yönlü Varyans Analizi ve Tukey HSD post hoc testi kullanılmıştır. Kategorik değişkenler ile gruplar arasındaki ilişkilerin belirlenmesinde Monte Carlo simülasyonuyla Fisher-Freeman Exact test kullanılmıştır. İstatistik analizler PASW v.18 paket programı ile yapılmış, istatistik önemlilik düzeyi p<0,05 ise anlamlı olarak kabul edilmiştir.
16 4. BULGULAR
4. 1. Otomikroskopik Değerlendirme
Otomikroskopik değerlendirmede miringoskeroz düzeyi tablo 2’de gösterilmiştir.
Tablo 2: Otomikroskopik olarak değerlendirilmiş miringoskleroz bulguları
M M+SF M+T ω3 M+O ω3 Otom ik rosk op i MS Yok n 0 1 2 3 % 0,0% 8,3% 16,7% 25,0% Hafif MS (+) n 6 6 6 7 % 50,0% 50,0% 50,0% 58,3% Orta MS (++) n 4 3 4 2 % 33,3% 25,0% 33,3% 16,7% şiddetli MS (+++) n 2 2 0 0 % 16,7% 16,7% 0,0% 0,0% TOPLAM n 12 12 12 12 % 100 100 100 100
(M: miringotomi, MS: miringoskleroz, SF: serum fizyolojik, M+T ω3: Miringotomi+ topikal omega- 3, M+O ω3: miringotomi+ oral omega- 3)
Gruplar yok-hafif (skoru 0 ve 1 olanlar) ve orta şiddetli (skoru 2 ve 3 olanlar) olarak kategorize edilerek tablo 3’te gösterildi.
Tablo 3: Gruplandırılmış otomikroskopik miringoskleroz bulguları Otomikroskopik Miringoskleroz Düzeyi
YOK/ HAFİF ORTA/ ŞİDDETLİ TOPLAM
GRUP SAYI Oran % SAYI Oran % SAYI Oran %
M 6 50 6 50 12 100
M+SF 7 58,3 5 41,7 12 100
M+T ω-3 8 66,7 4 33,3 12 100
M+O ω-3 10 83,3 2 16,7 12 100
(M: miringotomi, M+ SF: miringotomi+ serum fizyolojik, M+T ω- 3: miringotomi+ topikal omega- 3, M+O ω- 3: miringotomi+ oral omega- 3)
17
Miringotomi sonrası 14. günde SF verilen grupta 1 timpanik membranda, topikal omega-3 verilen grupta 2 timpanik membranda, orogastirk omega-3 uygulanan grupta 3 timpanik membranda otomikroskopik olarak miringoskleroz görülmedi. Miringotomi yapıldıktan sonra tedavi verilmeyen grupta orta ve şiddetli miringoskleroz oranı %50 iken, miringotomi sonrası topikal serum fizyolojik uygulanan grupta orta ve şiddetli miringoskleroz oranı %41,7’dir. Miringotomi sonrası topikal omega-3 uygulanan grupta orta ve şiddetli miringoskleroz oranı %33,3 iken, oral omega-3 uygulanan grupta %16,7’dır. İstatistiksel olarak bu değerlerin anlamlı olmadığı görüldü (p= 0,439).
4. 2. Histopatolojik Değerlendirme
Histopatolojik değerlendirme sonuçları tablo 4’te gösterilmiştir.
Tablo 4: Histopatolojik sonuçlar Grup Miringotomi Grup Miringotomi + SF Grup Miringotomi + Topikal ω-3 Grup Miringotomi + Oral ω-3 TMK İS MS TMK İS MS TMK İS MS TMK İS MS 1 97 3 2 69 1 1 74 1 1 68 1 1 2 79 2 1 73 0 1 72 1 1 63 0 0 3 71 1 1 74 1 1 62 0 0 75 1 1 4 82 2 2 65 0 1 59 0 0 78 2 1 5 81 2 1 79 2 2 76 1 2 65 1 1 6 82 2 1 82 2 2 83 2 2 61 0 0 7 129 3 2 78 1 2 79 2 1 55 0 0 8 69 1 1 63 1 1 70 0 1 74 1 2 9 72 1 1 84 2 2 58 0 1 69 0 1 10 74 0 1 62 0 0 71 1 1 73 1 1 11 75 1 1 76 1 1 69 1 1 62 0 1 12 82 1 2 75 1 1 74 1 2 75 1 2
(TMK: timpanik membran kalınlığı, İS: inflamasyon skoru, MS: miringoskleroz skoru)
18 4. 2. 1. Timpanik Membran Kalınlığı
Timpanik membran kalınlıkları hemotoksilen-eosin ile boyanmış preperatlarda ölçülerek değerlendirildi (Resim 4-6).
Resim 4: Miringotomi grubuna ait bir kesit. Kalın kollajen lifler içeren kalınlığı,
artmış timpanik membran dokusu. (HEx200).
Resim 5: Miringotomi+ Topikal ω-3 grubuna ait kesit. Timpanik membran kalınlığı
19 Resim 6: Miringotomi+ SF grubuna ait kesit. Kalın kollajen fibriller içeren kalın bir
timpanik membran.
Grupların timpanik membran kalınlıkları ve standart sapmaları tablo 5’te gösterilmiştir.
Tablo 5: Grupların ölçülen ortalama kalınlıkları ve standart sapmaları GRUP Ortalama Kalınlık (µ) Standart Sapma
M 82.75 16,35
M+SF 73,33 7,24
M+T ω-3 70,58 7,68
M+O ω-3 68,17 7,06
(M: miringotomi, M+ SF: miringotomi+ serum fizyolojik, M+T ω- 3: miringotomi+ topikal omega- 3, M+O ω- 3: miringotomi+ oral omega- 3, µ: mikrometre)
Kalınlık bakımından gruplar arasında istatistiksel olarak önemli bir farklılık olduğu görüldü (p=0,007). Post hoc test sonucunda bu farklılığın M grubu ile M + T ω3 grupları arasında (p=0,030) ve M grubu ile M + O ω3 arasında (p=0,007) ortaya çıktığı, diğer grupların birbirine benzerlik gösterdiği sonucuna ulaşılmıştır.
20 4. 2. 2. Lamina Propriadaki İnflamasyon Düzeyi
Gruplar yok-hafif (skoru 0 ve 1 olanlar) ve orta şiddetli (skoru 2 ve 3 olanlar) olarak katergorize edildi. Lamina propriadaki inflamasyon düzeyi gruplar halinde tablo 6’da gösterilmiştir.
Tablo 6: Gruplardaki lamina propriadaki inflamasyon düzeyinin dağılımı Lamina propridaki inflamasyon düzeyi
YOK/ HAFİF ORTA/ ŞİDDETLİ TOPLAM
GRUP SAYI Oran % SAYI Oran % SAYI Oran %
M 6 50 6 50 12 100
M+SF 9 75 3 25 12 100
M+T ω-3 10 83.3 2 16,7 12 100
M+O ω-3 11 91,7 1 8,3 12 100
(M: miringotomi, M+ SF: miringotomi+ serum fizyolojik, M+T ω- 3: miringotomi+ topikal omega- 3, M+O ω- 3: miringotomi+ oral omega- 3)
Parafin bloklardan mikrotomi ile elde edilen kesitler lam üzerinde hemotoksilen-eosin ile boyanarak lamina propriadaki inflamasyon düzeyi ve ödem değerlendirildi (Resim 7).
21 Resim 7: Miringotomi grubuna ait kesit. Yoğun inflamasyon ve ödem görülen
kalınlığı artmış timpanik membran. (HEx200).
Orta ve şiddetli inflamasyon düzeyi M grubunda %50, M + SF grubunda %25, M + T ω-3 grubunda %16,7, M + O ω-3 grubunda %8,3 oranında görülmüştür. Ancak Monte Carlo simülasyonuyla Fisher-Freeman Exact test kullanılarak yapılan istatistiksel analizde p=0,157 olarak görülmüş ve anlamlı olarak kabul edilmemiştir.
4. 2. 3. Miringoskleroz
Histopatolojik olarak elde edilen veriler tablo 7’de gösterilmiştir.
Tablo 7: Histopatolojik miringoskleroz bulguları MİRİNGOSKLEROZ Grup Sayı MS Yok (0) Hafif MS (+) Şiddetli MS (++) M 12 0 8 4 M+ SF 12 1 7 4 M+ T ω-3 12 2 7 3 M+ O ω-3 12 3 7 2
(M: miringotomi, M+ SF: miringotomi+ serum fizyolojik, M+T ω-3: miringotomi+ topikal omega-3, M+O ω-3: miringotomi+ oral omega-3, MS: miringoskleroz)
22
Miringoskleroz skorları histopatolojik olarak değerlendirilip kaydedildikten sonra Fisher-Freeman Exact test yapılmak üzere iki grupta değerlendirilmiştir. Miringosklerozu olmayan ve hafif olanlar (0 ve +) ile şiddetli olanlar (++) olarak 2 gruba ayrılmıştır.
Tablo 8: Gruplandırılmış histopatolojik miringoskleroz düzeyleri Histopatolojik Miringoskleroz Düzeyi
YOK/ HAFİF (0/+)
ŞİDDETLİ (++)
TOPLAM
GRUP SAYI Oran % SAYI Oran % SAYI Oran %
M 8 66,7 4 33.3 12 100
M+SF 8 66,7 4 33,3 12 100
M+T ω-3 9 75 3 25 12 100
M+O ω-3 10 83,3 2 16,7 12 100
(M: miringotomi, M+ SF: miringotomi+ serum fizyolojik, M+T ω-3: miringotomi+ topikal omega-3, M+O ω-3: miringotomi+ oral omega-3)
Histopatolojik olarak M grubunda tamamında miringoskleroz görülmüştür. M+SF grubunda 1, M+T ω-3 grubunda 2, M+O ω-3 grubunda 3 timpanik membranda miringoskleroz görülmedi. Şiddetli miringoskleroz M grubunda %33,3, M+SF grubunda %33,3, M+ T ω-3 grubunda %25, M+ O ω-3 grubunda %16,7 olarak görülmüştür. Yapılan değerlendirmede istatistiksel olarak gruplar arasında anlamlı bir faklılık görülmemiştir (p=0,892)
23 5. TARTIŞMA
Miringoskleroz timpanik membran lamina propriasındaki kollajen tabakanın hiyalenizasyonu ve kalsifikasyonu sonucu oluşan bir durumdur. Genellikle efüzyonlu otitis medianın tedavisi için yapılan miringotomi ve/veya ventilasyon tüpü uygulaması sonrası oluşur (2-8). Otomikroskopik muayenede farklı boyut ve şekillerde beyaz lezyonlar olarak görülen miringosklerozun histopatolojik incelemesinde lamina propriadaki kollajen liflerin artışı ve bunun üzerine kalsiyum fosfat minerallerinin çökmesi sonucu oluştuğu görülmektedir (47-48). Miringoskleroz ateroskleroz ile histolojik olarak benzerlikler göstermektedir. Yapılan çalışmalarda her iki hastalıkta da görülen ortak özellikler, lamina propriada kollajen üretiminde artış, fibroblast artışı ve kollajen fibrillerinin kalsifikasyonudur. Kollajen üretiminin artması, hiyalenizasyon ve kalsifikasyon sonucu aterosklerozda damar çeperi kalınlığı artarken, miringosklerozda timpanik membran kalınlığı artar (49). İnsan kulağında sklerotik plaklar en çok timpanik membranda görülür ancak skleroz orta kulak mukozasını, kemikçik zinciri, iç kulak yapılarını ve mastoid hücrelerini de tutabilir. Miringoskleroz genellikle asemptomatiktir. Timpanik membranın geniş bir şekilde tutulduğu durumlar ile orta kulakta yaygın timpanoskleroz varlığında kemikçik zincir ve iç kulak yapıları etkilenerek ileri düzeyde işitme kayıplarına neden olabilir (2,5,50,51). İleri işitme kaybı olan hastaların tedavi edilmesi oldukça güçtür. Sklerotik plakların orta kulaktan temizlenmesi zordur ve temizlendikten sonra nüks etme olasılığı çok yüksektir. Yapılan cerrahi müdahalelerin yetersiz kalması araştırmacıları hastalığı tedavi etmekten çok önlemeye yönelik çalışmalar yapmaya yöneltmiştir (13,51,52).
Geçmişten günümüze miringoskleroz gelişimini açıklamaya çalışan hipotezler ortaya atılmıştır. Tos ve ark. (53), ventilasyon tüpü takılan timpanik membranlarda zar hareketlerinin kısıtlanmasının kollajen tabakada hiyalenizasyon ve kalsifikasyonu artırarak miringosklerozu artırdığını savunmuşlardır. Sklerotik lezyonların anulusa yakın dış kısımda, zarın daha az hareketli kısımlarında yoğunlaştığını ve santralde daha az görüldüğünü savunmuşlardır. Yapılan bir başka çalışmada lokal travma, timpanik membran kanaması gibi nedenlerin yanı sıra ventilasyon tüpünün basısının ve miringotomi insizyonunun membrandaki kan
24
dolaşımını bozarak miringoskleroza neden olduğunu öne sürmüşlerdir (54). Miringotomi sonrası oluşan kanama sonucu artan serbest hemoglobinin lamina propriada doku hasarına neden olduğu ve miringoskleroz gelişimini başlattığı çalışmalar ile gösterilmiştir (55).
Son yıllarda yapılan çalışmalar göstermiştir ki; membran bütünlüğü bozulduğunda ortamda SOR miktarı artmakta, buna bağlı oluşan doku hasarı sonrası miringoskleroz gelişmektedir (3,5,9,11,12). Normalde orta kulakta oksijen oranı %5-10 aralığındayken miringotomi sonrasında dış ortam düzeyine, yaklaşık %20’lere, çıkmaktadır. Hiperoksik ortamda serbest oksijen radikalleri artmakta, buna bağlı doku hasarı ve inflamasyon artmaktadır. Yoğun inflamasyon ve doku hasarı olan bölgede ise kollajen üretimi artmakta, hiyalenizasyon ve kalsifikasyon gelişmektedir (2,9,56). SOR’un timpanik membran üzerindeki zararlı etkileri çeşitli antioksidan maddeler ile giderilebilir. Bu amaçla E vitamini, askorbik asit, L-karnitin, selenyum, N-asetil sistein, gingko biloba ve alfa tokoferol gibi antioksidan maddeler kullanılmıştır (3,5,11,12,17,57). Yapılan çalışmalarda timpanik membranın arka üst kadranına yapılan miringotomi ile miringoskleroz gelişiminin başlatılabildiği görülmüş. Çalışmalarda retrakte olmayan, enfeksiyonu olmayan kulaklar çalışmaya dahil edilmiş. Biz de çalışmamıza muayenesinde timpanik membranlarında ve orta kulakta herhangi bir patolojisi olmayan ratları dahil ettik. Her iki timpanik membranın arka üst kadranına miringotomi yaparak miringoskleroz oluşturmayı amaçladık. Miringotomi sonrası herhangi bir tedavi uygulanmayan membranlarda 14. gün yaptığımız otomikroskopik ve histopatolojik değerlendirmede miringoskleroz geliştiği görüldü.
Mattson ve ark. (58) akut orta kulak iltihabı olan ve olmayan kulaklara miringotomi uygulamış ve miringoskleroz gelişimi açısından fark olmadığını tespit etmişlerdir. Akut orta kulak iltihabı olan ve spontan iyileşmeye bırakılan kulaklarda miringoskleroz gelişmediğini görmüşlerdir. Bu da miringoskleroz gelişim sürecinde iltihabı yanıtın yanı sıra miringotomi sonrası ortamda artmış olan oksijen düzeyi ve serbest oksijen radikallerinin etkili olduğunu düşündürmüştür. Yapılan bir başka çalışmada miringotomi uygulandıktan sonra farklı oksijen konsantrasyonları altında tutulan deneklerde daha yüksek oranda miringoskleroz geliştiği görülmüş.
25
Miringotomi sonrası %40 oksijen konsantrasyonunda tutulan ratlarda normal oksijen basıncında tutulanlara göre daha yüksek oranda miringoskleroz geliştiği görülmüş. Araştırmacı bu çalışma sonucunda yüksek oksijen konsantrasyonu sonucunda daha yüksek oranda açığa çıkan SOR’un doku hasarından sorumlu olduğunu ve miringoskleroz gelişimini arttırdığını savunmuş (14). SOR tutucu maddeler olan deferoksamin ve süperoksit dismutaz (SOD) ile miringoskleroz gelişiminin önlendiği gösterilmiştir. SOR artışı doku hasarı ve inflamasyonu artırarak miringosklerozu artırmaktadır (56). Süper oksit moleküllerinin, inflamasyon sırasında açığa çıkan nitrik oksiti (NO) ile reaksiyona girmesi sonucu peroksinitritler oluşur. Peroksinitler hücresel hasardan sorumlu moleküllerdir. Hücresel hasar sonucu olay yerine gelen inflamatuar hücreler salgıladıkları çeşitli sitokinler ile inflamasyonu başlatır. Timpanik membranın lamina propriasında artan inflamasyon sonrası fibroblastik aktivite artmakta ve düzensiz kollajen sentezi ve hiyalenizasyon meydana gelmektedir. Omega-3 hem inflamasyonu azaltıcı etkisi, hem de hücresel düzeyde fibrozis oluşturan transkripsiyon faktörleri üzerine etkisi ile fibrozis oluşumunu azaltır (41,59,60).
Miringoskleroz gelişimini önlemek için birçok antioksidan ve antiinflamatuar ajanlar kullanılmıştır. Kaptan ve ark. (17) yapmış olduğu çalışmada ginkgo biloba ekstresinin (GBE) oksidatif stres ve miringoskleroz gelişimini önleyici etkisini deneysel olarak araştırmış. Miringotomi sonrası bir grup rata orogastrik yolla GBE verilmiş, bir gruba orogastrik SF verilmiş, bir gruba ise hiçbir ilaç uygulanmamıştır. Onuncu gün dekapite edilen ratlarda miringoskleroz düzeyi otomikroskopik olarak değerlendirilmiş ve intrakardiyak olarak alınan kanda superoksit dismutaz (SOD), melandiol dehidrat, glutatyon peroksidaz ve nitrat ve nitrit düzeyleri biyokimyasal olarak ölçülmüş. GBE verilen gruplarda otomikroskopik olarak miringoskleroz düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı azalma görülmüş. Oksidatif stresinin azaldığının bir göstergesi olarak glutatyon peroksidaz seviyesi artmış, nitrit ve nitrat düzeyleri azalmıştır. Başka bir çalışmada kafeik asit fenetil esterin (CAPE) miringosklerozu önleyici etkisini araştırmak üzere deneysel bir çalışma yapılmış. CAPE bal kovanından elde edilen antioksidan, antimetastatik, antiviral, immun modülatör, antiinvaziv ve karsinostatik bir maddedir. Bu çalışmada deneysel miringotomi yapılan ratlarda CAPE’in antioksidan, antiinflamatuar özelliği ile
26
miringoskleroz gelişimini üzerine etkisi araştırılmış Bir gruba intraperitoneal CAPE, bir gruba intraperitoneal SF verilmiş. Ratlar 15 gün sonra dekapite edilmiş ve zar kalınlığı, miringoskleroz genişliği ve lamina propriadaki inflamasyon düzeyleri istatistiksel olarak analiz edilmiş. CAPE uygulanan grupta kontrol gruplarına göre timpanik membran kalınlığı ve miringosklerotik plak gelişimi açısından anlamlı bir fark görülmüş. CAPE tedavisinin genellikle ventilasyon tüpü uygulamaları sonrasında görülen miringoskleroz gelişimini önlediği tespit edilmiş(61).
Vuralkan ve ark (62) L-karnitinin miringoskloroz gelişimine etkisini araştırmışlar. Kırksekiz adet ratı rastgele 4 gruba ayırmışlar. Miringotomi sonrası grup bire hiçbir tedavi verilmemiş, grup ikiye intraperitoneal L-karnitin verilmiş, grup üçe lokal (kulağa) L-karnitin verilmiş, grup dörde ise hem intraperiotenal hem lokal L-karnitin uygulanmış. On beş gün boyunca tedavi uygulanan ratlar 15. günde sakrifiye edilmiş. Timpanik membranlar timpanosklerotik plak formasyonu, fibroblastik proliferasyon, timpanik membran kalınlığı ve yeni damar oluşumu açısından değerlendirilmiş. Sonuç olarak intraperitoneal L-karnitin uygulanan gruplarda timpanik membran kalınlığı ve fibroblastik proliferasyonda istatistiksel olarak anlamlı azalma görülmüştür. Lokal L-karnitinin etkisinin sınırlı düzeyde olduğu tespit edilmiş. Yapılan farklı bir çalışmada da kalsiyum kanal blokerlerinin miringoskleroz ve timpanosklerozu önleyici etkisini araştırılmıştır. Bu çalışmada miringoskleroz etyopatogenezindeki kollajen fibrilleri arasına kalsiyum fosfat kristallerinin çökmesini önlemek ve bu yolla miringoskleroz gelişiminin önlenmesi amaçlanmıştır. Yirmi beş adet yetişkin kobayda standart miringotomi sonrası bilateral orta kulağa Streptococcus pneumoniae inokulasyonu yapılarak otitis media oluşturulmuş. Kobayların sağ kulağına kalsiyum kanal blokeri (diltiazem) solüsyonu jelatin sponge üzerine damlatılarak günlük olarak uygulanmış. Sol taraf kontrol grubu olarak bırakılmış. Kobaylar 6 hafta boyunca haftalık olarak takip edilmiş. 6 hafta sonra sakrifiye edilmiş. Diltiazem grubunda %81, kontrol grubunda %100 oranında miringoskleroz gelişimi gözlenmiş. Miringoskeroz gelişiminde anlamlı bir azalma görülmüştür (63).
Çalışmamızda omega-3 yağ asitlerini kullanmamızın nedeni omega-3 yağ asitlerinin antioksidan, antiinflamatuar ve antifibrotik maddeler olmalarıdır.
27
Literatürde omega-3’ün miringosklerozu önleyici etkisi ile ilgili çalışma bulunmamaktadır. Omega-3’ün antiinflamatuar,antifibrotik ve antioksidan özellikleri üzerine yapılmış literatürdeki farklı çalışmalar tarandı. An ve ark. (64) yapmış oldukları çalışmada rat böbreğinin 5/6’sını çıkardıktan sonra omega-3 yağ asidi uygulamıştır. Bu çalışmada deneysel olarak kronik böbrek yetmezliği geliştirilen ratlara omega-3 destek tedavisi verilmiştir. On iki hafta omega- 3 yağ asidi tedavisi verilen ratlarda oksidatif stres, inflamasyon, fibrozis ve epitelyal-mezenkimal dönüşümün azaldığı görülmüştür. Bu da kronik böbrek yetmezliğinin ilerlemesini yavaşlatıcı bir tedavi olarak omega-3 ün potansiyel bir ilaç olabileceğini düşündürmüştür. Bir başka çalışmada biliyer duktus ligasyonu yapılan ratlarda omega-3 yağ asitlerinin etkisi değerlendirilmiş. Deney grubuna 10 gün boyunca omega-3 gastrik gavaj yoluyla verilmiş, kontrol grubuna da salin verilmiştir. Karaciğerde glutatyon ve TGF-β1 seviyelerine tespit edilmiştir. Deney grubunda glutatyon ve TGF-β1 seviyelerinde kontrol grubuna göre anlamlı fark bulunmuştur. Ancak omega-3 yağ asitlerinin karaciğer hasarı yapma potansiyeli olduğundan dikkatli kullanılması gerektiği önerilmiştir (65). Rhesus maymunları üzerine yapılan bir çalışmada düşük doz omega-3 yağ asitlerinin alkolik karaciğer yağlanması ve karaciğer fibrozisine etkisini araştırılmış. Altı maymuna 5 yıl boyunca aspartam ile tatlandırılmış %7 etanol solüsyonuna 24 saat ulaşma imkanı verilmiş. Bir gruba alkol yanında omega-3 yağ asidi verilmiştir. Bu çalışmada 5 yıl sonunda deney grubunda karaciğer fibrozisinde azalma bildirilmektedir. Ancak yüksek dozlarda alınan omega-3 yağ asitlerinde karaciğer fibrozisine neden olabileceği bildirilmiştir (66). Başka bir çalışmada da tekli doymamış, omega-3 ve omega-6 yağ asitlerinin hiperkolesterolemik tavşanlarda karaciğer fibrozisine etkisini araştırılmıştır. Domuz yağı ve kolesterol içeren diyet verilerek hiperkolesterolemi oluşturulmuş. Bir gruba tekli doymamış yağ asidi (ayçiçek yağı), bir gruba omega-6 yağ asidi (zeytin yağı), bir gruba da omega-3 (balık yağı) verilmiş. Tekli doymamış yağ asidi ve omega- 3 yağ asidi verilen grupta karaciğerde hiperkolesterolemiye bağlı fibrotik lezyonların gerilediği görülmüş. Ancak omega- 3 yağ asitlerinin safra taşına neden olabildiği tespit edilmiştir (67). Farklı bir çalışmada da deneysel olarak farelerde transvers aort darlığı oluşturmuşlar. Bir gruba omega- 3 yağ asidi bir gruba da normal diet verilmiş. Sekiz hafta takip edilen ratlarda kardiak fonksiyonlar, kardiak fibroblastlar
28
üzerindeki etkiler, TGF-β1, nitrit/nitrat, cGMP konsantrasyonu, SMAD gibi nükleer trasnkripsiyon faktörleri ve fibrozis düzeyi incelenmiştir. Çalışma sonunda omega-3 yağ asitlerinin kardiak fibrozisi ve kardiak fonksiyon bozukluklarını önlediği sonucuna ulaşılmıştır (68).
Biz de çalışmamızda omega-3 yağ asitlerinin kanıtlanmış olan antioksidan, antiiflamatuar ve antifibrotik özelliklerinden yararlanarak miringosklerozu önleyici özelliğini araştırdık. Omega- 3 yağ asitlerini bir gruba topikal uygularken bir gruba da orogastrik gavaj yoluyla sistemik olarak uyguladık. Topikal omega- 3 uygulanan ratlarda kontrol grubuna göre histopatolojik olarak miringoskleroz, lamina propriada inflamasyon parametlerinde oransal bir azalma olmasına karşın istatistiksel olarak anlamlı farklılık görülmedi. Bunun muhtemel bir nedeni omega-3 yağ asitlerinin suda çözünmesi ile molekül yapısındaki hidroksil grubunun koparak hücreler arası sıvıda asidite artışı ile irritatif etki oluşturmasıdır. Bu etki sonucunda artan inflamasyonun omega-3’ün antiinflamatuar etkinliğini nötralize ettiği düşünüldü. Orogastrik gavaj yoluyla sistemik olarak verdiğimiz omega-3 yine histopatolojik olarak inflamasyon ve miringoskleroz düzeyinde bir miktar azalmaya neden olduysa da istatistiksel olarak kontrol grubuna göre anlamlı farklılık bulunmamıştır. Bu da timpanik membranın periferik bir doku olması nedeniyle omega-3’ün karaciğer ve kardiyovasküler sistemde gördüğümüz etkilerini göremememizden kaynaklanmış olabilir. Topikal olarak ya da orogastrik gavaj yoluyla sistemik olarak uyguladığımız omega-3 yağ asitleri timpanik membran kalınlığında kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir azalmaya neden olmuştur. Timpanik membran yaralanmalarından sonra hasarlı alan dışındaki bölgelerde artan fibroblastik aktivitenin bir sonucu olan kalınlık artışını azalttığı tesbit edildi.
29 6. SONUÇ
Omega-3 yağ asitleri antiinflamatuar, antifibrotik, antioksidan özellikleri pek çok çalışma ile kanıtlanmış ve klinikte kullanım alanları olan farmakolojik ajanlardır. Deneysel çalışmamızda ratlara topikal ve orogastrik gavaj yoluyla sistemik olarak uyguladığımız omega-3 yağ asitlerinin miringosklerozu önlemedeki etkisini araştırdık. Topikal ve orogastik gavaj yoluyla sistemik olarak omega-3 uygulanan gruplarda tedavisiz grup ve SF verilen grup arasında timpanik membran kalınlık ölçümlerinde anlamlı düzeyde bir azalma saptanırken, inflamasyon düzeyi ve miringoskleroz skorlarında anlamlı bir fark bulunamadı. Omega-3 yağ asitlerinin miringosklerozu önleyici etkisinin olmadığı görüldü. Ancak daha geniş çalışma grupları ile farklı dozlarda omega-3 uygulanarak, hücresel, histopatolojik ve biyokimyasal olarak farklı parametreler çalışmaya eklenerek daha kapsamlı çalışmalar yapıldığında farklı sonuçlara ulaşılabilir.
30 7. KAYNAKLAR
1. Aydoğan F, Aydın E, Taştan E, Akgedik Ş, Tekeli A, Üstün H. Is there any effect of coenzyme Q10 on prevention of myringosclerosis? Experimental study with rats. Braz J Otorhinolaryngol 2013;79(3):293-7.
2. Görür K. Timpanoskleroz ve miringosklerozun etiyopatogenezi. Otoscope 2004;4:125-9.
3. Spratley JE, Hellström SO, Mattsson C, Pais-Clemente M. Topical ascorbic acid reduces myringosclerosis in perforated tympanic membranes. A study in rat. Ann Otol Rhinol Laryngol 2001;110: 585-91.
4. Forseni M, Hansson GK, Bagger-Sjöback D, Hultcrantz M. An immunohistochemical study of inducible nitric oxide synthase in the rat middle ear, with reference to tympanosclerosis. Acta Otolaryngol 1999;119:577-82. 5. Akbas Y, Pata YS, Görür K, Polat G, et al. The effect of L- carnitine on the prevention of experimentally induced myringosclerosis in rats. Hear Res 2003;184:107-12.
6. Mattsson C, Stierna P, Hellstrom S. Treatment with dexamethasone arrests the development of myringosclerosis after myringotomy. Am J Otol 2000;21:804-8. 7. Russell JD, Giles JJ. Tympanosclerosis in the rat tympanic membrane: An experimental study. Laryngoscope 2002;112:1663-6.
8. Yaman H, Güçlü E, Yılmaz S, Öztürk Ö. Myringosclerosis after tympanostomy tube insertion: Relation with tube retention time and gender. Auris Nasus Larynx 2010;37:676–679
9. Song JJ, Kwon SK, Cho CG, Park SW. The effect of caffeic acid phenethyl ester on the prevention of experimentally induced myringosclerosis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2007;71:1287-91.
10. Arslan N, Tepe D, Taotan E, Demirci M, et al. Evaluation of the effectiveness of topical ciprofloxacin and prednisolone in the prevention of myringosclerosis. Eur Arch Otorhinolaryngol 2012;269:2335–2341.
31
11. Özcan C, Görür K, Cinel L, Talas DU, et al. The inhibitory effect of topical N-acetylcysteine application on myringosclerosis in perforated rat tympanic membrane. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2002;63:179-84.
12. Polat S, Öztürk Ö, Üneri C, Yüksel M, et al. Determination of reactive oxygen species in myringotomized tympanic membranes: Effect of vitamin E treatment. Laryngoscope 2004;114:720-5.
13. Karlıdağ T, İlhan N, Kaygusuz i, Keleş E, et al. Comparison of free radicals and antioxidant enzymes in chronic otitis media with and without tympanosclerosis. Laryngoscope 2004;114:85-9.
14. Mattsson C, Magnuson K, Hellström S. Myringosclerosis caused by increased oxygen concentration in traumatized tympanic membrane. Ann Otol Rhinol Laryngol 1995;104:625-32.
15. Mattsson C, Hellström S. Inhibition of the development of myringosclerosis by local administration of fenspiride, an anti-inflammatory drug. Eur Arch Otorhinolaryngol 1997;254:425-9.
16. Doğan E, Erdağ TK, Sarıoğlu G S, Ecevit MC, İkiz AÖ, Güneri EA. The preventive effect of N-nitro L-arginine methyl ester in experimentally induced myringosclerosis. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology 2011;75:1035–1039.
17. Kaptan ZK, Emir H, Göçmen H, Uzunkulaoğlu H et al. Ginkgo biloba, a free oxygen radical scavenger, affects inflammatory mediators to diminish the occurrence of experimental myringosclerosis. Acta Oto-Laryngologica 2009;129:826-831.
18. Martins JG. EPA but not DHA appears to be responsible for the efficacy of omega-3 long chain polyunsaturated fatty acid supplementation in depression: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Nutrition 2009;28:525-542.
19. Leggieri E, De Biase RV, Savi D, Zullo S, Halili I, Quattrucci S. Clinical effects of DHA supplementation in pediatric patients with cystic fibrosis. 2013;65(4):389-98.
20. Akyıldız N. Temporal kemik ve isitme organının anatomisi. Akyıldız N. ed. Kulak hastalıkları ve mikrocerrahisi 1. Ankara, Bilimsel Tıp Yayınevi 1998:32-5.
32
21. Devranoğlu İ. Dış ve Orta Kulak Cerrahisi. İstanbul, Deomed Yayıncılık 2011:3-4.
22. Sefa K. Kulak Zarı. Curr Pract ORL 2009;5(3):94-104
23. Castagno LA, Lavinksy L. Tympanic membrane healing in myringotomies performed with argon laser or microknife: an experimental study in rats. Rev Bras Otorrinolaringol (Engl Ed) 2006;72:794-99.
24. Stenfeldt K, Johansson C, Hellström S. The collagen structure of the tympanic membrane: Collagen types I, II, and III in the healthy tympanic membrane, during healing of a perforation, and during infection. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2006;132:293-8.
25. Schmidt SH, Hellström S. Tympanic membrane structure-new views: a comparative study. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1991;53:32-6.
26. Oktay MF, Cureoğlu S, Schachern PA, Paparella MM et al. Tympanic membrane changes in central tympanic membrane perforations. American Journal of Otolaryngology–Head and Neck Medicine and Surgery 2005;26:393– 397
27. Güneri EA, Tekin S, Yılmaz O, Ozkara E, et al. The effects of hyalunoric acid, epidermal growth factor and mitomycin in an experimental model of acute traumatic tympanic membrane perforation. Otol Neurotol 2003;24:371-6.
28. Magnuson K, Hermansson A, Hellström S. Healing of tympanic membrane after myringotomy during streptococcus pneumoniae otitis media. Ann Otol Rhinol Laryngol 1996;105:397-404.
29. Johnson AP, Smallman LA, Kent SE. The mechanism of healing of tympanic membrane perforations. Acta Otolaryngol (Stockh) 1990;109:406-15.
30. Spratley J, Hellström S, Eriksson PO, Pais-Clemente M. Early structural tympanic membrane reactions to myringotomy: a study in an acute otitis media model. Acta Otolaryngol 2002;122:479-87.
31. Wang WQ, Wang ZM, Chi FL. Spontaneous healing of various tympanic membrane perforations in the rat. Acta Otolaryngol 2004;124:1141-4.
32. Browder W, Williams D, Lucore P. Effect of enhanced macrophage function on early wound healing. Surgery 1988; 104:224-7.
33
33. Yamaguchi Y, Yoshikawa K. Cutaneous wound healing: an update. J Dermatol 2001;28:521-34.
34. Mondain M, Ryan A. Histological study of the healing of traumatic tympanic membrane perforation after basic fibroblast growth factor application. Laryngoscope 1993;103:312-8.
35. Mattsson C, Johansson C, Hellström S. Myringosclerosis develops within 9 hours of myringotomy. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 1999;61:31-6.
36. Santos PF, Leal MC, Peixoto C, Caldas NS, et al. Otomicroscopic and histologic findings of induced myringosclerosis in rats: a critical study of an experimental model. Rev Bras Otorrinolaringol (Engl Ed) 2005;71:668-74. 37. Whitley R, Castillo N, Hassett JM, Banyas J, Luchette FA Early tracheostomal healing in rabbits with use of various tracheal incisions. Wound Repair Regen 1997; 5:323–328.
38. Kaleli B, Özden A, Aybek Z, Bostancı B. The effect of L-arginine and pentoxifylline on postoperative adhesion formation. Acta Obstet Gynecol Scand. 1998; 77: 377-380.
39. Kisseleva T, Brenner DA Mechanisms of fibrogenesis. Exp Biol Med. 2008; 233:109- 122.
40. Wang D, O’Horo J. Antifibrotic effects of w-3 fatty Acids in the heart: One possible treatment for diastolic heart failure. Trends Cardiovasc Med 2011; 21: 90-95.
41. Çolak ÇA. Deneysel yanık modelinde omega–3 yağ asidi kullanımının yara iyileşmesi ve sistemik enflamasyon üzerine etkisi. Mersin Üniversitesi Tıp Fakültesi Anesteziyoloji ve Reanimasyon Anabilim Dalı Uzmanlık Tezi, Mersin 2010.
42. Dolanbay M. Polikistik over sendromlu hastalarda metformin ve omega-3 yağ asidi tedavisinin androjenler, insülin direnci ve hirsutizm üzerine etkileri. Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Doğum ve Hastalıkları Anabilim Dalı Uzmanlık Tezi, Kayseri 2008.
43. Navaei A. Omega-3 yağ asidinin total venöz yetmezlik oluşturulmuş ada fleplerde yaşayabilirlik üzerine etkisinin araştırılması. Ankara Üniversitesi Tıp
34
Fakültesi Plastik, Rekontrüktif ve Estetik Cerrahi Anabilim Dalı Uzmanlık Tezi, Ankara 2007.
44. Ertek S, Karatan O. Böbrek hastalarının tedavisinde omega-3 yağ asidinin yeri. Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Mecmuası 2004;57(4): 249-255.
45. Chen CT, Liu Z, Ouellet M, Calon F, Bazinet RP. Rapid beta-oxidation of eicosapentaenoic acid in mouse brain: an in situ study. Prostaglandins, Leukotirienes and Essential Fatty Acids 2009;80:157-163.
46. Stillwell W, Wassall SR. Docosahexaenoic acid: membrane properties of a unique fatty acid. Chemistry and Physics of Lipids 2003;126:1–27.
47. Döner F, Yarıktas M, Dogru H, Uzun H, et al. The biochemical analysis of tympanosclerotic plaques. Otolaryngol Head Neck Surg 2003;128:742-5.
48. Selçuk A, Ensari S, Sargın AK, Can B, et al. Histopathological classification of tympanosclerotic plaques. Eur Arch Otorhinolaryngol 2008;265:409-13. 49. Koç A, Üneri C. Ultrastructural comparison between tympanosclerosis and atherosclerosis. Türk Otolarengoloji Arsivi 2005;43:137-44.
50. Forseni Flodin M, Hultcrantz M. Possible inflamatory mediators in tympanosclerosis development. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2002;63:149-54. 51. Akyıldız N. Timpanoskleroz. Akyıldız N. ed. Kulak hastalıkları ve mikrocerrahisi 1. Ankara, Bilimsel Tıp Yayınevi 1998:461-72.
52. Asiri S, Hasham A, al Anazy F, Zakzouk S, et al. Tympanosclerosis: review of literature and incidence among patients with middle ear infection. J Laryngol Otol 1999;113:1076-80.
53. Tos M, Bonding P, Poulsen G. Tympanosclerosis of the ear drum in secretory otitis media after insertion of grommets: a prospective, comparative study. J Laryngol Otol 1983;97:489-96.
54. Slack RW, Maw AR, Capper JW, Kelly S. Prospective study of tympanosclerosis developing after grommet insertion. J Laryngol Otol 1984;98:771-4.
55. McRae D, Gatland DJ, Youngs R, Cook J. Aspiration of middle ear effusions prior to grommet insertion an etiological factor in tympanosclerosis. J Otolaryngol 1989;18:229-31.
