Ağır Metal İyonlarının (Cu
++, Pb
++, Hg
++, Cd
++) Clivia sp. Bitkisi
Polenlerinin Çimlenmesi ve Tüp Büyümesi Üzerine Etkileri
Nazmi GÜR, Aykut TOPDEMİR, Ömer MUNZUROĞLU ve Dursun ÇOBANOĞLU Fırat Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, ELAZİĞ
ngur@firat.edu.tr
Özet
Clivia sp. bitkisinin polen çimlenmesi ve tüp büyümesi üzerine klor tuzu halinde uygulanan kurşun, bakır, civa ve kadmiyum ağır metallerinin etkileri araştırıldı. Her bir ağır metalin 30, 60, 90, 120 ve 240 u.M' lık konsantrasyonları kullanıldı. Elde edilen sonuçlara göre tüm ağır metal konsantrasyonları polen çimlenmesini ve tüp büyümesini değişik oranlarda azalttı. Kullanılan ağır metallerden polen çimlenmesini ve tüp uzunluğunu en fazla engelleyenin kadmiyum, en az engelleyenin ise kurşun olduğu görüldü.
Anahtar Kelimeler: Clivia sp., polen çimlenmesi, polen tüpü, ağır metal.
Effects of heavy Metals (Cu
++, Pb
++, Hg
++, Cd
++) on Pollen Germination
and Tube Growth of Clivia sp.
Abstract
in this study the effects of lead, copper, mercury and cadmium heavy metals, vvhich were applied in the form of chloride salt, on the germination and tube grovvth of Clivia sp pollens. Heavy metal concentrations vvere 30, 60, 90, 120 and 240 u.M. it was found the germination and tube grovvth of pollens was inhibited in different rates for different metals. While cadmium had the most inhibiting effect on germination, lead had the least.
Key words: Clivia sp., pollen germination, pollen tube growth, heavy metals.
1. Giriş
Büyük bölümü antropolojik faktörler sonucu ortaya çıkan hava kirliliğinin önemli sonuçlarından biri de ağır metal k i r l i l i ğ i d i r . Baca ve egzoz gazlarından kaynaklanan atmosferdeki ağır metal kirliliği insan, hayvan ve bitkiler için çeşitli olumsuzlukları da beraberinde getirmiştir.
Havayı kirleten unsurlardan biri olan ağır metallerin bitkilerin vejetatif organlarını makroskobik, mikroskobik ve fizyolojik olarak etkilediği bilinmektedir [1-4]. Bu olumsuz şartlardan bitkilerin sadece vejetatif organları değil aynı zamanda generatif organları da etkilenmektedir. Bunlardan biri de erkek gametofit olan polenlerdir. Polenler bazı araştırıcılar [5,6] tarafından çevre k i r l i l i ğ i n i n bioindikatörü olarak gösterilmektedir. Kadmiyum, kobalt, bakır, çinko, kurşun, nikel ve civa gibi çeşitli ağır metal katyonlarının farklı bitki türlerinde gerek polen çimlenmesini ve gerekse polen tüpü uzamasını engellediği hususunda çok sayıda çalışma mevcuttur [5-10].
N. Gür, A. Topdemir, Ö. Munzuroğlu ve D. Çobanoğlu
Bitki türlerinin çevresel stres faktörlerine olan toleransları aynı değildir. Bu durum bitkinin türüne, stres faktörüne, strese maruz kalma süresine ve strese maruz kalan doku veya organın yapısına göre büyük değişiklikler gösterir. Bitkilerin bu kirleticilere karşı hangi tepkiler verdiğini ve hangi adaptif mekanizmalar geliştirdiğini belirlemek oldukça önemlidir. Bu araştırmada bir süs bitkisi olan Clivia sp. polenlerinin çimlenmesi ve tüp büyümesi üzerine bakır, kurşun, civa ve kadmiyum ağır metallerinin etkileri in vitro koşullarda belirlenmeye çalışılmıştır.
2. Materyal ve Metot
Çalışmada Fırat Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Laboratuar' ında yetiştirilen Clivia sp. bitkilerinin polenleri materyal olarak kullanılmıştır. Bitkinin olgunlaşmış amerlerinden alınan polenler bekletilmeden çimlenmeye bırakılmış, her deney serisinde aynı çiçeğe ait polenler kullanılmıştır. Polenler % 10 sukroz, 100 mg/lt borik asit, 300 mg/lt kalsiyum nitrat, 200 mg/lt magnezyum sülfat, 100 mg/lt potasyum nitrattan oluşan Brewbaker ve Kvvack [11] kültür ortamında çimlendirilmiştir. Polenlerin çimlendirme ortamlarına bakır, kurşun, civa ve kadmiyum ağır metallerinin klor tuzları (CuCl2, PbCl:, HgCl2, CdCl2.H2O)'ndan
(Merck) saf su i l e hazırlanmış çözeltileri eklenmiştir (kontrol i ç i n saf su). Yapılan ön denemelerden elde edilen veriler doğrultusunda her bir ağır metal tuzunun 30, 60, 90, 120 ve 240 f.ıM' l ı k çözeltileri hazırlanmıştır.
Ağır metal tuzlarının her bir konsantrasyonu için ayrı olmak üzere; 2 tanesi deney, 1 tanesi kontrol grubu için steril 3 lam alınıp her lamın iki değişik alanına 50' şer uJ kültür ortamı damlatılmıştır. Deney grubunda bu damlaların her birine 50' şer ul ağır metal tuzu çözeltisi, kontrol grubunda ise aynı hacimde su eklenmiş, daha sonra stereo mikroskop altında, steril bir iğne yardımıyla anterden alınan polenler bu kültür ortamları içerisine homojen bir şekilde dağıtılmıştır [12], Bu şekilde üzerine polen ekimi yapılan lamlar, ıslak filtre kağıdı ile döşenmiş petri kutusu içerisindeki cam çubuklar üzerine yerleştirilmiştir. Petri kutularının kapağı kapatıldıktan sonra 22±1 °C l i k inkübatörde 3 saat bekletilmiştir. Bu sürenin sonunda inkübatörden çıkarılan lamların üzerindeki kültür ortamlarına birer damla %10' luk etanol damlatılarak fikse edilmiştir [12]. Fiksasyon işleminin ardından lamel kapatıldı ve ışı k mikroskobu altında Shivanna ve Rangasvvamy [12] da anlatılan yönteme göre polenlerin çimlenme yüzdeleri ile tüp uzunlukları ölçüldü.
Bütün deney serileri 3 kez tekrar edildi. Araştırmada elde edilen verilerden ağır metal iyonlarının çimlenme ve tüp uzunluğu üzerine etkisi varyans analizi ve takibinde önemli çıkan parametreler i çi n çoklu karşılaştırmalarda Duncan testinden yararlanılmıştır [13]. Bu analizler SPSS programı kullanılarak yapılmıştır [14].
3. Sonuçlar ve Tartışma
Bakır, kurşun, civa ve kadmiyumun farklı konsantrasyonlarında^ klor tuzlarına maruz bırakılan Clivia sp. bitkisi polenlerinin çimlenme yüzdeleri ve polen tüpü uzunlukları Tablo 1-4' de verilmiştir. Her dört ağır metal de gerek polen çimlenmesini ve gerekse tüp büyümesini belli oranlarda engellemiştir.
Kurşun klorürün çimlenme ve tüp uzunluğu üzerine etkisi istatistiki olarak önemli bulunmuştur (P<0,00l). Kurşun konsantrasyonlarının her biri arasındaki istatistiki olarak
önemli (P<0,05) fark tespit edilmiştir. Çalışılan ağır metaller arasında Clivia sp. bitkisi polenlerinin çimlenme yüzdelerini ve tüp uzunluklarını en az etkileyen kurşun olmuştur (Tablo 1). Uygulanan en yüksek kurşun tuzu konsantrasyonunda (240 uM) bile polenlerin çimlenme yüzdesi %40"ın üzerinde gerçekleşmiştir. Genel olarak kurşun tuzu konsantrasyonundaki artış polenlerin çimlenme oranlarını azaltmıştır. Benzer durum polen tüpü uzaması için de tespit edilmiştir. 90 U.M kurşun tuzu uygulanan polenlerin tüp uzunlukları kontrol grubu polenlerinin tüp uzunluklarına göre %47 oranında azalma göstermiştir. 240 kurşun
tuzu konsantrasyonunda tüp uzunluğu 95 u' a düşmüş, yani kontrole göre %80 oranında azalmıştır.
Tablo 1. Kurşun klorür (PbCI2)'ün Clivia sp. bitkisi polenlerinin çimlenme yüzdesi ve tüp uzunluğu
üzerindeki etkileri.
Konsantrasyon ((0.IV1) Çimlenme (%) Tüp Uzunluğu (u,m)
Kontrol 94.26a 473.20a
30 85.12b 406,08b 60 75,32c 315,24c 90 55.34d 250,46d 120 46.28e 141,74e 240 40.82f 95,60f P *** *** ***= P<0.001
a,b,c,d,e,f = Aynı sütundaki farklı harfleri içeren grup ortalamaları arası farklılıklar önemlidir (PO.05).
Tablo 2. Bakır klorür (CuCl:)' ün Clivia sp. bitkisi polenlerinin çimlenme yüzdesi ve tüp büyümesi
üzerindeki etkileri.
Konsantrasyon (u,IVl) Çimlenme (%) Tüp Uzunluğu (u,m)
Kontrol 94.26a 473.20a
30 78.90b 333.72b 60 66.51c 259.70c 90 56.93d 222.88d 120 34.18e 103.70e 240 21.10f 65.50f * * * = PO.001
a,b,c,d,e,f= Aynı sütundaki farklı harfleri içeren grup ortalamaları arası farklılıklar önemlidir (P<0.05). İstatistiki olarak bakır klorürün çimlenme ve tüp uzunluğu üzerine etkisi önemli bulunmuştur (P<0,001). Bakır konsantrasyonlarının her biri arasındaki istatistiki olarak önemli (P<0,05) fark tespit edilmiştir. Bakır tuzunun (CuCI2) gerek polen çimlenmesi ve gerekse tüp
N. Gür, A. Topdemir, Ö. Munzuroğlu ve D. Çobanoğlu
120 uM' l ı k CuCl2 konsantrasyonunda polenlerin çimlenme oranı %40' in altına düşmüştür
(%34,1). Bu oran 60 ve 30 uM bakır tuzu konsantrasyonları için sırasıyla % 66,5 ve % 78,9 olarak tespit edilmiştir. Kontrol gurubunda 473 u olarak ölçülen polen tüpü uzunluğu 240 uM' lık CuCl2 konsantrasyonunda 65 u' a düşmüştür. Bu oran aynı konsantrasyondaki kurşun tuzuna
göre %3l ' l i k bir azalmayı ifade etmektedir.
Tablo 3. Civa klorür (HgCI2)'ün Cltvia sp. bitkisi polenlerinin çimlenme yüzdesi ve tüp büyümesi
üzerindeki etkileri.
Konsantrasyon ((J.M) Çimlenme (%) Tüp Uzunluğu (fim)
Kontrol 94.26a 473.20a
30 77.64b 296.42b 60 59.12c 145,38c 90 55.90c 98,68d 120 28.30d 65,18e 240 17.32e 33,44f *** = P<0.001
a,b,c,d,e,f = Aynı sütundaki farklı harfleri içeren grup ortalamaları arası farklılıklar önemlidir (PO.05). Civanın çimlenme ve tüp uzunluğu üzerine etkisi istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (P<0,001). İstatistiki olarak civa konsantrasyonlarının her biri arasında önemli (P<0,05) fark tespit edilmiştir. Ancak 60 ve 90 uM' l i k konsantrasyonlar arasında çimlenme oranı bakımından istatistiki olarak önemli bir fark bulunmamıştır (P>0,05). Civa (HgCl2)
tuzunun polen çimlenmesi ve tüp uzaması üzerindeki inhibitif etkileri kurşun ve bakır tuzuna göre, genel olarak daha fazla olmuştur (Tablo 3). 30 u.M' lık civa konsantrasyonunda polenlerin çimlenme oranı %77 olarak tespit edilmiştir. Bu oran bakırın aynı konsantrasyonlardaki inhibitif etkilerine büyük bir benzerlik göstermektedir. Ancak 60, 90, 120 ve 240 mM' lı k civa konsantrasyonlarında çimlenme oranı kurşun ve bakıra göre çok daha düşük olarak ölçülmüştür. Bu durum polen tüpü uzamasında da gözlenmiş (Tablo 1, 2, 3) ve en yüksek konsantrasyon olan 240 (.ıM'da tüp uzunluğu bakır ve kurşuna göre çok daha düşük bir değer olan 33.4 u' a kadar düşmüştür.
İstatistiksel olarak Kadmiyum klorürün çimlenme yüzdesi ve tüp uzunluğu üzerine etkisi önemli bulunmuştur (P<0,001). Kadmiyum konsantrasyonlarının her biri arasındaki istatistiki açıdan önemli (P<0,05) fark tespit edilmiştir. Çalışılan ağır metaller arasında kadmiyum (CdCI2.H2O) Clivia sp. polenlerinin çimlenmesini ve tüp uzunluğunu en fazla
engelleyen ağır metal olmuştur ( Tablo 4 ). 90 uMMık kadmiyum tuzu konsantrasyonunda bile çimlenme oranı % 40' in altına düşmüştür. Oysa aynı konsantrasyondaki bakır, kurşun ve civa tuzları için bu oran % 50'nin üzerinde olmuştur. Ayrıca polen tüpü uzunluğu bütün konsantrasyonlarda olduğu gibi en yüksek kadmiyum konsantrasyonu olan 240 uM' da % 24,97 |j.' luk değerle yine her üç ağır metalden daha düşük çıkmıştır.
Tablo 4. Kadmiyum klorür (CdCkH2O)' ün Clivia sp. bitkisi polenlerinin çimlenme yüzdesi ve tüp
büyümesi üzerindeki etkileri.
Konsantrasyon ((iM) Çimlenme (%) Tüp Uzunluğu ((xm)
Kontrol 94.26a 473.20a
30 74,30b 352,86b 60 55,12c 222,68c 90 35,42d 93.54d 120 16.14e 36.58e 240 11.20f 24.97f *** = P<0.001
a,b,c,d,e,f = Aynı sütundaki farklı harfleri içeren grup ortalamaları arası farklılıklar önemlidir (P<0.05). Kullanılan dört ağır metal de polen çimlenmesini ve tüpü uzunluğunu önemli oranlarda engellemiştir. Fakat bu durum ağır metalin türüne ve konsantrasyonuna göre bazı farklılıklar göstermiştir. Genel olarak ağır metal konsantrasyonu ile çimlenme yüzdesi ve tüp uzunluğu arasında ters bir orantı olduğu gözlenmiştir. Artan konsantrasyona bağlı olarak polen çimlenmesi ve tüp uzunluğu düşmüştür. Kadmiyum çimlenme yüzdesini ve tüp uzunluğunu en fazla etkileyen ağır metal, kurşun ise en az etkileyen ağır metal olmuştur. Ağır metallerin farklı bitkilerin polenleri üzerine yaptığı etkiler konusunda yapılan çalışmalar, ağır metallerin polen çimlenmesini ve tüp uzunluğunu farklı oranlarda inhibe ettiğini göstermektedir [5]. Bazı ağır metallerin düşük konsantrasyonlarda bitkilerin büyüme ve gelişmesini teşvik ettiği bilinmektedir. Mesela kadmiyumun çok düşük konsantrasyonlarda (0.0001-0.01 u,g/ml, ) Vida angııstifolia, Vicia tetrasperma, Pistim sativıım, Plantago depressa, ve Medicago hispida bitkilerinde polen çimlenmesi ve tüp gelişimini sitimule ettiği, ancak bu konsantrasyonların üzerine çıkıldığında bu etkinin olumsuzlaştığı rapor edilmiştir [15].
Sovvidish ve Reiss' in [16] ağır metallerin Zambak (Liliurn longiflanım) bitkisi polenleri üzerine etkilerini araştırdıkları çalışmada çimlenme ve tüp büyümesi üzerine en az olumsuz etki gösteren ağır metallerin çinko ve demir, en fazla olumsuz etki gösterenlerin ise bakır, kadmiyum ve civa olduğu gösterilmiştir. Kadmiyum ve kurşunun Pinus nigra, Picea abies ve Çııercus cerris [17], bakırın Crimtm asiaticum ve Kigelia pinnata [18], civanın Pinus resinosa [10]'da polen çimlenmesini ve tüp uzunluğunu engellediği anlaşılmıştır. Dokuz ağır metalin Nicotiana tabacıım bitkisi polenlerinin çimlenme ve tüp büyümesi üzerine yapılan bir araştırmada [9] bakır, nikel, civa ve kadmiyum polenler üzerinde en fazla toksik etkiyi gösteren ağır metaller olarak belirlenmiştir. Bu araştırmanın bulguları civanın kadmiyuma göre daha fazla toksik etkiye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Ancak yaptığımız çalışmanın sonuçlan, iki ağır metal katyonunun birbirine yakın oranlarda da olsa bunun tersini göstermektedir. Çalışılan bitki türlerinin farklılığı bu duruma yol açmış olabilir.
Sonuç olarak bir süs bitkisi olan Clivia sp. polenleri kurşun, bakır, civa ve kadmiyumdan polen çimlenmesi ve tüp oluşumu bakımından olumsuz yönde etkilenmişlerdir. Elde edilen sonuçlar sanayileşme sonucunda ortaya çıkan ağır metal k i r l i l i ğ i ni n generatif bir yapı olan ve bazı araştırıcılar tarafından çevre kirliliğinin biyoindikatörü olarak sayılan polenler üzerine etkilerini göstermesi bakımından dikkat çekicidir.
N. Gür, A. Topdemir, Ö. Mıınzuroğlu ve D. Çobanoğhı
Kaynaklar
1. V.D. Zheljazkov, N.E. Nielsen, Effect of heavy metals on Peppermint and Cornmint. Plant and Soil, 178, 1,59-66, 1996.
2. N Pandey, C.P. Sharma, Effect of heavy metals Co2+,Ni2+ and Cd2+ on growth and metabolism of
cabbage. Plant Science , 163, 753-758, 2002.
3. İ.Türkan, The effect of exhaust gas on seed germination and seedling grovvth of Cucumber
(Cucumber sativus L.) and vvheat (Triticum aestivum L. Supsp. Vulgare). Journal of Turkish
Phytopathology., 17, 2, 81-87, 1988.
4. M.A.B Pahlsson, Toxicity of heavy metals ( Zn,Cu,Cd,Pb) to vascular plants. Water Air Soil Pollution, 47, 287-319, 1989.
5. J.H.B Wolters, M.J.M. Martens. Effects of a i r pollutants on pollen. Botanical Review., 53, 372-414, 1987.
6. V. Balestra, G. Celli, C. Porrini, Bees, honey, larvae and pollen in biomonitoring of atmospheric pollution. Atti IV Congr. naz. "Aerosol biologico" ,Bologna 1417 Novembre Aerobiologia, 8, 122 -126., 1990..
7. R.M. Cox, The sensitivity of pollen various coniferaus and broad-leaved tress to combinations of acidity and trace metals. New Phytologia, 109, 193-201, 1988.
8. Ö. Munzuroğlu, N. Gür, Ağır metallerin Elma (Malııs sylveslris Miller cv.Golden)'da polen çimlenmesi ve polen tüpü gelişimi üzerine etkileri. 24, 677-684, 2000.
9. A.L. Tuna, B. Bürün, İ. Yokaş, E. Çoban,, The effect of heavy metals on pollen germination and pollen tube length in the tobacco plant. Turkish Journal of Biology , 26, 109-113, 2002.
10. W.R. Chaney, R.C. Strickland, Relative toxicity of heavy metals to red pine pollen germination and germ tube elongation. Journal of Environmental Quality, 13, 391-394, 1984.
11. J.L. Brevvbaker, B.H. Kvvack, The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth. American Journal of Botany, 50, 859-865, 1963.
12. K.R. Shivanna, N.S. Rangasvvamy, Pollen Biology Laboratory Manual. Springer Verlag, Berlin, 1992.
13. A. Akgül, Tıbbi araştırmalarda istatistiksel analiz teknikleri ( SPSS uygulamaları ). Yüksek Öğretim Kurumu Matbaası, Ankara, 1997.
14. SPSS for Windows Release 9.0 Standart Version. Copyright SPSS Inc., 1999.
15. Z.T. Xiong, Y.H. Peng, Response of pollen germination and tube grovvth to cadmium with special reference to low concentration exposure. Ecotoxicology and Environmental Safety, 48, 51-55, 2001. 16. K..B. Sovvidis, H.D. Reiss, The effects of heavy metals on pollen-tube grovvth and ultrastructure.
Protoplasma, 185 (3-4), 113-122, 1995.
17. Z., Holub. G. Ostrolucka. The effect of cadmium ( I I ) and lead ( I I ) on pollen gennination and pollen tube grovvth in Oııeıvıts cerris, Pinııs nigra and Picea ağabeyes. Biologia (Bratisl.), 38, 393-400, 1984.
18. F.W. Martin, in vitro measurement of pollen tube grovvth inhibition, Plant Physiology, 49, 924-925, 1972.
