T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ
ANABİLİM DALI
PREPUBERTAL DÖNEMDE 2,3,7,8-
TETRAKLORODİBENZO-p- DİOKSİN (TCDD) İLE OLUŞTURULMUŞ TESTİKÜLER HASAR ÜZERİNE
CHRYSİN’İN ETKİLERİ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
SONGÜL YILMAZ 2017
İTHAF SAYFASI
TEŞEKKÜR
Yüksek lisans eğitimim süresince tecrübelerinden faydalandığım,
değerli danışman hocam sayın Prof. Dr. Neriman ÇOLAKOĞLU’na,
Eğitimim süresince beni yönlendiren, iyi niyetleriyle her zaman
destek olan ve her an bilgi birikimlerinden faydalandığım Fırat Üniversitesi
Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Başkanı sayın Prof.
Dr. İ. Enver OZAN’a ve değerli Öğretim Üyeleri sayın Prof. Dr. Leyla
CANPOLAT KOYUTÜRK’e, Prof. Dr. Dürrin Özlem DABAK’a, Yrd.
Doç. Dr. Tuncay KULOĞLU’na, Yrd. Doç. Dr. Nevin KOCAMAN’a,
Tez çalışmam da yardımcı olarak katkıda bulunan Arş. Gör. Nalan
KAYA’ya, Arş. Gör. Ahmet TÜRK’e ve Arş. Gör. Dr. Elif ERDEM
GÜZEL’e, Bio. Osman Fatih YILMAZ ile yüksek lisans arkadaşım K. Esin
TAŞDEMİR’e,
Tezime sağladığı finansmandan ötürü Fırat Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Projeleri Birimi (FÜBAP) ’ne,
Son olarak yaşamım boyunca desteklerini esirgemeyen değerli
İÇİNDEKİLER
BAŞLIK SAYFASI ... i
ONAY SAYFASI ... ii
BEYAN SAYFASI ... iiii
İTHAF SAYFASI ... iv
TEŞEKKÜR ... v
İÇİNDEKİLER ... vi
TABLOLAR LİSTESİ ... ix
ŞEKİLLER LİSTESİ ... x
KISALTMALAR LİSTESİ ... xii
1.ÖZET ... 1
EFFECTS OF CHRYSIN ON TESTICULAR DAMAGE INDUCED BY 2,3,7,8-TETRACHLORODIBENZO-p-DIOXIN (TCDD) DURING PREPUBERTAL PERIOD ... 5
2. ABSTRACT ... 5
3. GİRİŞ ... 8
3.1. TESTİS ... 8
3.1.2. Testis Embriyolojisi ... 10 3.1.3. Testis Fizyolojisi ... 12 3.1.4. Testis Histolojisi ... 14 3.1.4.1. Testisler ... 14 3.1.4.2. Seminifer Tübüller ... 15 3.1.4.3. Sertoli Hücreleri ... 16 3.1.4.4. Leydig Hücreleri ... 17 3.1.4.5. Spermatogenez ... 18 3.1.4.6. Spermiyogenez ... 20 3.2. TCDD (2,3,7,8- tetraklorodibenzo-p-dioksin)... 22
3.2.1. Dioksin ve Benzeri Bileşikler ... 22
3.2.2. Toksik Eşdeğer Faktörleri ve Toksik Eşdeğerlikler ... 23
3.2.3. Dioksin Kaynakları ve Oluşumu ... 25
3.2.4. Dioksinin Etki Mekanizması ... 27
3.2.5. Dioksinlerin Toksikokinetikleri ... 29
3.2.5.1. Emilim ve Dağılımı ... 29
3.2.5.2. Dioksinin Atılımı ... 30
3.2.6. Dioksinlerin Zehirlilikleri ... 31
3.2.7. Tolere Edilebilir Doz ... 34
3.2.8. Toksisite Durumunda Tedavi ... 35
3.3. Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller ... 36
3.3.1. Memelilerdeki Başlıca Serbest Radikaller ... 37
3.4. Apoptozis ... 40
3.5. Antioksidan Savunma Sistemleri ... 41
3.6. Flavonoidler ... 42
3.6.1. Chrysin ... 43
3.7. Araştırmanın Amacı ... 45
4.1.Deney Hayvanlarının Beslenmeleri ve Barındırılmaları ... 46
4.2. Deney Gruplarının Oluşturulması ve Deneysel Uygulamalar ... 48
4.3. Doku Örneklerinin Alınması ... 49
4.4. Organ Ağırlıklarının Ölçülmesi ... 49
4.5. Histolojik Değerlendirmeler ... 49
4.6. TUNEL Metodu... 51
4.7. Biyokimyasal Analizler ... 53
4.8. İstatistiksel Analiz ... 53
5. BULGULAR ... 54
5.1.Vücut Ağırlık Değişim Yüzdesi ... 54
5.2. Rölatif testis ağırlığı ... 55
5.3. Histolojik Değerlendirmeler ... 56 5.4. TUNEL Bulguları ... 62 5.5.Biyokimyasal Analizler ... 67 6.TARTIŞMA ... 68 7. KAYNAKLAR ... 79 8. ÖZGEÇMİŞ ... 92
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 1: Dioksin/Furan bileşiklerinin çeşitli ortamlarda ki yarılanma süreleri ... 27
Tablo 2: Farklı Canlılarda Dioksinin Yarılanma Ömürleri ... 31
Tablo 3: Maruz Kalınan Yüksek/Düşük Doz Dioksinin Yan Etkileri... 32
Tablo 4: Sıçanlara verilen pelet yemin bileşimi ... 47
Tablo 5: Histolojik İnceleme İçin Doku Hazırlama Basamakları ... 50
Tablo 6: TUNEL boyaması işlem basamakları. ... 52
Tablo 7: Vücut ağırlık değişim yüzdesi ... 54
Tablo 8: Rölatif testis ağırlığı (gr) ... 55
Tablo 9: TUNEL Boyama, Semikantitatif Analiz ... 63
Tablo 10: Apoptotik indeks (%) ... 63
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1: Testisin anatomik görünümü ... 10
Şekil 2: Primordiyal germ hücrelerinin göçü ve gonadal farklılık ... 12
Şekil 3: Testisin histolojik görünümü ... 16
Şekil 4: Spermatogenez ... 19
Şekil 5: TCDD’in kimyasal yapısı ve üç boyutlu görünümü ... 25
Şekil 6: Antioksidanların Sınıflandırılması ... 42
Şekil 7: Chrysin’nin molekül yapısı ... 4 4 Şekil 8: Vücut ağırlık değişim yüzdesi ... 55
Şekil 9: Rölatif testis ağırlığı (gr) ... 56
Şekil 10: Kontrol grubu. Seminifer tübül germinal epitelinde (↔) yer alan spermatogenik seri hücreleri ve Sertoli hücreleri ve interstisyel alanda yer alan Leydig hücreleri (→) normal yapıda gözlenmekte. Masson’s Üçlü Boyası x 200 ...57
Şekil 11: Kontrol grubu. Normal görünümlü seminifer tübül germinal epiteli (↔) ve interstisyel Leydig hücreleri (→). Periodic Acid Schiff x 200 ... 58
Şekil 12: TCDD grubu. Seminifer tübül epitelini oluşturan hücreler arasında ayrılmalar. Masson’s Üçlü Boyası x 200 ... 58
Şekil 13: TCDD grubu. Seminifer tübül epitelinde vakuolar dejenerasyon (v) ve
atrofi (→). Periodic Acid Schiff x 200... 59
Şekil 14: TCDD grubu. Seminifer tübül epitelinde vakuolar dejenerasyon (v) ve
atrofi (*). Periodic Acid Schiff x 200... 59
Şekil 15: TCDD grubu. Seminifer tübül epitel boyunda kısalma (→), multinüklear
dev hücre (→), mayoz bölünmenin belli aşamalarında duraksamış hücreler (→)
ayırt edilmekte. Periodic Acid Schiff x 200 ... 60
Şekil 16: TCDD+CH grubu. Multinüklear dev hücre (→) ve heterokromatik
çekirdekli germ hücreleri (→) dikkati çekmekte. Masson’s Üçlü Boyası x 200 .. 60
Şekil 17: TCDD+CH grubu. Normal görünümlü seminifer tübüllerin arasında bazal
membranında ayrılma(→) ve germinal epitelinde dejenerasyon (*) olan seminifer
tübül. Periodic Acid Schiff x 200 ... 61
Şekil 18: CH grubu. Normal görünümlü seminifer tübül germinal epiteli (→) ve
interstisyel Leydig hücreleri (→). Masson’s Üçlü Boyası x 200 ... 61
Şekil 19: CH grubu. Normal görünümlü seminifer tübül germinal epiteli (→) ve
interstisyel Leydig hücreleri (→). Periodic Acid Schiff x 200 ... 62
Şekil 20: Kontrol grubu. Az sayıda TUNEL-pozitif apoptotik germ hücresi (→).
Şekil 21: TCDD grubu. TUNEL-pozitif apoptotik germ hücreleri (→) ve seminifer
tübül epitelinde dejenerasyon (*) ve germ hücreleri arasında ayrılma (→). TUNEL
x200 ... 64
Şekil 22: TCDD grubu. TUNEL-pozitif apoptotik germ hücreleri (→) ve
multinüklear dev hücreler (→). TUNEL x200 ... 65
Şekil 23: TCDD grubu. TUNEL-pozitif apoptotik germ hücrelerinin yaygınlığı
(→) ve dejenere germinal epitel (*) dikkati çekmekte. TUNEL x200 ... 65
Şekil 24: TCDD+ CH grubu. TUNEL-pozitif apoptotik germ hücreleri (→).
TUNEL TUNEL x200 ... 66
Şekil 25: CH grubu: Az sayıda TUNEL-pozitif apoptotik germ hücresi (→).
KISALTMALAR LİSTESİ
ABP : Androjen bağlayıcı protein AhR : Aril hidrokarbon reseptörü AI : Apoptotik indeks
ARNT : Aril hidrokarbon reseptör nüklear translokator CH : Chrysin
DNA : Deoksiribonükleik asit EDC : Endokrin bozucu kimyasallar EPA : Çevre Koruma Ajansı ETZ : Elektron transport zinciri FSH : Follikül stimüle edici hormon GnRH : Gonadotropin serbestleyici hormon GSH-Px : Glutatyon peroksidaz
H&E : Hematoksilen- Eozin HSC : Hepatik yıldız hücreleri
IARC : Uluslar Arası Kanser Araştırmaları Kuruluşu IUPAC : Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliği LH : Luteinizan hormon
LPO : Lipid peroksidasyonu
NADPH : Nikotinamid adenin dinükleotid fosfat- hidrojen NO : Nitrik oksit
NOS : Nitrik oksit sentaz PAS : Periyodik Asit Schiff
PBS : Phosphate buffered saline PCB : Poliklorlu bifeniller
PCDD : Poliklorludibenzo-para-dioksinler PCDF : Poliklorludibenzo furanlar
PUFA : Çoklu doymamış yağ asitleri PVC : Polivinil klorür
RNS : Reaktif nitrojen türleri ROS : Reaktif oksijen türleri OH+ : Hidroksil radikali
ONOOH : Peroksinitrit
TCDD : 2,3,7,8- tetraklorodibenzo-p-dioksin TDI : Tolere edilebilir günlük alım miktarı TEF : Toksik eşdeğerlik faktörleri
TEQ : Toksik ekivalent
TUNEL : Terminal deoxylnucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP)-biotin nick end-labeling
1. ÖZET
2,3,7,8- tetraklorodibenzo-p-dioksin (TCDD) çevrede uzun süre kalıcılığı
olan, yapısal olarak aynı mekanizmayla toksisite oluşturup, canlılarda biyolojik
olarak benzer etkiler gösterebilen 75 farklı bileşik içeren dioksin ailesinin
prototipidir. Bu bileşikler içinde en zehirli yapıda olması nedeniyle TCDD toksisite
çalışmalarında standart olarak kullanılmaktadır. Araba egzozlarında ve sigara
dumanında bulunan TCDD, insektisitlerin üretiminde, belediyelere ait katı atıkların
yakılması esnasında bir yan ürün olarak ortaya çıkan çevresel bir kirleticidir.
İnsanlar TCDD’ yi çoğunlukla beslenme yoluyla almakta ve yıkılabilir özelliğinin
düşük olması nedeniyle kanda ve yağ dokusunda birikme eğilimi göstermektedir.
Uluslararası Kanser Araştırmaları Kuruluşu TCDD’yi grup I kanserojen olarak
tanımlamıştır. TCDD, membran fosfolipitlerinden araşidonik asidin salınımını
artırarak enflamasyona ve reaktif oksijen türleri (ROS)’nin üretimine yol açarak
oksidatif strese dolayısıyla hücre hasarına neden olur.
Doğal bir flavon olan Chrysin (CH) antioksidan, antiinflamatuar,
antiapoptotik, antiviral özelliklere sahiptir. CH’nin damar koruyucu ve spasmolitik
Bu çalışmada TCDD’nin testis dokusunda meydana getirmesi muhtemel
oksidatif hasara karşı, güçlü bir antioksidan olan CH’nin etkilerinin incelenmesi
amaçlanmıştır.
Bu deneysel çalışmada 4 haftalık, ortalama 105-130 g ağırlıklarındaki 28
adet Wistar-Albino cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar grup I (Kontrol), grup
II (TCDD uygulanan), grup III (TCDD + CH uygulanan) ve grup IV (sadece CH
uygulanan ) olmak üzere rastgele 4 gruba ayrıldı.
Grup II ve grup III’e haftada bir kez 25 μg/kg TCDD intraperitonal (ip.)
olarak uygulandı. Ayrıca grup III ve grup IV’e günlük 50 mg/kg zeytinyağında CH
çözdürülerek oral gavaj yolu ile verildi.
5 haftalık deney süresi sonunda tüm gruplardaki sıçanlar tartıldıktan sonra
anestezi altında dekapite edildi. Testis dokuları alınıp hızlıca tartıldı ve Bouin’s
solüsyonunda tespit edildi. Biyokimyasal incelemeler için kan örnekleri
santrifüjlenip, elde edilen serumlar daha sonra yapılacak olan testosteron tayini için
-20 0C de saklandı. Testis dokularından histolojik inceleme için parafin bloklar
hazırlandı. Parafin bloklardan 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Alınan kesitler
histokimyasal ve TUNEL teknikleri kullanılarak boyandı.
TCDD ve TCDD+CH gruplarındaki sıçanların ortalama vücut ağırlık
karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı bir düşüş gözlendi. CH grubu ile
kontrol grubu arasındaki fark ise istatistiksel açıdan önemsiz bulundu.
Işık mikroskop incelemesinde, kontrol grubuna ait testis dokularında
seminifer tübül germinal epitelini oluşturan spermatogenik seriye ait hücreler ve
Sertoli hücreleri, interstisyel alan ve bu alanda yer alan Leydig hücreleri normal
yapıda izlenirken TCDD uygulanan deneklere ait dokularda, germinal epitelde
atrofi, vakuolar dejenerasyon, germ hücreleri arasında ayrılma, spermatid dev
hücreleri ve bazı tübüllerde mayoz bölünmenin belli aşamalarında duraksama ayırt
edildi. TCDD toksisitesine karşı koruyucu amaçla CH uygulanan gruba ait
testiküler dokuda nispeten koruyucu etki sağlandı. Sadece CH uygulanan gruba ait
kesitlerde testis dokusu kontrol grubu gibi normal görünümlü olarak ayırt edildi.
Apoptotik hücre ölümünün belirlenmesi için TUNEL tekniği kullanılarak
yapılan boyamanın ışık mikroskopta incelenmesinde, kontrol grubu kesitlerinde
TUNEL (+), TCDD grubunda TUNEL (+++) , TCDD + CH grubunda TUNEL (+),
sadece CH uygulanan grupta ise TUNEL (+) yaygınlığında işaretlenme gözlendi.
TCDD ve TCDD+CH uygulanan gruplardaki sıçanların serum testosteron
seviyelerinde, kontrol ve CH grubu ile kıyaslandığında anlamlı bir azalma gözlendi.
CH grubu ile kontrol grubu arasındaki fark ise istatistiksel açıdan önemsiz bulundu.
Sonuç olarak yapılan bu deneysel çalışmada TCDD toksisitesinin serum
Ayrıca seminifer tübül germinal epitelinde atrofi ve apoptotik hücre ölümüne yol
açarak son derece önemli hasara yol açtığı gözlendi. Antioksidan özelliği ile ön
plana çıkan CH’in bu olumsuz etkileri nispeten azalttığı saptandı. Bu bulgular,
çevresel bir kirletici olan TCDD’nin erkek üreme sağlığını menfi anlamda
etkileyebileceğini ve buna karşı önlemler alınması gerekliliğinin olduğunu
göstermektedir.
EFFECTS OF CHRYSIN ON TESTICULAR DAMAGE INDUCED BY 2,3,7,8-TETRACHLORODIBENZO-p-DIOXIN (TCDD) DURING
PREPUBERTAL PERIOD
2. ABSTRACT
2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) that persists in the environment for a long time is a prototype of dioxin family that contains 75 distinct compounds having similar biological effects on organisms and causing toxicity with same structural mechanism. TCDD has been employed as a standard in toxicity assays due to its characteristic of being the most toxic one among those compounds. TCDD existing also in exhaust and cigarette smoke is an environmental pollutant which is a by-product of insecticide production and solid waste combustion of municipalities. People generally take TCDD through nutrition and it tends to accumulate in blood and adipose tissues due to its low degradability. International Cancer Research Foundation has described TCDD as group I carcinogenic. TCDD causes inflammation by increasing arachidonic acid from membrane phospholipids and oxidative stress and also cell damage by producing reactive oxygen species (ROS).
Being a naturally occurring flavone, chrysin (CH) has antioxidant, anti-inflammatory, anti-apoptotic and anti-viral effects. It is also known that chrysin has vascular protective and spasmolytic effects.
The present study was designed to investigate the effects of CH on possible oxidative testicular damage induced by TCDD.
In this experimental study, 4-week-old 28 Wistar-Albino male rats about 105-130 g weight were used. The rats were grouped into four random groups,
i.e. Group I (Control), Group II (TCDD-treated), Group III (TCDD+CH-treated) and Group IV (only CH-treated).
Group II and III were treated with 25 μg/kg TCDD once a week intraperitoneally (ip.). In addition, Group III and IV were treated daily with 50 mg/kg CH dissolved in olive oil through gavage feeding.
After 5 weeks, all rats were weighed and decapitated under anaesthesia. Testicle tissues were weighed immediately and fixated in Bouin’s solution. For biochemical examinations, blood samples were centrifuged and the serums were stored at -20 for subsequent testosterone assay. Paraffin blocks from testicle tissues were prepared for histological examination. 5 μm-thick cross-sections of paraffin blocks were prepared and stained by using histochemical and TUNEL techniques.
When compared with the control group, the groups of TCDD and TCDD+CH showed statistically significant decrease in the percentage of body weight variation and relative testicle weight. The difference between the groups CH and control was found to be insignificant statistically.
During the microscope examination, Spermatogenic cells forming seminiferous tubule germinal epithelium and Sertoli cells, interstitial region and Leydig cells were found to have normal appearance in testicular tissues of the control group while atrophy in germinal epithelium, vacuolar degeneration, separation among germ cells, giant spermatid cells and arrest in certain stages of meiosis in some tubules were distinguished in tissues of TCDD-treated group. Relative protective effect was observed in testicular tissues of the CH-treated group against TCDD toxicity. Testicular cross-sections of only CH-treated group was observed normally as in control group.
Apoptotic cell death was examined by TUNEL staining and the labelling results were observed as TUNEL (+) for control group, TUNEL (+++) for TCDD group, TUNEL (+) for TCDD+CH and TUNEL (+) for CH group.
When compared to the control and CH groups, a significant decrease in serum testosterone levels of the rats treated with TCDD or TCDD+CH was observed. The difference between the control and CH group was found to be insignificant statistically.
In conclusion, it was determined that TCDD toxicity decreased serum testosterone level and had a negative impact on spermatogenesis. Moreover, it caused serious cell damage that contain atrophy in seminiferous tubule germinal epithelium and apoptotic cell death. Prominent with its antioxidant effect, CH relatively reduced these negative impacts. These findings suggest that TCDD, an environmental pollutant, can affect male reproductive health individually and there is necessity for taking precautions against this threat.
3. GİRİŞ 3.1. TESTİS 3.1.1. Testis Anatomisi
Funiculus spermaticus’a asılı durumda bulunan bir çift testis, scrotumun
içinde bulunur. Testisler 4-5 cm uzunluğunda, 2.5 cm genişliğinde, 3 cm
kalınlığında ve ortalama 10-14 gr ağırlığındadır.
Testisin iki yüzü (facies medialis ve facies lateralis); iki kenarı (margo
anterior ve margo posterior) ve iki ucu (extremitas superior ve extremitas
inferior) bulunur.
Testisin ön kenarı, her iki yüzü ve uçları düz ve konveks olup, visseral
periton ile kaplıdır. Arka kenarın yalnızca lateral kısmı peritonla örtülüdür.
Peritonsuz olan medialine ise epididimis tutunur. Bu bölgeden damarların sinir ve
kanal yapıları geçer.
Testis lamina visceralis (epiorchium), tunica albuginea ve tunica
vasculosa olmak üzere üç tabaka ile örtülüdür;
Lamina visceralis (epiorchium): Epididimisin büyük kısmı ile arka kenarının
Testis ve epididimisin arka kenarlarından fascia spermatica internanın iç yüzüne
geçen kısmına lamina parietalis adı verilir.
Tunica albuginea: Testisleri dıştan saran sıkı yapılı fibröz bir tabakadır. Bu
tabakayı oluşturan beyaz fibröz demetler birbirleri içine rastgele uzanırlar. Arka
kenarı hariç, dıştan tunica vaginalis testisin lamina visceralisi (epiorchium) ile
çevrilidir. Peritonun bulunmadığı arka kenara ise epididimis tutunur. Bu kısımdan
damar ve sinirler girip çıkar. Arka kenarda tunica albuginea tabakası, testisin içine
doğru vertikal yarım bir bölme şeklinde kalın bir uzantı gönderir. Bu bölme
mediastinum testis olarak adlandırılır.
Tunica vasculosa: Tunica albuginea tabakasının iç kısmını ve testisin içindeki tüm
lobuli testisi saran damar ağı tabakasıdır. Damarlar arasında kalan kısımlar ise
gevşek bağ doku yapısındadır. Tunica vasculosa tunica albuginea’nın iç yüzünü ve
tüm bölmelerin yüzlerini döşer (1).
Septa radiata adı verilen oluşum mediastenden tunica albuginea’nın iç
yüzeyine, sayıları 200-300 arasında değişen koni biçiminde lobülleri oluşturmak
üzere tutunur. Bu lobüllerin her biri bir veya daha fazla sayıda seminifer tübülden
oluşur. Tübüller yaklaşık 1 metre uzunluğundadır. Tübüllerin arasında bulunan
gevşek bağ doku içerisinde testosteron üreten interstisyel hücreler (Leydig
(tubuli rekti) ve rete testisi meydana getirirler. Rete testisten, 12-20 adet duktuli
efferentes çıkar. Epididimise girdikten sonra duktuli efferentesler genişleyerek daha
kıvrımlı hale gelirler ve lobülleri oluşturur. Bu lobüllerin her birinden çıkan
kanallar, tek bir epididim kanalına drene olurlar. Yaklaşık 6 metre uzunluğunda
olan bu kanalın çapı ve kalınlığı artarak vaz deferensi oluşturur (2) (Şekil 1).
Şekil 1: Testisin anatomik görünümü (3).
3.1.2. Testis Embriyolojisi
Cinsiyet fertilizasyon sonrası kromozomal olarak bellidir. Ancak intrauterin
altıncı haftaya kadar cinsel açıdan farklılanmamış gonad karma bir yapıdadır. İlkel
cinsiyet bezleri ilk kez 5. ve 6. haftada ürogenital tümsek diye bilinen ilkel nefrik
Altıncı haftada gonadlar, yüzeyel germinal epitel ve internal blastemden
oluşmaktadır. Blastem kitlesi bazal membrandan serbestlenen yüzeyel epitelin içe
kısımlara doğru proliferasyonu ile meydana gelmektedir. Yedinci hafta içinde
gonad, testis ya da overe özgü bir yapılara farklılaşmaya başlar.
Eğer farklılaşma testis yönünde olacaksa bez büyür, kısalır ve bir miktar
kaudale yerleşir. Mezonefrozla testis arasındaki bağlantı gonadal mezentere
dönüşür. Bu mezenter ise mezorşiyum diye bilinmektedir. Germinal epitel hücreleri
daha alt kısımda yer alan mezenkimin içine doğru prolifere olur ve kordona benzer
yapılar meydana getirir. Bu yapılar radiyal olarak yerleşmiş olup, rete testisin ilkel
hücreleri olarak ortaya çıkan yoğun bir blastem kitlesinin bulunduğu mezorşiyuma
yaklaştıkça birleşirler. Testis kordonları 3-4 benzer kordona bölünür ve bu
kordonlar da sonunda spermatozoaların üretileceği seminifer tübüllere
farklılaşırlar. Fetal yaşamın üçüncü ayına doğru testisler retroperitoneal mesafede
yalancı pelviste yerleşik hale geçerler. Testisin alt kısmından çıkan bir
fibromüsküler bant gelişmekte olan ön karın duvarı kaslarının arasından geçerek
skrotal kabarıklığın subkutan dokusunda sonlanır. Periton testisin alt kısmının
aşağısında, fibromüsküler bandın ön yüzeyi boyunca divertikül biçiminde fıtıklaşır,
ve son olarak anterior karın kaslarının arasından skrotal torbaya ulaşır. Yedinci aya
skrotal torbanın arkasından inguinal kanala girerek sekizinci ayın sonunda skrotal
keseye ulaşır (4) (Şekil 2).
Şekil 2: Primordiyal germ hücrelerinin göçü ve gonadal farklılık (5)
3.1.3. Testis Fizyolojisi
Erkek ve kadında cinsel fonksiyonlar hipotalamus ve hipofizden
(adenohipofiz) salgılanan hormonlar tarafından kontrol edilir. Kontrol,
hipotalamustan salgılanan gonadotropin serbestleştirici hormon (GnRH) ile başlar.
GnRH, adenohipofizden glikoprotein yapısında olan lüteinize edici hormon (LH)
ve follikül stimüle edici hormon (FSH) salgılanmasını sağlar. LH ve FSH,
gonadotropik hormonlar olarak bilinirler. LH, testislerde intersitisyel alanda
bulunan Leydig hücrelerinden testosteron salgılanmasını uyarır. FSH ise
spermatogenezisi uyarır (6).
GnRH 10 amino asit uzunluğunda bir peptid olup, hipotalamusun arkuat
nükleusunda yer alan nöron gövdelerinden salgılanır. GnRH, hipotalamus-hipofiz
portal sistemi damarlarına serbestlenir. Portal kan yoluyla ön hipofize taşınır ve LH
ve FSH’nın salgılanmasını uyarır (7).
Sağlıklı erişkin bir erkekte her 1-3 saatte bir, birkaç dakika süreyle, pulsatil
GnRH salınımı gerçekleşir (6).
Testislerden testosteron üretimi, sadece hipofiz bezinden salgılanan LH’nın
uyarısı ile gerçekleşir. Ayrıca üretilen testosteron miktarı ile uyarıcı LH miktarı
yaklaşık doğru orantılıdır.
Testislerde olgun Leydig hücreleri normalde postnatal birkaç haftaya kadar
bulunur; daha sonra yaklaşık 10 yaşına kadar görülmezler. Ancak herhangi bir
yaştaki erkek çocuğa saflaştırılmış LH verilmesi veya puberte döneminde LH
üretiminin artması, testislerdeki fibroblastlara benzeyen interstisyel hücrelerin,
işlevsel Leydig hücrelerine dönüşmesine neden olur (7).
GnRH, LH ve FSH salgısı testosteron tarafından negatif feedback ile
üretimini inhibe ederek hem de adenohipofizi doğrudan etkileyerek baskılar. GnRH
salgısının azalması, LH ve FSH salgısının azalmasına neden olur. LH’ın azalması
da testosteron üretimini inhibe eder. Aksine testosteron düzeyinin azalması ise
hipotalamustan GnRH salgısını arttırır. Bu da LH ve FSH üretimini uyarır, böylece
testosteron düzeyi yükselir (6).
3.1.4. Testis Histolojisi
3.1.4.1. Testisler
Erkek üreme sistemi; bir çift testis, çok sayıda boşaltım kanalı ve yardımcı
üreme bezlerinden oluşur. Testis sürekli bölünen spermatogenik kök hücreleri içerir
(8).
Her bir testisi dışarıdan saran tunica albuginea arka yüzden testisin iç
kısımlarına doğru uzanarak mediastinum testisi meydana getirir. İnce bağ dokusu
olan septum, mediastinum testisten içeriye doğru uzanır ve testisleri her biri 1 ile 4
sarmal yapıdaki seminifer tübülleri kapsayan yaklaşık 250 adet bölmeye veya
testiküler lobçuklara ayırır. Her bir seminifer tübül de çoğalan germ hücreleri,
çoğalma göstermeyen destek (sustentakular) veya Sertoli hücrelerini içeren çok
katlı germinal epitel tabakasından oluşmaktadır. Seminifer tübülde, germ hücreler
Her bir seminifer tübül, fibroblast, kas hücrelerine benzer hücreler, sinir
hücreleri, kan ve lenfatik damarlar ile örtülüdür. Ayrıca, seminifer tübüllerin
arasında interstisyel (ara) hücreler (Leydig) olarak adlandırılan epiteloid hücre
kümesi de mevcuttur. Bu hücre kümeleri testosteron hormonu üretir ve salgılar (9).
3.1.4.2. Seminifer Tübüller
Seminifer tübüller yaklaşık olarak 150-250 m çapında ve 30-70 cm uzunluğunda, kompleks yapıda çok katlı epitel ile örtülüdür. Bir testiste bulunan
tübüllerin toplam uzunluğu yaklaşık 250 m civarındadır. Her bir tübülün son
kısımlarında lümen daralır ve düz tübüller ya da tubuli rekti adıyla bilinen kısa
segmentler halinde devam eder. Bu düz tübüller, seminifer tübülleri rete testis adı
verilen, epitel ile döşeli kanalların oluşturduğu yapıya bağlar. Seminifer tübüller
Şekil 3: Testisin histolojik görünümü (5). 3.1.4.3. Sertoli Hücreleri
Sertoli hücreleri spermatogenik serideki hücreleri kısmi olarak saran
piramidal şekildeki hücrelerdir. Tabanları bazal laminaya tutunur, apikal kısımları
ise sıklıkla seminifer tübülün lümenine uzanır. Sertoli hücreleri birbirlerine sıkı
bağlantılarla bağlanmışlardır (10).
Sertoli hücreleri birçok önemli görev üstlenmektedir:
Gelişmekte olan sperm hücrelerine (spermatid) besin, fiziksel destek ve koruma sağlamak,
Spermatogenezis esnasında meydana gelen sitoplazma artıklarını (residual cisimcikler) fagosite etmek,
Seminifer lümen içerisine olgun spermin atılmasını sağlamak,
Spermin beslenmesi ve boşaltım kanalları içerisinde transportu için gerekli olan fruktozdan zengin testiküler sıvıyı salgılamak,
Testosterona bağlanarak konsantrasyonunu arttıran androjen bağlayıcı proteini (ABP) üretmek,
Hipofizden follikül uyarıcı hormon (FSH) salınımını önleyen inhibin hormonunu üretmek.
Gelişim sırasında Müller kanallarının gerilemesini sağlayan glikoprotein yapısında Müllerian inhibe edici hormonu (AMH) üretmek (9).
3.1.4.4. Leydig Hücreleri
İntersitisyel alanda eozinofilik Leydig hücreleri yer alır. Bu hücrelerin
sitoplazması köpüksü bir görünüme sahiptir. Bu görünümden, testosteron sentezi
için depolanan kolesterole bağlı olarak yüksek düzeyde lipit sorumludur. Büyük,
polihedral yapıdaki bu hücrelerde bir ya da iki nükleolus içeren bir nükleus
mevcuttur. Hücrelerin yüzeyinde çok sayıda mikrovillus bulunur. Bu hücreler
Sitoplazmalarında steroid salgılayan hücrelere özgü bir özellik olan yoğun
düz endoplazma retikulumu içerirler (11). Bu hücreler, mitokondrilerde ve düz
endoplazmik retikulumda bulunan enzimler aracılığıyla testosteronu üretirler (12).
3.1.4.5. Spermatogenez
Primordiyal germ hücreleri testise göç ederek spermatogonyum olarak
isimlendirilen olgunlaşmamış germ hücrelerine dönüşürler. Spermatogonyumlar
puberte ile birlikte mitoz bölünmeler geçirerek prolifere olurlar ve olgun spermi
oluşturmak üzere farklılaşırlar (7).
Sperm üretimi seminifer tübüllerde gerçekleşir. Seminifer tübüllerin
duvarını germ hücreleri (spermatogonyum) ve Sertoli hücreleri döşer. Germ
hücreleri sperm yapımından sorumludur. Sertoli hücreleri ise germ hücrelerinin
etrafında destek dokusunu oluşturur (6).
Spermatogenezin ilk evresinde, spermatogonyumlar seminifer tübülün
lümen merkezine doğru Sertoli hücreleri arasına göç ederler. Sertoli hücreleri tüm
tübül lümeni boyunca gelişmekte olan spermatogonyumların etrafını sararak onlara
zengin sitoplazmik ortam sunar (7).
Germinal epitel içinde çok sayıda spermatogenezis döngüsü eş zamanlı
olarak gerçekleşir. Spermatogenetik döngünün süresi ortalama 74 saattir.
sitoplazmik köprülerle bağlı olup spermatogenez sürecinden birlikte geçerler (4)
(Şekil 4).
Germ hücreleri mayoz bölünme sonucunda 46 kromozomlu diploid (2n)
halden 23 kromozomlu haploid (1n) hale gelir. Böylece sperm, yine 23 kromozom
içeren haploid (1n) yumurta hücresi (ovum) ile birleşerek 46 kromozomlu yeni bir
bireyin (zigot) oluşmasını sağlar (6).
3.1.4.6. Spermiyogenez
Spermatidden spermiyum oluşum sürecidir. Erken dönemde yuvarlak şekilli bir
hücre olan spermatid, spermiyogenez boyunca değişime uğrayarak kuyruklu ve
hareketli olan spermiyuma farklanır. Sertoli hücreleri spermiyogenezde önemli rol
oynarlar. Spermiyogenez dört kısımda incelenir:
1. Golgi Dönemi: Çok sayıdaki golgi kompleksinin bulunduğu bölgede PAS pozitif
granüllerin birikmesi ile karakterizedir. Glikoproteinden zengin granüller nükleus
membranının yakınındaki membranla sınırlı akrozomal vezikül ile birleşir.
Akrozomal vezikülün bulunduğu yöre, gelişen spermiyumun ön kutbunu belirler.
Bu dönemde sentriyoller de arka kutba doğru göç ederler. Burada spermiyum
kuyruğunun aksonemini oluşturacak olan mikrotubuller sentriyollerden başlayarak
yapılanmaya başlarlar.
2. Kep Dönemi (Şapka Dönemi): Akrozomal vezikül nükleusun ön bölümünü
kaplayacak şekilde genişleyip şapka şeklinde bu bölümü sarar (akrozomal kep).
Nükleus membranının bu tarafa bakan kısmının porları kaybolur, membran
kalınlaşır. Nükleus yoğunlaşır.
3. Akrozom Dönemi: Bu dönemde belirgin şekil değişikliği yaşanır. Spermiyum başı
Sertoli hücrelerinin sitoplazmasının derinlerine gömülür. Kuyruk flajellumu iyice
hale gelerek uzar. Akrozom, apikal plazma membranına iyice yaklaşır. Sitoplazmik
mikrotubuller akrozomdan spermatidin arka kutbuna uzanarak silindirik kılıfı
oluştururlar. Flajellum, oluşumundan sorumlu olan sentriollerden kaynaklanan 9
adet kalın lif aksonemin mikrotubul çiftlerinin periferinde dış kalın lifleri oluşturur.
Bu liflerin başladığı bölge boyun (bağlayıcı parça) olarak isimlendirilir. Plazma
membranı uzayan flajellum yüzeyini kaplamak üzere arkaya doğru uzarken, manşet
kaybolur. Mitokondriyonlar boyun bölümünde ve distale uzayan bölgede dış kalın
liflerin çevresini sıkı bir kılıf gibi sarmalarlar. Mitokondriyon kılıfı ile karakterize
bu bölüm kuyruğun orta parçasıdır. Orta parçanın distalinde iki longitudinal fibröz
kolon ve çok sayıda bağlayıcı fibröz halka içeren fibröz kılıf esas parçanın dış
yoğun liflerini çevreleyerek flajellumun ucuna kadar ilerler. Bu bölge esas parça
olarak isimlendirilir. Esas parçanını distalinde kalan ve sadece aksonemin
mikrotubullerini içeren kısa son bölüm ise son parça olarak isimlendirilir.
4. Olgunlaşma Dönemi: Sitoplazma miktarında azalmanın gerçekleştiği terminal
dönemdir. Fazla sitoplazmayı içeren bölüm boğumlanıp kopar, Sertoli hücreleri
tarafından fagosite edilerek ortadan kaldırılır. Spermatidler birbirleri ile olan
3.2. TCDD (2,3,7,8- tetraklorodibenzo-p-dioksin)
3.2.1. Dioksin ve Benzeri Bileşikler
İnsanlar sistemik olarak devamlı organik kirleticilere maruz kalmaktadırlar.
Bu çevresel kirleticiler devamlılıkları, toksisite düzeyleri ve hareketlilikleri
nedeniyle sağlığa zarar veren kimyasal maddelerdir (14). Kimyasal yapıları ve
canlılar üzerindeki etkileri benzerlik gösterdiğinden bu bileşikler dioksinli veya
dioksin ve benzeri bileşikler olarak isimlendirilirler.
Poliklorludibenzo-para-dioksinler (PCDD), poliklorludibenzo furanlar (PCDF) ve poliklorlu bifeniller
(PCB) suda çok az çözünme özelliğinden, metabolik ve çevresel yıkımlara
dayanıklı, doğada kararlı durumda bulunan, yüksek derecede zehirli, geniş yayılım
alanına sahip çevresel kirleticilerdir (15). Bu zamana kadar 75 PCDD, 135 PCDF
ve 209 PCB kimyasal bileşik tanımlanmıştır (16).
Dioksinler, kimyasal içerikleri ve toksik özellikleri birbirleriyle ilişkili, 75
farklı dioksin bileşiği mevcut olup en zehirli yapıda 2,3,7,8-
tetraklorodibenzo-p-dioksin (TCDD) olan bir guptur (17) ve genellikle bu bileşik tetraklorodibenzo-p-dioksinlerin toksisite
çalışmalarında standart olarak kullanılmaktadır (18).
TCDD çevrede uzun süre kalıcı özellikte olan, yapısal olarak aynı
mekanizmayla toksisite oluşturup canlılarda biyolojik olarak benzer etkiler
için üretilmeyip, endüstriyel üretim ve başta atık yakma gibi yanma işlemlerinin
yan ürünü olarak ortaya çıkan, son derece zehirli yapıda çevreye salınırlar (19).
TCDD’ye maruz kalma bireylerde çeşitli toksisiteler meydana
getirmektedir. Bu toksisitelerin derecesi türler ve bireyler arasında büyük ölçüde
farklılık göstermektedir. Yüksek dozda TCDD’ye maruz kalan insanlarda görülen
en belirgin toksisitelerden biri klorakne olarak bilinen deri hastalığı iken,
laboratuvar hayvanlarında toksik etkilere karşı farklı düzeyde duyarlılıklar ve
tepkiler geliştiği görülmektedir (20). Üzerinde en fazla çalışma yapılan TCDD
maruziyeti sonrasında laboratuvar hayvanlarında bu toksik etkilerin başında hızlı
kilo kaybı ve devamında ölüm ile karakterize olan zayıflık sendromu (wasting )’dur
(21).
3.2.2. Toksik Eşdeğer Faktörleri ve Toksik Eşdeğerlikler
Toksik Eşdeğerlik Faktörleri (TEF); WHO (Dünya Sağlık Örgütü)
tarafından dioksin ve benzeri bileşiklerin toksisitellerini belirlemek amacıyla ve bu
bileşiklerden TCDD temel alınarak her bir dioksin bileşiklerine verilen ortalama
zehirlilik faktörü olarak tanımlanmaktadır. TEF değeri; bileşiğe maruz kalma
süresinin uzun ya da kısa olması, in vivo ve in vitro biyokimyasal analizler göz
TEF’nde bir eşitlikle tüm dioksin türevlerinin ortak toksisite etkileri bir
birime çevrilmekte ve aynı örnekteki benzer zehirli maddelerin ortak zehirli etkileri,
toplam zehir eşdeğerliğini ifade etmek üzere toplanmaktadır. Seçilen örneğin
toplam zehir eşdeğerliliğini tanımlayabilmek için Çevre Koruma Ajansı (EPA), 2
aşamalı bir yöntem geliştirmiştir:
1. Aşamada; kullanılan eşitlikle, bütün dioksin benzeri bileşiklerin ortak
zehirli etkileri, tek bir birime çevrilerek Toksik Ekivalent değeri elde edilir.
2. Aşamada; aynı örnekteki benzer toksik maddelerin ortak zehirli etkileri
toplanarak toplam zehir eşdeğerliliğini ifade eder.
TEQ= Toksik Ekivalent
TEF= Toksik Eşdeğerlilik Faktörü
1) TEQ=(Dioksin Derişimi)x(Zehirlilik Faktörü)
2) Toplam TEQ= Örnekteki tüm zehirli TEQ’ların toplamı
Dioksin ve dioksin benzeri bileşiklerin toksik etkinliğini, o bileşiğin boyutu
ve biçimi belirler. Makromoleküldeki klor sayısı ve konumu bileşiğin toksisitesinde
önemli bir belirteç olup, dioksin molekülünün 2,3,7, ve 8 bağlarında klor atomunun
bulunması bileşiğin zehirliliğini belirler (Şekil 5). Dioksin ve furan bileşiklerinin
yapılarında bulunan klor atomunun konumlarının benzer şekilde yerleşiminden
Şekil 5: TCDD’in kimyasal yapısı ve üç boyutlu görünümü (23) 3.2.3. Dioksin Kaynakları ve Oluşumu
Dioksin, organik klorlu bileşikler olarak bilinen, yüzlerce klorlu kimyasalın
üretimi sırasında ‘ara’ ya da ‘yan ürün’ olarak ortaya çıkar (24). TCDD çevrede
geniş yayılım gösteren kalıcı bir organik kirleticidir (25). TCDD, polivinil klorid
(PVC)’lerin düşük sıcaklıkta yakılması ve pestisit üretimi gibi endüstriyel
süreçlerin yan ürünü olarak ekosisteme salınan zehirli, organik bir maddedir (26).
TCDD ev ısıtma sistemlerinde, araba egzozlarında, sigara dumanında (27),
bitki ve böcek öldürücü maddelerin imalatının bir yan ürünü olarak, ağaç pulpası
ve kâğıt fabrikalarında klorinle ağartma işleminde, medikal atıkların imha edilmesi
ve belediyelere ait katı atıkların yakılması esnasında ortaya çıkan kalıcı bir çevre
kirleticisidir (27, 28).
Ayrıca dioksinler yüksek derecedeki sıcaklıklarda (250-450 °C), bazı doğa
olarak tanımlanır (29). Bu süreçte dioksin oluşumuna neden olan kaynaklar
arasında özellikle evsel katı atıkların, kömür, odun ve petrol ürünlerinin, sentetik
yağlı boyalarla kaplanmış maddelerin, transformatör yağların ve klorla beyazlatılan
ürünlerin yakılmasıyla (30, 31), bazı metallerin eritilmesi, volkanik patlamalar,
orman yangınları, fosil yakıtların kullanımı, asfalt üretimi ve PVC endüstrisi
sayılabilir (22, 32). Dioksinler 250 °C’nin üzerindeki sıcaklıklarda organik
materyallerin yanması ile oluşur ve 800 °C’nin üzerindeki sıcaklıklarda ise hızlıca
yıkımlanır (33).
TCDD ve PCB’ler dünya çapında karmaşık bileşikler olarak bulunan kalıcı
ve hidrofobik bir yapıya sahip organik kirleticilerdendir ve TCDD, yıkılmaya
dirençli olup tahmini 7,6 yıllık yarılanma ömrü ile doğada birikme eğilimindedir
(34) (Tablo 1). Bu nedenle Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı (IARC),
TCDD’yi muhtemel insan kanserojeni sınıfından, insan kanserojeni sınıfına
yerleştirmiştir (32). İnsanlar bu kirleticilere gıda, su ve solunum yoluyla maruz
kalırlar (35). Havaya, toprağa ve sulara karışan dioksinler hayvanlara beslenme
yoluyla geçerek vücutlarında birikir ve hayvansal gıdalarla insanlara taşınırlar.
Dioksinler gerek kimyasal yapılarının sabit olması ve gerekse doğal yapılarının
lipofilik olması nedeniyle çevre ve insanlar açısından her zaman potansiyel tehlike
ve okyanusların dibindeki sedimentlerde de bulunabildiğinden dolayı diğer bir
önemli depolanma alanıdır (18).
Tablo 1: Dioksin/Furan bileşiklerinin çeşitli ortamlarda ki yarılanma süreleri (23)
Hava Su Toprak Sediment
PCDD 2 gün- 3 hafta 2 gün- 8 ay 2 ay- 6 yıl 8 ay- 6 yıl
PCDF 1-3 hafta 3 hafta- 8 ay 8 ay- 6 yıl 2-6 yıl
3.2.4. Dioksinin Etki Mekanizması
TCDD, özellikle evrimsel süreç boyunca oldukça korunmuş ve temel olarak
sarmal-halka-sarmal yapısına sahip bir transkripsiyon faktörü olan aril hidrokarbon
reseptörünün (AhR) etkili bir ligandıdır (36). AhR her yerde bulunan sitozolik bir
proteindir, AhR normalde sitoplazmada bulunan şaperon proteinlerine bağlı iken,
ligand bağlanmasıyla aktifleşerek çekirdeğe geçmekte ve yer değiştirerek daha
büyük boyutlu aktif Aril Hidrokarbon Reseptör Nüklear Translokator (ARNT)
proteini ile birleşmektedir (37, 38). AhR/ARNT dimeri, spesifik DNA cevap
elementlerine (AHRE-I ve AHRE-II) bağlanarak belirli genlerin transkripsiyonunu
düzenlemektedir (37). AhR proteinin TCDD toksisitesine aracılık ettiğini gösteren
önemli kanıtlar bulunmaktadır: AhR-nakavt fareler, karaciğer dokusunda ARNT
proteini bulunan fareler, yabani tiplere kıyasla, TCDD zararından kaynaklanan
fenotipik etkileri önemli ölçüde düşük düzeyde sergilemişlerdir (39). Bunun yanı
sıra TCDD-AhR bağlanması sonucunda AhR’nin hedef geni olan ve yoğun olarak
karaciğerde sentezlenen CYP1A1 aktive olmaktadır (40). CYP1A1 geninin
TCDD’yi metabolize etmesi süresince gerçekleşen metabolik olaylar oksidatif stres
koşullarının artmasına neden olan mutajenik metabolitleri ve reaktif oksijen
türlerini (ROS) üretmektedir (41).
Ca2+ düzeyinin erken artışının da TCDD’nin neden olduğu toksik etkilere
katkıda bulunduğu göz ardı edilemez. Ca2+ düzeyinin erken artışı, fosfolipaz A2’nin
aktivasyonu ve sonrasında membran fosfolipitlerinden araşidonik asidin (AA, n6
yağ asidi) salınımıyla sonuçlanmaktadır (42). Araşidonik asit, COX-2 ve sitokrom
p450 enzimleri için substrat olarak hareket etmekte ve araşidonik asidin salınımı
enflamasyona neden olan eikosanoidlerin üretimiyle sonuçlanmaktadır. Bu
nedenle, hem reaktif oksijen türleri (ROS) hem de enflamasyona neden olan
eikosanoidler, TCDD ile uyarılan oksidatif stres ve toksik tepkiler üzerinde önemli
3.2.5. Dioksinlerin Toksikokinetikleri
3.2.5.1. Emilim ve Dağılımı
Canlılar dioksinlere besin, su, solunum ve temas yolu ile maruz kalmaktadır
(24). Dioksinler vücuda alınan ve emilim oranı bileşiğin türüne, emilim yoluna ve
ortama bağlı olarak değişen bileşiklerdir (44). Dioksin zehirlenmelerinde bulaşma
%90 oranında ağız yolu ile olmakla birlikte fabrika patlamaları, orman yangınları
gibi durumlarda her üç yoldan bulaş söz konusu olabilir. Dioksin bileşikleri yağda
iyi çözündüklerinden ortamdaki yağ oranı ile emilim arasında pozitif yönde bir
ilişki vardır. Bu zamana kadar yapılan deneylere dayanarak laboratuvar
memelilerinde ve insanlarda en uzun TCDD eliminasyonu, yarılanma ömrüne ve
vücut ağırlığına bağlı olduğu bildirilmiştir. İnsanlar TCDD’ yi çoğunlukla
beslenme yoluyla almakta ve yıkılabilir özelliğinin düşük olması nedeniyle alınan
TCDD kanda ve yağ dokuda değişmeden kalmaktadır. Dioksinler vücuda alındıktan
sonra temel olarak kan, kaslar, karaciğer ve yağ dokuda dağılırlar, fakat bu
bileşikler özellikle karaciğer ve yağ dokuda birikme özelliği gösterirler (25, 45, 46).
Amerikan Çevre Örgütü (EPA) dioksin ve dioksin benzeri maddelerin
insanların DNA yapısında değişim yapması sonucunda, bağışıklık sisteminin
bozulduğunu, genotoksik tipte kanserlerin oluşumuna yol açabildiğini ve
Dioksinler yağlı tüm doku tiplerinde muhafaza edilir. En yüksek dağılımı karaciğer
ve beyaz yağ dokusunda, bağırsaklar üzerindeki yağ hücrelerinde ya da düşük
oranda beyin yağ dokusunda birikmesi sonucunda karaciğerde, pankreasta ve kalpte
hastalıklara neden olduğu belirlenmiştir (46, 47).
3.2.5.2. Dioksinin Atılımı
Dioksinlerin temel atılımı dışkı yolu ile olup, idrarla atılan oran dışkıdakine
göre oldukça düşüktür. Erkek bir gönüllüde, 105 ng. TCDD alımından sonra
emilimin > % 87’ye ulaştığı görülmüştür. Absorbe edilmeyen TCDD 3 gün
içerisinde dışkı ile atılır. Ancak dışkı tarafından absorbe edilen oranının
eliminasyonu % 0,03 kadar düşüktür (48).
Lipofilik özellik gösteren ve insan vücudunda daha çok yağlı gıdalar yolu
ile (et, yumurta, tam yağlı süt, tereyağı vb.) kontamine olan dioksinlerin yarılanma
ömürlerinin insanlarda 7-8 yıl, maymunlarda 1 yıl, sığırda 16,5 hafta, domuzlarda
94 gün, farelerde 12-30 gün arasında değiştiği bildirilmektedir (49, 50) (Tablo 2).
WHO tarafından PCDD ve PCDD/F’ler 1. Sınıf kanserojen maddeler içerisinde
sayılmış ve insan için günlük tolere edilebilecek dozun 1-4 pg TEQ/kg olduğu rapor
Tablo 2: Farklı Canlılarda Dioksinin Yarılanma Ömürleri (49, 50)
Bulunduğu Canlı Yarılanma Ömrü
İnsan 7-8 yıl Maymun 1 yıl Sığır 16,5 hafta Fare 12-30 gün
Laktasyon, vücuttan dioksin atılmasını hızlandıran birkaç önemli olaylardan
birisidir; fakat bu durumda da bebeğin bu zehirli kimyasala maruz kalması ile
olumsuz bir etki söz konusudur. Emzirme süresince, anne sütünün yağında bulunan
dioksin, anneden çocuğa geçmekte, hatta bebekler aldıkları bu anne sütü nedeniyle
vücutlarında, annelerinden daha yüksek oranda dioksin bulunabilir (51, 52).
3.2.6. Dioksinlerin Zehirlilikleri
Dioksin ve benzeri bileşiklere maruz kalınması sonucunda oluşan yan
etkilerin başında sindirim, karaciğer ve göğüs kanserleri, gelişme bozuklukları,
wasting sendromu (zayıflık/israf sendromu), lenfoid, klorakne, hepatotoksisite,
yarık damak, kusurlu böbrek oluşumu gibi doğumsal anomalililer ile
güçlüğü, üreme bozuklukları, yüksek tansiyon ve astım gibi hastalıkların meydana
geldiği belirtilmiştir (53) (Tablo 3).
Tablo 3: Maruz Kalınan Yüksek/Düşük Doz Dioksinin Yan Etkileri (53)
Yüksek Doz Etkileri Düşük Doz Etkileri
Klorakne Gelişimsel problemler (motor hareketler/hafıza) Hepatotoksisite Endokrin sistem bozuklukları
Üreme bozuklukları Erkek/kadın doğum oranında azalma Wasting Sendromu Solunum problemleri
İmmünosupresyon Dolaşım bozuklukları Doğum anomalileri
Deney hayvanlarında kanser
Hayvanlarda gözlemlenen toksik etkiler oldukça çeşitlidir. Dioksinler,
spesifik olarak wasting sendromu (zayıflık/israf sendromu), hepatotoksisite,
klorakne, enzim indüksiyonu, iç salgı dengesizlikleri, karaciğerde vitamin A
depolarının azalması, lipid peroksidasyonu, nörotoksisite gibi toksik etkiler
oluşturmuştur (54). Zayıflık sendromu, kemirgen laboratuvar türlerinin birçoğunda
Farklı ırklar arasındaki varyasyonu gösteren en iyi tanımlanmış modellerden
biri TCDD-duyarlı Long-Evans (Turku/AB) sıçanlar (L-E; LD50 9.8- 17.7 μg/kg)
ile TCDD-dirençli Han/Wistar (Kuopio) sıçanlar (H/W; LD50
˃
9600 μg/kg)arasındaki farklılıktır (55). H/W ırkında özellikle zayıflık sendromuna ve letaliteye
karşı görülen direnç AhR proteininin transaktivasyon alanında meydana gelen bir
nokta mutasyonu ile ilgilidir (56).
TCDD endokrin sisteme zarar veren çevresel bir kirletici olduğundan, erkek
üreme sistemi üzerinde toksik etkilere sebep olmaktadır (57). Erkek üreme
organları dioksine oldukça duyarlıdır. TCDD’ye maruz kalmanın sperm sayısında
azalma, dioksin toksisitesinin en hassas noktalarından biri olup fertilite de düşüşe
neden olduğu belirtilmektedir (58). Birkaç büyük meta-analiz çalışmasına göre
semen kalitesi, yarım yüz yıllık dönemde bazı gelişmiş ülkelerde azalmaktadır (59).
Erkek üreme sağlığındaki bu bozulma, çevresel endokrin bozucu kimyasallara
(EDC) sürekli maruz kalmayla ilişkilendirilmektedir (60, 61). İnsan üreme sistemi
üzerinde potansiyel zararlı etkilere sahip bir grup EDC, dioksinler ve dioksin
benzeri bileşiklerdir (62). Birçok EDC’ nin kadın üreme sistemini ve özellikle
yumurtalıkları hedef aldığı bilinmektedir. EDC’ ye maruz kalma infertilite, erken
yumurta yetmezliği ve anormal cinsiyet steroid hormon seviyeleri gibi birçok
Karaciğerde TCDD toksisitesinin kaba işareti, parenkimal hepatositlerde
AhR aktivasyonuna dayandırılır. Ayrıca, karaciğerde parenkimal olmayan
hücrelerde TCDD tedavisinin sonuçları hakkında daha az bilgi bilinmektedir.
Hepatik yıldız hücreler (HSC) A vitamini depolayan parenkimal olmayan
hücrelerdir. Karaciğer hasarına bağlı olarak, aktif HSC’ler bu depolama yeteneğini
kaybeder ve bunun yerine pro-inflamatuar mediatörler ve tip I kollagen üretimi
yoluyla inflamasyon ve fibrozun geliştirilmesi ve korunmasında işlev görürler.
TCDD’ ye maruz kalmanın karaciğer retinoid homeostazını bozduğu ve
karaciğerdeki hücre dışı matriksin şeklini değiştirerek düzensizleştirdiği rapor
edilmiştir (64).
Dioksin maruziyeti sonucunda tüm doku ve organlarda kanser riskinin
arttığı özellikle akciğer ve yumuşak doku sarkomlarında artışların mevcut olduğu
Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı (US-EPA) ve WHO raporlarında
bildirilmektedir (22, 65, 66).
3.2.7. Tolere Edilebilir Doz
TCDD için, tolere edilebilir günlük alım miktarını (TDI) Dünya Sağlık
Örgütü (WHO) 10 pg/kg olarak belirlemiştir. Fakat yapılan çalışmalarda bu
etkisinin daha sonra ortaya çıkmasından dolayı dioksinli bileşiklerin TDI değerini
1-4 pg/kg TEQ olarak yeniden belirlemiştir (22, 67).
3.2.8. Toksisite Durumunda Tedavi
Dioksin birikiminin engellenmesi veya uzaklaştırılması amacıyla çeşitli
araştırmalar yapılmıştır. Bu araştırmalar da dioksine maruz kalan farelere 10 gün
boyunca clenbuterol katkılı gıdalarla beslenildiğinde yağ dokusunda bulunan
toplam dioksin miktarında %30 oranında azalma görülmüştür. Başka bir çalışmada
ise lif kaynaklı diyetle beslenen kemirgenlerde, dioksinin vücuttan atılım oranının
daha yüksek olduğu bildirilmiştir (68). Yapılan bir çalışmada bileşiklere maruz
kalan 2 deneğe sonraki ilk 3 yıl boyunca TCDD atılımını artırmak için diyette yağ
yerine sindirilemeyen, absorbe olmayan olestra kullanıldığı ve bağırsaklarda atılımı
arttırdığı görülmüştür (69).
TCDD gibi bazı kimyasalların neden olduğu kanser oluşumlarının başında
yetersiz antioksidan tüketimi büyük önem teşkil etmektedir. Yeterli düzeyde ve
sürekli bitkisel antioksidanların (karotenoid, vitamin C, folik asit, retinol)
tüketilmesi oksidatif stresin DNA hasarını engelleyerek, gelişmiş hasarlı hücrelerin
3.3. Oksidatif Stres ve Serbest Radikaller
Serbest radikaller bir veya daha fazla eşleşmemiş elektrona sahip, kısa
ömürlü, kararsız, molekül ağırlığı düşük ve çok etkin moleküllerdir (72, 73).
Serbest radikaller normal hücresel metabolizma sırasında oluşabildiği gibi, çeşitli
dış etkenler vasıtasıyla da oluşabilmektedir (74).
Serbest radikaller lipidler, proteinler, ve nükleik asitler gibi temel hücresel
bileşenlerde hasar oluşturma özelliğine sahip olup kanser, ateroskleroz, amiloidaz,
yaşa bağlı bağışıklık yetersizliği, demans ve hipertansiyon gibi çeşitli hastalıklara
neden olduğu ve biyolojik yaşlanma sürecinde etkili rol oynadığı tanımlanmıştır
(74).
Organizmada oluşan serbest radikaller endojen ekzojen kaynaklı olabilir.
Memelilerde, mitokondriyal elektron transport zinciri (ETZ), fagositik ve
endotelyal hücrelerdeki oksidatif reaksiyonlar, redoks döngüleri, araşidonik asit
metabolizması, otooksidasyon reaksiyonları sırasında ksantin oksidaz ile NADPH
(nikotinamid adenin dinükleotid fosfat) oksidaz gibi enzimlerin etkisiyle serbest
radikaller oluşmaktadır. Ekzojen kaynaklar ise endüstriyel kirleticiler, ilaçlar, diyet,
iyonize radyasyon, ultraviyole (UV) ışını, sigara dumanı ve ksenobiyotiklerden
Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikallerin başında oksijen
kaynaklı radikallerdir ve bunlara reaktif oksijen türleri (ROS) adı verilir. Yoğun
olarak bulunan diğer bir serbest radikal ise reaktif nitrojen türleri (RNS) dir (76).
3.3.1. Memelilerdeki Başlıca Serbest Radikaller
Reaktif Oksijen Türleri (ROS): Serbest radikallerin dış orbital
yörüngesinde paylaşılmamış elektron ve oksijen atomu ile oluşan bir durumdur.
Oksijenin indirgenmesi ya da oksijene iyonize radyasyonun etki etmesi ile oluşur.
En önemli reaktif oksijen türleri (ROS) ise şunlardır: (75, 77).
Süperoksit Radikali (O2¯ )
Hidrojen Peroksit (H2O2 )
Hidroksil Radikali, Fenton ve Haber – Weiss Reaksiyonları (OH˖ )
Hipokloröz Asit (HOCl)
Singlet Oksijen (1O 2)
Alkil Radikali, Organik Radikaller (R. )
Hidroperoksil Radikali (HO˖ 2)
Alkoksil Radikali( LO˖ )
Reaktif Nitrojen Türleri (RNS): Canlılarda meydana gelen reaktif nitrojen
Nitrik Oksit (NO): Azot ve oksijen atomunun elektron alışverişinin
birleşmesinden meydana gelir. NO, endojen Nitrik Oksit Sentaz (NOS) enzimi
yardımıyla L-arijinin aminoasidinden sentezlenir. Yarı ömrü 10 ila 20 saniye olup
hücre içi ve hücre dışında işlev gören küçük yapıdaki, reaktif moleküldür.
NO’ nun vücutta oluşan reaktif oksijen türleriyle (ROS) reaksiyona girerek
oksidan yapıda olan peroksinitrit (ONOOH) anyonu gibi serbest radikalleri
oluşturduğu ve ileri bir parçalanma ile OH˖ radikalini meydana getirdiği
bilinmektedir. OH˖ molekülü ise yıkım özelliğine sahip bir moleküldür. Kısacası
NO, hücrelerin işlev bozukluğunda, damar sertliği, hipertansiyon ve kalp- damar
hastalıklarında etkili olabilmekte (78).
Oksidatif Stres: Reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi veya yetersiz
transferi söz konusu olduğunda hücrenin yükseltgenme-indirgenme
reaksiyonlarında değişiklik meydana gelir. Çok sayıda hücresel ürünlerin
kontrolsüz oksidasyonu meydana geldiğinde, bu olay oksidatif stres olarak
tanımlanır. Oksidatif stres lipit tabakasının peroksidasyonuna, protein
oksidasyonuna, DNA hasarına, sitotoksik etkilere ve sinyal iletilerinde bozulmalara
neden olmaktadır. Vücudumuz oksidatif strese karşı ROS üretimini engellemeye ya
da antioksidan savunma sistemi ile azaltmaya veya hasar gören proteinleri
Serbest oksijen radikallerinin birçoğu memelilerde üreme sisteminde
önemli fonksiyonlarda görev almaktadır. Üreme ve sperm fonksiyonları üzerinde
nitrik oksit (NO) ve peroksinitritin etkili rol oynadığı bilinmektedir (82, 83). Son
zamanlarda NO özellikle insan ve sıçanlarda erkek üreme sisteminin
düzenlenmesinde bir mesajcı olarak çeşitli hücre içi ve hücreler arası
fonksiyonlarda, Leydig hücrelerinin steroidogenezis üzerinde otokrin ve parakrin
kontrolü gibi olaylarda rol alır (84, 85). Spermatozoalar, hücre içi antioksidan
enzimlerinin sitoplazmada yoksunluğundan kaynaklanan oksidatif saldırıya karşı
özellikle savunmasızdır. Üstelik birçok hücre türünün aksine, sperm lipid
membranları özellikle dokosaheksaenoik asit gibi çoklu doymamış yağ asitlerine
(PUFA) yüksek oranda sahiptir (86).
Döllenmede membranların birleşmesinde, bu yüksek derecede doymamış
yağ asitleri plazma zarına akışkanlık kazandırır. Ayrıca PUFA’lar malondialdehit
ve çeşitli derecede reaktif a,b-doymamış hidroksialenalleri (örneğin; 4-
hidroksiheksanal gibi) üretmek için kolayca oksitlenir (87, 88).
Bu reaktif aldehitler, bir kez üretildiğinde yakındaki diğer PUFA’ lara
saldırabilir, böylece bir zincir reaksiyonu ile yayılır ve membran akışkanlığını
keser. Yüksek konsantrasyonlarda bu aldehitler, aynı zamanda amino asitleri ve
nükleik asitleri, sperm fonksiyonunu bozan kararlı proteinleri ve DNA adüktlerini
3.4. Apoptozis
Kelime anlamı olarak Yunanca da apo=ayrı ve ptozis=düşen kelimelerinin
birleştirilmesi ile ‘yaprak dökümü’ anlamına gelen bir terimdir (91). Gelişmiş
organizmalarda hücreler arası ilişkilerin gereği olarak ihtiyaç duyulmayan ve
işlevleri bozulan hücrelerin, çevre dokulara zarar vermeden programlı olarak
ölmesidir (92, 93).
Apoptoz normal gelişim, yaşlanma ve hücrelerin devamını sağlamak için
homeostatik denge mekanizması ve hastalık ya da zararlı ajanlar tarafından
hücrelerin zarar görmesinde ve immün reaksiyonlar gibi savunma mekanizması
esnasında oluşabilmektedir (94).
Normal spermatogenezis içerisinde, hücrelerin gelişimi ve farklılaşmasına
ek olarak germinal hücre ölümü de görülür ve spermin oluşmasında bu olay büyük
önem taşır. Apoptoz, spermatogenezis olayında spermatogonia ve spermatositler de
programlı hücre ölümüne sebep olur. Sperm apoptozunda ki bu durum erkek
3.5. Antioksidan Savunma Sistemleri
Adından da anlaşılacağı üzere antioksidanlar, reaktif oksijen türlerinin
vücutta oluşturdukları tepkileri azaltarak nötralize eden bileşiklerdir (97).
Antioksidanlar endojen ve eksojen kaynaklı olmak üzere iki gruba ayrılırlar.
Vücuttaki antioksidanlar (endojen), antioksidan enzimatik savunmalarından
glutatyon peroksidaz (GSH-Px), katalaz gibi ve enzimatik olmayan E vitamini,
melatonin gibi vücutta sentezlenen antioksidan bileşiklerinden oluşur (Şekil 6).
Vücut dışında antioksidanlar (eksojen), kompleks karışımlarda (çikolata veya
zeytin yağı gibi) bulunan sentetik veya doğal bileşiklerin diyetle ya da ayrı olarak
Şekil 6: Antioksidanların Sınıflandırılması (99) 3.6. Flavonoidler
Flavonoidler, çoğu bitki türünde genellikle meyve ve sebzelerden elde
edilen ve bazı gıdalarda bulunan doğal antioksidan yapısında polifenolik bir
Antioksidan aktivitelerinin yanı sıra metallerle kelat oluşturma ve serbest
radikallerin uzaklaştırılması, antialerjik, antinflamatuar, antibakteriyel, antiviral,
antitümör gibi geniş bir yelpazede önemli yeteneklere sahip bir yapıdadır (100,
101).
Flavonoid bileşikleri, benzo- γ -piron türevlerinden meydana gelen geniş
heterojen grupları içeren polifenol özelliğindeki bileşiklerdir (102). Flavonoidin
yapısı heterosiklik (C) özellikte 3 karbonlu bir zincirle bağlanmış iki fenolik (A,B)
halkadan oluşur ve flavonoidlerin kendilerine özgü özelliklerini bu heterosiklik
halka yapısı belirler (103). Doğada 5000 den fazla oldukları varsayılan
flavonoidlerin moleküler yapılarına göre; flavon, flavanon, flavonol, izoflavon,
antosiyanidin, flavanol (Kateşin) olarak sınıflandırılmaktadır (102, 104).
3.6.1. Chrysin
Ağırlıklı olarak çarkıfelek veya mavi tutku çiçeği adıyla bilinen Passiflora
caerulea ‘da, bal ve propoliste bulunan Chrysin (CH) polifenolik bir bileşiktir.
Ayrıca aldığımız gıdalarda, elma, soğan, çay, kırmızı şarap, kızılcık, çilek, brokoli,
maydanoz, kekik, dolma biber ve kereviz gibi birçok bitki özünde de CH
CH, C-2 ve C-3 arasında çift bağ bulunan polifenolik molekül yapısındadır.
Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliği (IUPAC - International Union of
Pure and Applied Chemistry) tarafından 5,7dihydroxy-2-phenyl-4-chromenone
olarak adlandırılıp C15H10O4 formülü ile gösterilmektedir (107, 108) (Şekil 7).
Şekil 7: Chrysin’nin molekül yapısı. (107)
Doğal bir flavon olan CH’ in antioksidan, antihepatotoksik, antiapoptotik,
antiviral, antiinflamatuvar ve antidiyareik özellikleri ile damar koruyucu ve
spasmolitik gibi çeşitli biyolojik ve farmakolojik etkilere sahip olduğu
bilinmektedir (105, 109). Önceki çalışmalar, flavonoidlerin antioksidan özelliğini
hidroksil gruplarının miktarı ve dağılımına, özellikle B halkasının
hidroksilasyonuna bağlı olduğunu kanıtlamıştır (109). Son yıllarda yapılan
araştırmalar, CH’ nin enfeksiyon, kanser ve yaşlanma ile ilgili anahtar molekülleri
düzenlediğini ortaya koymuştur (110). Kanser hücrelerinde çoğalmayı engellediği
ve apoptozu indüklediği için CH, kanser önleyici bir madde olarak aday
ve göğüs kanserlerinden dolayı ortaya çıkan pro-apoptotik ve antiproliferatif
özelliklerinden, hâlen umut verici bir antikanser ajanı olduğu görülmektedir (112).
Dişi ve erkek cinsiyet hormonlarının sentezlenmesinde aromataz enzimi
görev almaktadır. Östrojen sentetaz olarak bilinen Aromataz enzimi (p450
sitokrom), testosteronu östradiole dönüştüren anahtar bir enzimdir (113).
CH’in özelliklerinden biri de aromataz enzimi inhibitörü olması ve
kullanılması durumunda testosteron düzeyi ile sperm kalitesini arttırdığı rapor
edilmiştir (114, 115).
TCDD son derece dayanıklı ve uzun bir yarı ömre sahip olmasından dolayı
çevrede uzun süre mevcudiyetini sürdürür ve insanlar genellikle kontamine
besinlerle bu toksik maddeyle karşılaşırlar. TCDD’nin insan vücudunda da birikme
eğilimi vardır ve bu yönüyle hayati risk oluşturması söz konusudur.
3.7. Araştırmanın Amacı
Biz bu çalışmada, çevrede uzun süre kalıcılığı olan ve organizmada birikme
eğilimi gösteren TCDD’nin günümüzün en önemli sağlık problemlerinden olan
infertiliteye bir katkısı olup olmadığını ve testis dokusunda oluşturması muhtemel
doku hasarına karşı antioksidan ve antiinflamatuar özellikleri olan CH’nin etkilerini
4. GEREÇ VE YÖNTEM
Bu çalışma, Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu’nun
15/10/2014 tarih ve 2014/21 sayılı 198 no’lu kararı gereğince etik yönden onay
alınarak, Fırat Üniversitesi Deneysel Araştırma Merkezi (FÜDAM) ve Fırat
Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı laboratuvarında
yapıldı.
Çalışma bütçesinin tamamı Fırat Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri
Koordinasyon Birimi (FÜBAP)’ nin TF. 14.71 proje no’ lu kararı gereğince
karşılandı.
4.1.Deney Hayvanlarının Beslenmeleri ve Barındırılmaları
Bu çalışmada FÜDAM’dan temin edilen ortalama ağırlığı 105-130 gr olan
28 adet 4 haftalık Wistar Albino cinsi erkek sıçan kullanıldı. Deney hayvanları
FÜDAM hayvan laboratuvarında 12 saat (07:00-19:00) aydınlık - 12 saat (19:00-
07:00) karanlık periyodunda, 21±1 ˚C ortam sıcaklığında takip edildi. Özel olarak
tasarlanmış kafeslerde barındırılan ratlar, Elazığ Yem Sanayi A.Ş. Yem
beslenerek ad libitum su ve yiyecek alımları sağlandı. Pelet yemlerin içeriği tablo
4’de gösterildi.
Yemler için çelik kaplar, su için ise paslanmaz çelik bilyeli cam biberonlar
kullanıldı. Sıçanların deney süresince bakımlarına bu şekilde devam edildi.
Tablo 4: Sıçanlara verilen pelet yemin bileşimi
Madde adı (%) Miktarı
Buğday 15 Mısır 10 Arpa 27 Kepek 8 Soya 29,4 Balık unu 8 Tuz 0,6 Kavimix VM23-Z 0,2 Methionin* 0,2 DCP** 1,6 * 1 gramında: 4800 IU A, 960 IU D3, 12 mg E, 0,8 mg K3, 0,8 mg B1, 2,4 mg B2, 1,2 mg B6, 0,006 mg B12 vitaminleri, 16 mg Nicotin amid, 3,2 mg Cal. D. Panth., 0,32 mg Mn, 16 mg Fe, 24 mg Zn, 2 mg Cu, 0,8 mg I, 0,2 mg Co, 0,06 mg Se, 4 mg Antioksidan ve 200 mg Ca bulunur.
4.2. Deney Gruplarının Oluşturulması ve Deneysel Uygulamalar
28 adet 4 haftalık Wistar Albino cinsi erkek sıçanlar deney başlangıcında
ilk ağırlık ölçümleri yapıldıktan sonra her grupta 7 adet sıçan olacak şekilde
rastgele 4 gruba ayrıldı.
Kontrol Grubu (Grup I): Bu gruptaki sıçanlara 5 hafta deney süresince
herhangi bir işlem uygulanmadı.
TCDD Uygulanan Grup (Grup II): Bu gruptaki sıçanlara, 5 hafta
boyunca 25 μg/kg/hafta TCDD (Sigma Aldrich, Cas no: 1746-01-6, Germany)
intraperitonal (ip) uygulandı.
TCDD + CH Grubu (Grup III): Bu gruptaki sıçanlara intraperitonal 25
μg/kg/hafta TCDD ilaveten zeytinyağında çözdürülerek 50 mg/kg/gün CH (Alfa
Aesar, Lot:10167213, Germany) oral gavaj yoluyla verildi.
CH Grubu (Grup IV): Bu gruptaki sıçanlara 5 hafta boyunca 50
mg/kg/gün CH oral gavaj yoluyla verildi.
Deney süresince tüm sıçanlar, her hafta düzenli olarak tartılarak kilo
4.3. Doku Örneklerinin Alınması
5 haftalık deney süresi sonunda tüm gruplardaki sıçanlar intraperitonal
olarak uygulanan ketamin (75 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) anestezisi altında
dekapite edildi. Sıçanların testis dokuları hızlıca çıkarılıp çevre yağ dokularından
arındırıldıktan sonra tartılıp histolojik analizler için Bouin’s solüsyonuna alındı.
Biyokimyasal analizler için sıçanlardan kan dokusu alındı. Kandan elde edilen
serum daha sonra çalışılmak üzere -20 0C’de saklandı.
4.4. Organ Ağırlıklarının Ölçülmesi
Testislere ait rölatif ağırlık hesaplaması aşağıdaki formüle göre yapıldı.
4.5. Histolojik Değerlendirmeler
Testis dokuları Bouin’s solüsyonunda yaklaşık 8 saat boyunca tespit
edildikten sonra sırasıyla % 50’lik, % 60’lık ve % 70’lik etil alkol solüsyonlarında
yıkandı. Takiben ksilolde parlatılıp parafin (P3558-1kg Sigma-Aldrich Paraplast
Embedding Media, U.S.A) bloklara gömüldü (Tablo 5). Parafin bloklardan 5-6
μm kalınlığında kesitler rodajlı ve polilizinli lamlara alındı. Doku kesitleri
