T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
28S VE ITS2 PRİMERLERİNİN BAZI SPHECIDAE (INSECTA: HYMENOPTERA) TÜRLERİNİN MOLEKÜLER SİSTEMATİĞİNDE
KULLANILABİLİRLİĞİNİN TEST EDİLMESİ İlyas CAN
Yüksek Lisans Tezi Biyoloji Anabilim Dalı Yrd. Doç. Dr. Yaşar GÜLMEZ
2013
T.C.
GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ
28S VE ITS2 PRİMERLERİNİN BAZI SPHECIDAE (INSECTA:
HYMENOPTERA) TÜRLERİNİN MOLEKÜLER SİSTEMATİĞİNDE
KULLANILABİLİRLİĞİNİN TEST EDİLMESİ
İLYAS CAN
TOKAT
2013 Her Hakkı Saklıdır
Yrd. Doç. Dr. Yaşar GULMEZ danışmanlığında, İlyas CAN tarafindan hazırlanan bu
çalışma |610112013 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Biyoloji Anabilim Dalı'nda Yüksek Lisans tezi olarak kabul edilmiştir.
Başkan: Prof. Dr. Şaban TEKIN
Üy"
: Yrd. Doç. Dr. YaşarGÜLMEZ
Üy.
: Yrd. Doç. Dr. Ahmet BURSALIfu-r-+J:ı---Imza:Wlf,w\)
imza:
----<-'
TEZ BEYANI
Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim.
i
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
28S VE ITS2 PRİMERLERİNİN BAZI SPHECIDAE (INSECTA: HYMENOPTERA) TÜRLERİNİN MOLEKÜLER SİSTEMATİĞİNDE KULLANILABİLİRLİĞİNİN
TEST EDİLMESİ İlyas CAN
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Yrd. Doç. Dr. Yaşar GÜLMEZ
Ribozomal DNA gen bölgeleri, bazı böcek taksonların ayırımında morfolojik karakterlere ek olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bu çalışmada, 28S-D2 ve ITS2 gen bölgelerine ait primerlerin (TcITS2, TrITS2, TICKITS2, 28S-D2 rDNA), Sphecidae (Hymenoptera) familyasına ait Ammophila sabulosa, Ammophila heydeni, Prionyx kirbyi, Prionyx nudatus, Sphex flavipennis, Sphex funerarius, Sphex melanocnemis, Sphex pruinosus, Sceliphron spirifex türlerinin ayırt edilmesi ve teşhisinde kullanılabilirliği ilk kez test edilmiştir. Seçilen türlere ait örneklerden DNA izolasyonu yapılarak Polimer Zincir Reaksiyonu (PZR) yöntemiyle çoğaltılmış ve agaroz jel elektroforeziyle görüntülenmiştir. Prionyx kirbyi - Prionyx nudatus, Ammophila sabulosa - Ammophila heydeni ve Sphex melanocnemis - Sphex pruinosus, Sceliphron spirifex türlerinin DNA örneklerinden TcITS2 ve TrITS2 primerleri kullanılarak elde edilen PCR ürünleri, ayırt edici bantlar göstermiştir, bu yüzden TcITS2 ve TrITS2 primerlerinin türlerin birbirinden ayrılmasında ve teşhisinde kullanılabileceği görülmektedir. Buna karşın 28S-D2 rDNA ve TICKITS2 primerlerinin, ne DNA bantları ne de bunların DNA dizileri bakımından incelenen türlerin ayırt edilmesinde kullanışlı değildir. Sonuç olarak TcITS2 ve TrITS2 primerleri, çalışılan Sphecid türlerini teşhisinde kullanışlıdır, ancak diğer Sphecid türlerini ayırt etmek için farklı gen bölgelerini tarayabilen ilave primerlerin test edilmesine ihtiyaç bulunmaktadır.
2013, 22 sayfa
ii
ABSTRACT
M. Sc. Thesis
TESTING THE USAGE OF 28S AND ITS2 PRIMERS IN MOLECULAR SYSTEMATICS OF SOME SPHECIDAE (INSECTA: HYMENOPTERA) SPECIES
İlyas CAN
Gaziosmanpasa University
Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor: Asst. Prof. Dr. Yaşar GÜLMEZ
Ribosomal DNA gene regions are widely used to differentiate insect taxa in addition to morphologic characters. In this study, the usability of the primers (TcITS2, TrITS2, TICKITS2, 28S-D2 rDNA) belonging to 28S-D2 and ITS2 gene regions were tested to identify and differentiate species belonging to Sphecidae family, namely Ammophila sabulosa, Ammophila heydeni, Prionyx kirbyi, Prionyx nudatus, Sphex flavipennis, Sphex funerarius, Sphex melanocnemis, Sphex pruinosus, Sceliphron spirifex for the first time. DNA samples isolated from the selected species were amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) and visualized by agarose gel electrophoresis. PCR products obtained from DNA samples of Prionyx kirbyi - Prionyx nudatus, Ammophila sabulosa - Ammophila heydeni and the Sphex melanocnemis - Sphex pruinosus species, Sceliphron spirifex displayed distinctive DNA bands indicating that these species could be differentiated and identified by using Tc ITS2 and Tr ITS2 primers. However, TICKITS2 and 28S-D2 rDNA primers were not useful to differentiate species examined, neither by means of DNA sequence nor the DNA bands. As a result, Tc ITS2 and Tr ITS2 primers were useful to identify sphecid species examined, however additional primers scanning different gene regions to differentiate the other sphecid wasp species, are needed to be tested.
2013, 22 pages
iii
ÖNSÖZ
Morfolojik olarak teşhislerinde zorlanılan ve daha önce moleküler olarak karakterizasyonu yapılmamış olan Sphecidae familyasına ait türlerin moleküler teşhislerinde Ribozomal DNA gen bölgesine ait primerlerin kullanılabilirliğinin test edilmesi amaçlanmıştır. Morfolojik karakterlere dayalı teşhis yöntemlerinde problemler yaşanmasından dolayı bunlara ek olarak moleküler verilerinde analiz edilmesi gerekliliği ortaya çıkmıştır. Bu maksatla başladığım çalışmanın yürütülmesinde, bana destek veren, gerekli olanağı sağlayan ve çalışmanın her safhasında beni yönlendiren danışman hocam, Sayın Yrd. Doç. Dr. Yaşar GÜLMEZ (Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi)'e ve her zaman desteğini ve ilgisini eksik etmeyen Sayın Prof. Dr. Şaban Tekin (Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölüm Başkanı)'e şükranlarımı arz ederim. Bana her türlü manevi desteği sağlayan ve çalışmam sırasında göstermiş olduğu sabır ve anlayış dolayısıyla biricik eşime teşekkürlerimi sunarım. Örneklerin toplanmasına yardımcı olan arkadaşlarım Faruk Tolga ÇUBUK, Adem KESKİN, Güray ŞİMŞEK ve Akif DİZER'e de teşekkürlerimi sunarım.
Bu tez çalışması Gaziosmanpaşa Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Daire Başkanlığı tarafından 2011/41 nolu proje kapsamında desteklenmiştir.
İlyas CAN Ocak, 2013
iv İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZET ... i ABSTRACT ... ii ÖNSÖZ ... iii SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ ... v ŞEKİLLER DİZİNİ ... vii ÇİZELGELER DİZİNİ ... viii 1. GİRİŞ ... 1 2. LİTERATÜR ÖZETİ ... 4 3. MATERYAL VE METOT ... 6 3.1. Materyal ... 6
3.1.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler, Malzemeler ve Cihazlar ... 7
3.1.2. Primerlerin Hazırlanması ... 8
3.2. Metot ... 9
3.2.1. Total DNA İzolasyonu ... 9
3.2.2. Polimer Zincir Reaksiyonu (PCR) ... 10
3.2.3. Agaroz Jel Elektroforezi ... 10
3.2.4. DNA Dizi Analizi ... 11
4. BULGULAR ... 12
5. TARTIŞMA VE SONUÇ ... 17
KAYNAKLAR ... 19
v SİMGE VE KISALTMALAR DİZİNİ Simgeler Açıklama ♂ Erkek Birey ♀ Dişi Birey % Yüzde 0 C Celcius Kısaltmalar Açıklama Bp Baz Çifti
COI Sitokrom Oksidaz Altbirim I
COII Sitokrom Oksidaz Altbirim II
dk Dakika
DNA Deoksiribonükleik Asit
EtOAc Etil Asetat
gr Gram
ISSR Inter-Simple Sequence
Repeat
ITS Internal Transcribed Spacer
Kb Kilo baz
ml Mililitre
μL Mikrolitre
nm Nanometre
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu PFU Pyrococcus furiosus Taq Polimeraz
RAPD Random Amplification of Polymorphic DNA
vi
rDNA Ribozomal DNA
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
rRNA Ribozomal RNA
S Sevedberg
Sa Saat
sn Saniye
TAE Tris Asetik Asit EDTA
TBE Tris Borik Asit EDTA
vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Sayfa
Şekil 4.1. A. sabulosa, A. heydeni, P. kirbyi ve P. nudatus
türlerinin 28S rDNA primeri ile analizi... 12 Şekil 4.2. P. kirbyi, P. nudatus, A. heydeni, A. sabulosa,
Sceliphron spirifex türlerinin Tr ITS2
primeri ile analizi ... 13 Şekil 4.3. S. pruinosus ve S. melanocnemis türlerinin Tc ITS2
primeri ile analizi... 14 Şekil 4.4. S. pruinosus ve S. melanocnemis türlerinin Tr ITS2
primeri ile analizi ... 14 Şekil 4.5. S. flavipennis ve S. funerarius türlerinin 28S-D2 rDNA
viii
ÇİZELGELER DİZİNİ
Sayfa
Çizelge 3.1. Moleküler çalışmalarda kullanılan örneklerle ilgili veriler ... 6 Çizelge 3.2. Moleküler çalışmada 28S-D2 rDNA ve ITS2 gen
bölgelerini çoğaltmak için kullanılan primerler ... 8 Çizelge 4.1. S. flavipennis ve S. funerarius türlerinin 28S- D2 rDNA
gen bölgesinin sekans dizisi ... 15
1. GİRİŞ
Hymenoptera (Insecta) takımı Symphyta (Testereli Arılar) ve Apocrita (İnce Belli Arılar) olmak üzere iki alt takıma ayrılmaktadır. Symphyta grubu az sayıda tür içeren yumuşak vücutlu, bitkisel besinlerle beslenen böcekleri içine alır. Grup üyeleri, çok sayıda kanat damarı içermeleri ve abdomen ile göğüs arasında boğumlanma bulunmamasıyla Apocrita grubundan ayrılır. Ovipozitor yapıları nedeniyle ‘testereli arılar’ olarak adlandırılan bu arıların çoğu yavaş uçan arılardır. Apocrita alt takımı oldukça fazla sayıda tür içeren geniş bir gruptur. Göğüsle abdomen arasının az çok boğumlanmış olması, vücutlarının en belirgin özelliğidir. Apocrita grubunda karıncalar, bal arıları, sosyal ve soliter yaban arıları bulunmaktadır. Üyelerinin büyük çoğunluğu, larva döneminde karnivor olup diğer böcek ve örümcekleri yiyerek beslenirler. Erginleri ise çoğunlukla nektar, polen gibi bitkisel besinlerle beslenirler (Goulet ve Huber, 1993). Sphecidae familyası, Apocrita alttakımı içinde ve Aculeata grubunda yer alan genellikle büyük vücutlu ve parlak renklere sahip, soliter yaban arılarını içerir. Abdomenin göğse bağlandığı kısmın çok incelmiş yapıda olması nedeniyle, familya üyeleri ''İnce belli yaban arıları'' olarak adlandırılmaktadır. Çoğunun kum veya toprağa yuva kazmaları nedeniyle de ‘’kazıcı arılar’’ ya da “kum arıları” olarak adlandırılmaktadır. Ancak ağaç gövdesine, dallara veya taş aralarına yuva yapan, diğer böceklerin açtıkları galerileri kullanan ya da ağaç ve insanların meskenlerine çamur yuva yapan türleri de vardır. Sphecidae familyasının erginlerinde baş, toraks ve abdomen bölümlerinden oluşan belirgin üç vücut bölgesi bulunur. En göze çarpan vücut yapıları toraks ve abdomen arasında yer alan ve petiol olarak adlandırılan bölümdür. Vücut genellikle siyah olup üzerinde kırmızı veya sarı desenler yer almaktadır. İki çift zar şeklinde kanat içeren bu yaban arıları çoğunlukla çok hızlı uçarlar (Bohart ve Menke, 1976; Goulet ve Huber, 1993).
Ergin Sphecid’ler nektarla beslenirler ve bu arada çiçekli bitkilerin tozlaşmasına yardımcı olurlar. Larvaları karnivordur; diğer böceklerin ergin ve larvaları ile örümcekleri yiyerek beslenirler. Dişi Sphecid’ler sokarak felç ettikleri avlarını yuvalarına taşır, üzerine yumurtalarını bırakarak yuvayı kapatırlar. Hazırlanan besin üzerindeki yumurtadan çıkan larva, avı yiyerek yuva içinde gelişir. Avları Orthoptera, Lepidoptera, Hemiptera, Homoptera, Diptera, Neuroptera, Ephemenoptera, Odonata,
2
Psocoptera, Thysanoptera, Trichoptera, Mecoptera, Coleoptera, Hymenoptera gibi böcek takımları ve örümceklerdir (Bohart ve Menke, 1976). Bu böcekleri avlayarak ekosistemde populasyonların aşırı çoğalmasını engellerler.
Sphecidae familyası dünyada yaklaşık 724 (Pulawski, 2013), Türkiye’de 67 türle (Beaumont, 1967; Hensen and Van Ooijen, 1987; Tüzün ve ark. 1999; Gülmez ve Tüzün, 2005; Ljubomirov and Yıldırım, 2008) temsil edilmektedir. Bu familya ile ilgili ülkemizde çoğunlukla faunistik çalışmalar yürütülmüştür.
Familya türlerinin morfolojik özelliklerine dayalı teşhislerinde kullanılan başlıca taksonomik karakterler aşağıda kısaca tanımlanmıştır. Baş kısmında antenler, bileşik gözler, klipeus ve ağız parçaları taksonomik olarak önemli bölgelerdir. Antenler erkeklerde 13, dişilerde 12 segmentlidir. Özellikle erkek bireylerde anten segmentlerinin uzunluğu, üzerindeki plakoidlerin yapısı ve sayısı türlerin ayırımında kullanılmaktadır. Klipeus şekli ve uç kısmının yapısı ile üzerindeki tüyler de taksonomik karakterler içermektedir. Ağız parçalarının uzunluğu ve mandibulların yapısı yine tür ayırımında önemli olmaktadır (Bitsch ve ark., 1997; Bohart ve Menke, 1976; Goulet ve Huber, 1993).
Toraks üzerindeki integümentin genel desenlenmesi, noktalı veya çizgili yapıları, kanat ve bacaklar taksonomik karakterler içeren bölümlerdir. Toraksta pro-, mezo- ve metatoraks olarak üç bölüm bulunur. Ayrıca abdomene ait bir yapı olan propodeum plakası toraksın arka kısmında yer almaktadır. Pronotum genellikle uzundur, teguladan geniş bir şekilde ayrılmış pronotal loba sahiptir. Mezopleuronda episternal sulcus yapısı da taksonomik karakterlerdendir. Propodeum genellikle uzundur. Bacaklarda segmentlerin yapısı ve uzunluğu, plantula içerip içermemesi, seta ve pençelerin yapısı taksonomik karakter olarak tür ayırımında önemlidir. Kanat damarlarının şekli, sayısı, hücre sayısı ve şekli de önemlidir. Dişilerde mandibul av yakalama ve yuva kazmaya uygun biçimdedir. Erkeklerde çiftleşme süresince dişiyi tutmaya adapte olmuştur. Taksonomik karakterlere dayalı tür teşhislerinde bazen ciddi sistematik problemlerle karşılaşılmaktadır. Örneğin, teşhis anahtarlarında çok sık kullanılan ve tür içinde değişkenlik gösteren tüylenme, renklenme, desenlenme vb. gibi güvenilir olmayan karakterler veya coğrafik varyasyonların oldukça fazla olması, tür ayırımını zorlaştırmaktadır. Ayrıca, tip örneklere veya karşılaştırma materyallerine araştırmacı her zaman ulaşamamakta, ya da karşılaştırma materyali olarak kullanılacak bu çeşit
3
örneklerin vücut parçalarının eksilmesi veya çeşitli deformasyonlara uğraması da teşhislerde güçlüklere yol açmaktadır. Bu güçlüklerin aşılması ve karşılaşılan problemlerin çözümünde kullanılabilecek yeni ve güvenilir yöntemler sistematikçilere önemli destek sağlayabilir. Bu sayede, morfolojik olarak teşhisi yapılan örneklerin teşhislerinin doğruluğu farklı parametreler açısından da doğrulanmış olacaktır.
Son yıllarda taksonların tanımlanmasında, birbirine yakın türlerin ayırt edilmesinde veya akrabalık ilişkilerinin ortaya çıkarılmasında yararlı olabilecek moleküler biyoloji yöntemleri kullanılmaya başlanmıştır. Hymenoptera takımı içinde şimdilik az sayıda türle yapılmış olan bu çeşit çalışmalar, ileriki çalışmalar için ümit verici sonuçlar ortaya koymuştur. DNA ve polimer zincir reaksiyonu (PCR) temelli bazı yöntemler parazitoid hymenopterlerde kullanılmış ve morfolojik teşhislerle uyumlu sonuçlar elde edilmiştir (Dowton and Austin, 1998; Doğanlar ve ark., 2009; Silva ve ark., 1999; Quicke ve ark., 2011). Günümüzde başarılı şekilde kullanılan moleküler yöntemler ise: Random Amplified Polymorphic DNA (Landry ve ark., 1993; Chang ve ark., 2001; Al-Barrak ve ark., 2004), Restriction Fragment Lenght Polymorphism (Vanlerberghe-Masutti, 1994; Sappal ve ark., 1995), satellit DNA (Landais ve ark., 2000; Pizzol ve ark., 2005), Inter-Simple Sequence Repeat (de Leon ve Jones, 2005) yöntemleridir.
Hymenoptera takımında filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde nükleer DNA ve mitokokondriyal DNA’da yer alan bazı gen bölgeleri kullanılmaktadır. Bu bölgeler nükleer DNA’da internal transcribed spacers (ITS1 ve ITS2), 18S ve 28S ribozomal DNA gen bölgeleri; mitokondriyal DNA'da ise sitokrom oksidaz alt birimleri (COI ve COII), 16S ribozomal DNA ve sitokrom b’dir (Cameron, 1993; Campbell ve ark., 1993; Carpenter ve Wheeler, 1999; Chen ve ark., 2004; Mardulyn and Cameron, 1999; Rokas ve ark., 2002; Field ve ark., 2011, Stouthamer ve ark., 1999).
Bu çalışmada, Hymenoptera takımının bazı türlerinin ayırt edilmesinde daha önce kullanılmış olan belirteçlerin Sphecidae familyası türleri için de belirlenmesi amaçlanmıştır. Bunun için, belirlenen türlere ait örneklerin 28S-D2 rDNA ve ITS-2 gen bölgelerinin analizi yapılmış ve bu bölgeler karşılaştırılmıştır. Analizi yapılan gen bölgelerinin tür ayırımında kullanılabilirliğinin test edilmesi de çalışmanın hedeflerindendir.
2. LİTERATÜR ÖZETİ
Ülkemizde ve dünyada Sphecidae familyasına ait yaban arıları ile ilgili moleküler çalışma yok denecek kadar azdır. Yapılan moleküler çalışmalar çoğunlukla Hymenoptera takımının parazit veya parazitoit olan gruplarıyla ilgilidir.
Doğanlar ve ark., (2010) Thrips parazitoiti olan Ceranius (Hymenoptera: Eulophidae) cinsinin morfolojik yapısı ve 28S D2 rDNA gen bölgelerinin karşılaştırılmasını esas alarak Türkiye'deki güncel taksonomik durumlarının belirlenmesi ile ilgili çalışma yapmışlardır.
Ercan ve ark., (2011) teşhislerinde güçlük çekilen iki Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) türünün, ribozomal DNA ITS2 gen bölgesinin sekans dizisi kullanılarak birbirlerinden ayırt edilebildiklerini göstermişlerdir.
Sphecidae familyası ile ilgili Field ve ark., (2011) Ammophilini (Hymenoptera, Apoidea, Sphecidae) tribüsündeki kazıcı yaban arılarının mitokondriyal sitokrom oksidaz I, nükleer uzama faktörü 1α ve LW rhodopsin gen bölgelerini kullanarak moleküler filogenisi ile ilgili çalışma yürütmüşler ve sistematik durumlarını değerlendirmişlerdir.
Lohrmann ve ark. (2008) Sphecidae familyası ve Apoidea üst familyasını temsil eden farklı örneklerden elde ettikleri mitokondriyal sitokrom oksidaz subunit I ve nükleer long-wavelength-rhodopsin gen bölgesi sekanslarını çeşitli metotlarla analiz ederek daha önceden yapılmış olan morfolojik temelli filogenetik çalışmalarla karşılaştırmışlardır.
Quicke ve ark., (2011) 28 S rDNA gen bölgesi ve morfolojik karakterleri karşılaştırarak Ichneumonidae (Insecta : Hymenoptera) familyasının filogenisini çıkartmışlardır.
Chen ve ark., (2004) nükleer 28S, 18S ve mitokondriyal 16S, COI genlerinden kısmi DNA sekans verilerini kullanarak Eurytomidae (Insecta: Hymenoptera) familyasının filogenisini tekrardan oluşturmuşlardır.
Babcock ve Heraty (2000) Parazitoit olan ve morfolojik olarak birbirlerinden ayrılması oldukça güç olan Encarsia formosa Gahan ve Encarsia luteola Howard (Hymenoptera:Aphelinidae ) türlerinin 28S-D2rDNA gen bölgesini kullanarak bu türlerin kesin olarak birbirlerinden ayırt edilebildiklerini göstermişlerdir.
5
Lohrmann ve ark., (2008) Apoidea üst familyasına ait farklı örnekler ile Sphecidae familyasına ait yaban arılarının Long wavelenght rhodopsin ve mitokondriyal sitokrom-c-oksidaz (subunit I) gen bölgelerinin sekanslarını analiz ederek sistematik ilişkilerini araştırmıştır.
Ciociola ve ark., (2001) birbiriyle oldukça benzer olan T. rojasi Nadaraja ve T. lasallei Pinto (Hymenoptera: Trichogrammatidae) türlerini ITS2 gen bölgesini kullanarak ayırt etmeye çalışmışlardır. Örneklerden elde edilen PCR ürünlerini sekans analizine göndermişlerdir ve elde edilen verilere göre türlerin birbirlerinden ayırt edilebildiğini göstermişlerdir.
3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal
Sphecidae familyasına ait örnekler, doğal habitatlarından Nisan 2011- Ekim 2012 tarihleri arasında Tokat il sınırları içindeki bölgeden toplanmıştır. Atrapla yakalanan örnekler etil asetat (EtOAc) ile hazırlanmış öldürme şişelerinde öldürülmüş ve kutular içerisinde laboratuara getirilmiştir. Tür teşhisleri, tez danışmanı Yrd. Doç. Dr. Yaşar GÜLMEZ gözetiminde Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen - Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Entomoloji Araştırma Laboratuarı'nda yapılmış ve laboratuarda bulunan karşılaştırma materyali ile karşılaştırılarak doğrulanmıştır.
Bu tezde, Sphecidae familyasındaki 4 cinse ait 9 tür moleküler çalışma yapmak üzere kullanılmıştır. Bu örneklerin büyük bir çoğunluğu araziden toplandıktan sonra - 20 0
C'de saklanmış olan taze materyaldir. Geri kalan az bir kısmı ise daha önceden toplanmış ve koleksiyon yapılmış kuru örneklerdir. Tablo 3.1 'de çalışmada kullanılan örneklerle ilgili bilgiler verilmiştir.
Araziden yeni toplanan örnekler tarih ve habitat bilgileri içeren etiketler ilave edildikten sonra moleküler çalışmalar yapılana kadar -20 0C’de saklanmıştır.
Çizelge 3.1. Moleküler çalışmalarda kullanılan örneklerle ilgili veriler (♀: Dişi, ♂: Erkek).
Tür ismi Cinsiyet Toplama Yeri Tarih
Sphex (Sphex)
pruinosus Germar, 1817
♂ Ankara/ Keçiören / Bağlum, 1050m
Kuru Örnek 01.07.2002 Sphex
(Fernaldina) melanocnemis Kohl, 1885
♂ Ankara/ Çankaya / Keklikpınarı 1250m Kuru Örnek 30.07.2009
Sphex (Sphex)
flavipennis Fabricius, 1793
♂ Tokat/ Merkez / Taşlıçiftlik, 650 m
Taze örnek 25.07.2012
Sphex (Sphex)
flavipennis Fabricius, 1793
7
Çizelge 3.1. (Devam) Moleküler çalışmalarda kullanılan örneklerle ilgili veriler (♀: Dişi, ♂:Erkek)
3.1.1. Kullanılan kimyasal maddeler, malzemeler ve cihazlar
Pfu Polimeraz Enzim (Gaziosmanpaşa Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü), Proteinaz K (Roche), ATL Lysis Tamponu (200 ml/Qiagen), AL Tamponu (54x4 ml/Qiagen), AW1 Wash Buffer konsantresi (95 ml/Qiagen), AW2 Wash Buffer Konsantresi (66 ml/Qiagen), Moleculer Biology Grade Water (Fermentas), VC 1 kb DNA Ladder (Vivantis), absolute ethanol(Merck), agar (Promega), TAE/TBE tamponu, Etidium bromür, Bromophenol blue (Sigma), mezür, erlen, beher, makas, bistüri, cam şişeler (500 ml, 1000 ml), eppendorf tüpü RNAaz DNAaz free (1.5 ml), DNA spin filtre seti (2 ml), pipetler (2, 10, 200, 1000 µl’lik), pipet ucu (1-200 µl’lik), pipet ucu
(100-Sphex (Sphex)
funerarius Gussakovsky, 1934
♂ Sivas/ Zara / Kümbet, 1500 m Taze örnek 13.07.2012
Sphex (Sphex)
funerarius Gussakovsky, 1934
♀ Sivas/ Zara/ Kümbet, 1500 m
Taze örnek 13.07.2012 Ammophila
heydeni Dahlbom, 1845
♂ Tokat / Almus / Merkez, 945m Taze örnek 24.08.2011 Ammophila
heydeni Dahlbom, 1845
♀ Tokat / Almus / Merkez, 945 m Taze örnek 27.07.2011 Ammophila
sabulosa
(Linnaeus, 1758)
♂ Tokat / Almus / Merkez, 945 m
Taze örnek 24.08.2011 Ammophila
sabulosa
(Linnaeus, 1758)
♀ Tokat / Almus / Merkez, 945 m Taze örnek 27.07.2011
Prionyx kirbyi
(Vander Linden, 1827)
♂ Tokat / Almus / Merkez, 945 m
Taze örnek 24.08.2011
Prionyx nudatus
(Kohl, 1885) ♂
Tokat / Almus / Merkez, 945 m4
Taze örnek 24.08.2011 Sceliphron
(Sceliphron)
spirifex (Linnaeus, 1758)
♂ Tokat / Turhal Yolu/ Kömeç Köyü / 600 m Kuru örnek
8
1000 µl), pipet ucu (2-10 µl’lik), steril pastör pipeti (1ml), mikrosantrifüj ve PCR tüpleri (0,2 µl) , PCR rack (tüplük), Yatay elektroforez (Carolina), Güç kaynağı (Consort), Thermal cycler (Peqlab), Vortex (Ika), Santrifüj (Eppendorf, Hettich), UV transillüminatör (Syngene), İnkübatör, Mikrodalga fırın (Arçelik), Fotoğraf makinası (Sony), Hassas terazi (Acculab) gibi muhtelif laboratuar malzeme ve imkanları kullanılmıştır.
3.1.2. Primerlerin hazırlanması
Çalışmada kullanılan primerler literatür taramalarında rastlanılan ve çalıştığımız Sphecidae familyasının da içerisinde bulunduğu Hymenoptera takımının türleri üzerinde daha önceden yapılmış olan moleküler sistematik çalışmalarda kullanılan primerler arasından seçilmiştir. Seçilen primerler 28S-D2 rDNA ve ITS2 gen bölgelerini çoğaltmaktadır. Kullanılan primerler tablo 3.2 'de gösterilmiştir.
Çizelge 3.2. Moleküler çalışmada 28S-D2 rDNA ve ITS2 gen bölgelerini çoğaltmak için
kullanılan primerler.
Primerin Adı Dizi Kaynak
28S-D2 rDNA Forward
(5’- CGT GTT GCT TGA TAG TGC AGC – 3’) Campbell ve ark., 2000 28S-D2 rDNA
Reverse
(5’-TTG GTC CGT GTT TCA AGA CGG G-3’) Campbell ve ark., 2000 Tr ITS2
Forward
(5’- TGT GAA CTG CAG GAC ACA TG – 3’) Cıocıola ve ark., 2001 Tr ITS2 Reverse (5’- GTC TTG CCT GCT CTG AG – 3’) Cıocıola ve ark., 2001 Tick ITS2 Forward
(5’- CGA GAC TTG GTG TGA ATT GCA -3’) Chitimia ve ark., 2009 Tick ITS2
Reverse
(5’- TCC CAT ACA CCA CAT TTCCCG -3’) Chitimia ve ark., 2009 Tc ITS2
Forward
(5’- TTC TCG CAT CGA TGA AGA ACG - 3’) Zheng-Xı Lı, 2007
Tc ITS2 Reverse
(5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC – 3’) Zheng-Xı Lı, 2007
9
3.2. Metot
Çalışmamız Sphecidae familyasına ait bazı yaban arısı türlerinin moleküler yöntemlerle birbirinden ayrılmasına dayandığından, ilk aşamada yaban arılarının total DNA izolasyonları yapılmış, ardından izole edilen total DNA içerisinden uygun primerlerle karşılaştırma yapılacak olan gen bölgelerinin çoğaltılması için standart PCR işlemi gerçekleştirilmiştir.
PCR işlemini takiben yapılan elektroforez ile 28S rDNA D2 ve ITS2 gen bölgeleri belirlenmiş, seçilen örneklerin DNA dizilemesi uygun laboratuarlara gönderilerek yaptırılmıştır.
3.2.1. Total DNA izolasyonu
Yaban arısı örnekleri -20 0C' den çıkartılarak steril petri kabına koyulduktan sonra, steril bistüri ve makas yardımıyla baş, toraks ve abdomen kısımları ayrılmıştır. Baş ve toraks kısmı moleküler çalışmalarda kullanılmıştır. Örnekler steril 2 ml'lik eppendorf tüplere alınmıştır. Ardından her tüpün içerisine 180 µl ATL Lysis Buffer konarak steril pestıl ile homojenize edilmiştir. Homojenize edilen örnekler üzerine 40 µl proteinaz K ilave edilmek suretiyle 56 0C'de 1 gece (en az 12 saat) inkübe edilmiştir.
Ertesi gün inkübasyondan alınan örneklerin her birine 220 µl AL Buffer konarak vortekslenmiş ve 72 0C'de 10 dk inkübe edilmiştir.
İnkübe edilen örnekler üzerine daha sonra 250 µl etanol eklenip vortekslenmiş ve yaban arısı parçaları hariç tüm sıvı kısım filtreli tüpe aktarılarak 1 dk süreyle 12000 rpm'de santrifüje tabi tutulmuştur. Geri kalan yaban arılarının parçaları atılmıştır.
Sıvı kısmın santrifüj sonrası filtreden geçerek biriktiği tüp atılmış yeni bir tüpün üzerine yerleştirilen filtreli tüpe bu kez 500 µl AW1 Washing Buffer konarak 1 dk. 12000 rpm'de santrifüj edilmiştir. Alttaki sıvının biriktiği tüp atılarak yen, bir tüp üzerime filtre yerleştirilerek üzerine 500 µl AW2 Washing Buffer konulmuş ve yine 1 dk. 12000 rpm'de santrifüjü sağlanmıştır.
Bu işlem sonrasında altta biriken sıvı kısım tüpten atılarak kurulanmış ve filtre üzerine yeniden yerleştirilerek 2 dk 12000 rpm'de boş olarak santrifüj edilmiştir.
Spin edilen örneklerdeki filtre kısmı etiketlenmiş eppendorflara yerleştirilmiştir. Üzerlerine 70 0C sıcaklığındaki Moleculer Biology Grade Water ilave edilerek 12000
10
rpm'de 1 dk santrifüj edilmiştir. Ardından filtreli tüp atılarak alttaki DNA örneği, +4 0 C' de PCR işlemi yapılıncaya kadar saklanmıştır.
3.2.2. Polimer zincir reaksiyonu (PCR)
Elde edilen Genomik DNA örnekleri içerisinden istenilen gen bölgelerinin çoğaltılabilmesi için PCR işlemine tabi tutulmuştur. Bunun için etiketlenmiş PCR tüpleri içerisine; 5 µl PCR Buffer 1 µl Pfu Enzimi1 1 µl dNTP 2 µl Forward primer 2 µl Reverse primer 2 µl Template DNA ve
12 µl PCR grade water eklenerek vortekslenir. Tüm PCR reaksiyonlarında toplam hacim 25 μl ‘dir.
Her iki gen bölgesinin çoğaltılmasında aynı PCR koşulları uygulanmıştır. 28S-D2 ve ITS2 gen bölgeleri için PCR koşulları;
94°C’de 5 dk.
35 döngünün her biri için,
94 °C’de 60 sn.,
55 °C’de 60 sn.,
72 °C’de 5 dk. şeklindedir.
Yaklaşık 3 saat 5 dakika süren işlem sonrası alınan PCR ürünleri +4 °C’de elektroforez yapılıncaya kadar saklanmıştır.
3.2.3. Agaroz jel elektroforezi
Elektroforezde uygun primerlerle çoğaltılan DNA örneğinin agaroz jelde yürütülmesi ile türler arasındaki aranan farklı DNA bantlarının UV transilluminatör altında 380 nm’lik alandaki absorbansı araştırılmıştır. PCR sonrasında elde edilen ürünler %1’lik
1
DNA örnekleri nin PCR işlemleri, Gaziosmanpaşa Üniversitesi Mühendislik ve Doğa Bilimleri Fakültesi, Biyomühendislik Bölümü’nde Prof. Dr. İsa Gökçe tarafından üretilen Pfu DNA polimeraz enzimi ile yapılmıştır.
11
agaroz jel elektroferezi kullanılarak yürütüldü. Bunun için 50 ml TAE veya TBE içerisinde çözülen 0,5 gr agar içerisine 0,5 μl etidyum bromür ilave edilerek tanka boşaltılır. Soğuyan jel üzerindeki kuyucuklardan ilkine boyalı halde bulunan VC 1kb DNA Ladder’dan 2-4 μl, sonraki her bir kuyucuğa ise 4 μl brom fenol blue ve 5 μl DNA örneği karışımından 8 μl eklenerek elektroforez çalıştırılır. İşlem sonrası alınan jeller 380-450 nm dalga boyundaki UV altında bakılarak fotoğraflanır.
3.2.4. DNA dizi analizi
Jel elektroforezi sonucunda elde edilen şüpheli DNA bantları veren örneklere ait PCR ürünleri DNA dizisinin belirlenmesi için REFGEN (Ankara) firmasına gönderildi. Elde edilen sekanslar Bioedit programı kullanılarak birbirleriyle karşılaştırılmıştır.
4. BULGULAR
Çalışma sonucunda Sphex melanocnemis, Sphex pruinosus, Sphex flavipennis, Sphex funerarius, Ammophila heydeni, Ammophila sabulosa, Prionyx kirbyi ve Prionyx nudatus, Sceliphron spirifex türlerinden ITS2 ve 28S-D2 rDNA gen bölgelerine ait PCR ürünleri başarılı bir şekilde elde edilmiştir. Bu türlerden A. heydeni, A. sabulosa, P. kirbyi, ve P. nudatus türlerinden hem ITS2 hem de 28S-D2 gen bölgesine ait PCR ürünleri elde edilmiştir. S. pruinosus, S. melanocnemis ve S. spirifex türlerinden sadece ITS2 gen bölgesinin PCR ürünleri elde edilmiştir. S. flavipennis ve S. funerarius türlerinden ise sadece 28S-D2 rDNA gen bölgelerine ait ürünler elde edilmiştir. 28S-D2 rDNA gen bölgesine ait olan PCR ürünleri yaklaşık olarak 630 bç büyüklüğündedir ve tüm türlerde aynı boyuttadır. Bu gen bölgesine ait PCR ürünleri sekans analizine gönderilerek nükleotit dizisi belirlenmiştir. Sekans analizi sonucunda da bu gen bölgesinin karşılaştırılmasıyla türler birbirlerinden ayırt edilememiştir.
A. heydeni, A. sabulosa, P. kirbyi ve P. nudatus türlerinden elde edilen genomik DNA'lardan 28S-D2 rDNA primeri ile yapılan PCR sonucunda yaklaşık 630 bç büyüklüğünde tek bantlık PCR ürünleri elde edilmiştir. Sonuç olarak bu primerle bu türlerin birbirinden ayrılması mümkün olmamıştır (Şekil 4.1).
Şekil 4.1. A. sabulosa, A. heydeni, P. kirbyi ve P. nudatus türlerinin 28S rDNA primeri ile analizi (Yaklaşık 630 bç). Kuyucuk 1: Standart DNA 1000 bç,
Kuyucuk 2: A. heydeni (♂), Kuyucuk 3: A. sabulosa (♂), Kuyucuk 4: A. heydeni (♀),Kuyucuk 5: A. sabulosa (♀), Kuyucuk 6: P. kirbyi (♂), Kuyucuk 7: P. nudatus (♂).
13
Ayrıca A. heydeni ve A. sabulosa türlerinden elde edilen genomik DNA'lardan Tr ITS2 primeri ile PCR yapılmıştır. Şekil 4.2' de gösterildiği gibi PCR sonucunda elde edilen Tr ITS2 PCR ürünlerinin boyutları karşılaştırıldığında bu türlerin birbirlerinden rahatlıkla ayrılabildiği görülmektedir. Sonuç olarak Tr ITS2 primerinin bu iki türün tespitinde kullanılabileceği düşünülmektedir.
P. kirbyi ve P. nudatus türlerinden elde edilen genomik DNA'lar Tr ITS2 primeriyle PCR yapılmıştır. Sonuç olarak P. kirbyi'den belirgin 4 bant, P. nudatus türünden ise belirgin 3 bant elde edilmiştir ve agaroz jel görüntüsüne bakarak türlerin ayırt edilebildiği görülmektedir (Şekil 4.2).
Tr ITS2 primeri ile PCR yapılan ve karşılaştırma amacıyla kullanılan Sceliphron spirifex türünün PCR ürünü agaroz jel görüntüsünde her iki cinse ait türlerden rahatlıkla ayırt edilebilmektedir (Şekil 4.2).
Şekil 4.2. P. kirbyi, P. nudatus, A. heydeni, A. sabulosa, Sceliphron spirifex türlerinin Tr ITS2 primeri ile analizi. Kuyucuk 1: DNA standart, 1000 bç, Kuyucuk 2: P. kirbyi, Kuyucuk 3: P. nudatus, Kuyucuk 4: A. heydeni, Kuyucuk 5: A. sabulosa, Kuyucuk 6: Sceliphron spirifex (♂).
S. melanocnemis ve S. pruinosus türlerinden elde edilen genomik DNA'lar TcITS2 ve TrITS2 primerleri ile PCR yapılmıştır. Tc ITS2 primeri ile yapılan PCR sonucunda S. pruinosus türünden yaklaşık 300 ve 400 bç'lik iki bant elde edilmiştir. S. melanocnemis türünden ise yaklaşık 350 bç büyüklüğünde tek bir bant elde edilmiştir. Tr ITS2 primeri ile yapılan PCR sonucunda S. pruinosus türünden yaklaşık 200 bç'lik tek bir bant, S.
14
melanocnemis türünden ise yaklaşık 200 ve 270 bç'lik iki bant elde edilmiştir. Elde edilen PCR ürünlerinin boyutları agaroz jel görüntüsünde gösterilmiştir (Şekil 4.3 ve Şekil 4.4 ).
Şekil 4.3. S. pruinosus ve S. melanocnemis türlerinin Tc ITS2 primeri ile analizi. Kuyucuk 1: DNA standart, 1000 bç, Kuyucuk 2: S. pruinosus (♂), Kuyucuk 3: S. melanocnemis (♂).
Şekil 4.4. S. pruinosus ve S. melanocnemis türlerinin Tr ITS2 primeri ile analizi. Kuyucuk 1: DNA standart, 1000 bç, Kuyucuk 2: S. pruinosus (♂), Kuyucuk 3: S. melanocnemis (♂).
Birbirlerine oldukça benzeyen ve morfolojik olarak ayırt edilebilmeleri güç olan S. flavipennis ve S. funerarius türlerinden elde edilen total DNA'dan 28S-D2 rDNA primeri kullanılarak PCR yapılmıştır. Elde edilen PCR ürünlerinin büyüklüğü her iki tür içinde aynı olup 630 bç büyüklüğündedir ve agaroz jelde gösterilmiştir. (Şekil 4.5). Elde
15
edilen PCR ürünleri sekans analizine gönderilerek nükleotit dizileri belirlenmiştir. Farklı türler olmasına rağmen elde edilen sekans dizileri yüksek oranında benzerlik göstermiştir.
Şekil 4.5. S. flavipennis ve S. funerarius türlerinin 28S-D2 rDNA primeri ile analizi (630 bç) . Kuyucuk 1: DNA standart, 1000 bç, Kuyucuk 2: S. flavipennis (♂), Kuyucuk 3: S. flavipennis (♀), Kuyucuk 4: S. funerarius (♂), Kuyucuk 5: S. funerarius (♀)
Çizelge 4.1. S. flavipennis ve S. funerarius türlerinin 28S- D2 rDNA gen bölgesinin sekans dizisi (a39: S. flavipennis (♂), a40: S. flavipennis (♀), a41: S. funerarius (♂), a42: S. funerarius (♀)).
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
10 20 30 40 50
a39 TCGTGTTGCT TGATAGTGCA GCTCTAAGTG GGTGGTAAAC TCCATCTAAG
a40 TCGTGTTGCT TGATAGTGCA GCTCTAAGTG GGTGGTAAAC TCCATTTATG
a41 -CGTGTTGCT TGATAGTGCA GCTCTACGTG GGTGGTAAAC TCCATCTAAG
a42 TCGTGTTGCT TGATAGTGCA GCTCTAAGTG GGTGGTAAAC TCCATCTAAG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
60 70 80 90 100
a39 GCTAAATATG ACCACGAGAC CGATAGCGAA CAAGTACCGT GAGGGAAAGT a40 GCTAAATATG ACCACGAGAC CGATAGCGAA CAAGTACCGT GAGGGAAAGT a41 GCTAAATATG ACCACGAGAC CGATAGCGAA CAAGTACCGT GAGGGAAAGT a42 GCTAAATATG ACCACGAGAC CGATAGCGAA CAAGTACCGT GAGGGAAAGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
110 120 130 140 150
a39 TGAAAAGAAC TTTGAAGAGA GAGTTCAAGA GTACGTGAAA CCGTTCAGGG a40 TGAAAAGAAC TTTGAAGAGA GAGTTCAAGA GTACGTGAAA CCGTTCAGGG a41 TGAAAAGAAC TTTGAAGAGA GAGTTCAAGA GTACGTGAAA CCGTTCAGGG a42 TGAAAAGAAC TTTGAAGAGA GAGTTCAAGA GTACGTGAAA CCGTTCAGGG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
160 170 180 190 200
a39 GTAAACCTGA GAAACCCAAA AGATCGAACG GGGAGATTCA TCGTCAGCGG a40 GTAAACCTGA GAAACCCAAA AGATCGAACG GGGAGATTCA TCGTCAGCGG a41 GTAAACCTGA GAAACCCAAA AGATCGAACG GGGAGATTCA TCGTCAGCGG a42 GTAAACCTGA GAAACCCAAA AGATCGAACG GGGAGATTCA TCGTCAGCGG
16
Çizelge 4.1. (Devam) S. flavipennis ve S. funerarius türlerinin 28S D2 rDNA gen bölgesi sekans dizisi.
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
210 220 230 240 250
a39 CGCTGGCTTC ACGATGATGC GTGATGCTCC GAATGGGCCT CGGTCCACTG a40 CGCTGGCTTC ACGATGATGC GTGATGCTCC GAATGGGCCT CGGTCCACTG a41 CGCTGGCTTC ACGATGATGC GTGATGCTCC GAATGGGCCT CGGTCCACTG a42 CGCTGGCTTC ACGATGATGC GTGATGCTCC GAATGGGCCT CGGTCCACTG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
260 270 280 290 300
a39 CGAGAGCACG CCATCGTCGA CGAACGTCTG GCGTCGTCGG CGTGCACTTC a40 CGAGAGCACG CCATCGTCGA CGAACGTCTG GCGTCGTCGG CGTGCACTTC
a41 CGAGAGCACG CCATCGTCGA CGAACGTCCG GCGTCGTCGG CGTGCACTTC
a42 CGAGAGCACG CCATCGTCGA CGAACGTCCG GCGTCGTCGG CGTGCACTTC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
310 320 330 340 350
a39 TCCCCTAGTA GAACGTCGCG ACCCGTTGGG TGTCGGTCTA CGGCCCGGGT a40 TCCCCTAGTA GAACGTCGCG ACCCGTTGGG TGTCGGTCTA CGGCCCGGGT a41 TCCCCTAGTA GAACGTCGCG ACCCGTTGGG TGTCGGTCTA CGGCCCGGGT a42 TCCCCTAGTA GAACGTCGCG ACCCGTTGGG TGTCGGTCTA CGGCCCGGGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
360 370 380 390 400
a39 GGGCGCCTGT CGCGTCGTCT CGCGCGATCG CGGCAGACCC CCGGTCGCCC a40 GGGCGCCTGT CGCGTCGTCT CGCGCGATCG CGGCAGACCC CCGGTCGCCC a41 GGGCGCCTGT CGCGTCGTCT CGCGCGATCG CGGCAGACCC CCGGTCGCCC a42 GGGCGCCTGT CGCGTCGTCT CGCGCGATCG CGGCAGACCC CCGGTCGCCC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
410 420 430 440 450
a39 GGCCGGCTGC CCGGCGGTAC TCGCACGGTA TAGGGCCGCA GCTTCAATGT a40 GGCCGGCTGC CCGGCGGTAC TCGCACGGTA TAGGGCCGCA GCTTCAATGT a41 GGCCGGCTGC CCGGCGGTAC TCGCACGGTA TAGGGCCGCA GCTTCAATGT a42 GGCCGGCTGC CCGGCGGTAC TCGCACGGTA TAGGGCCGCA GCTTCAATGT
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
460 470 480 490 500
a39 GCGTCCAGGC CCGCCGCAGG CGCGGTCAGT GTATACCCGG ATGTACGGAC a40 GCGTCCAGGC CCGCCGCAGG CGCGGTCAGT GTATACCCGG ATGTACGGAC a41 GCGTCCAGGC CCGCCGCAGG CGCGGTCAGT GTATACCCGG ATGTACGGAC a42 GCGTCCAGGC CCGCCGCAGG CGCGGTCAGT GTATACCCGG ATGTACGGAC
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
510 520 530 540 550
a39 TTTGCGCCGT CACCGGGCCT GACCCGCTGT TCGCAAGCGC GGTGTCCTCG a40 TTTGCGCCGT CACCGGGCCT GACCCGCTGT TCGCAAGCGC GGTGTCCTCG a41 TTTGCGCCGT CACCGGGCCT GACCCGCTGT TCGCAAGCGC GGTGTCCTCG a42 TTTGCGCCGT CACCGGGCCT GACCCGCTGT TCGCAAGCGC GGTGTCCTCG
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
560 570 580 590 600
a39 GACTGGCCAA GCCACGTAAT ACCGGTCGGC GACGCTACTG CTTTGGGTAC a40 GACTGGCCAA GCCACGTAAT ACCGGTCGGC GACGCTACTG CTTTGGGTAC a41 GACTGGCCAA GCCACGTAAT ACCGGTCGGC GACGCTACTG CTTTGGGTAC a42 GACTGGCCAA GCCACGTAAT ACCGGTCGGC GACGCTACTG CTTTGGGTAC
....|....| ....|....| ....|....| . 610 620 630
a39 TCTCAGGACC CGTCTTGAA- CACGGACCAA A a40 TCTCAGGACC CGTCTTGAA- CACGGACCAA A
a41 TCTCAGGAAC CGTCTTGAAA CACGGACCAA A
5. TARTIŞMA VE SONUÇ
Sphecidae familyasına ait bazı türlerin morfolojik açıdan teşhislerinde, mevcut tanı anahtarlarında kullanılan karakterler; renklenme, çeşitli vücut yapılarının boy oranları ve tüylenme gibi vücut özellikleridir. Renk karakterleri çoklu kalıtım (genetik ve ekolojik temelli) gösterdikleri için aynı türün farklı populasyonları arasında yada aynı populasyonun bireyleri arasında bile değişkenlik gösterebilmektedir. Ayrıca kurumuş ve eski örneklerde bu karakterlerin deforme olması da tür ayırımını zorlaştırmaktadır. Moleküler yöntemler, morfolojik tür teşhisine yardımcı olmak üzere birbirine yakın taksonların ayırımında kullanılabilecek veriler sağlayabilir. Örneğin ribozomal DNA ve mitokondriyal DNA gen bölgeleri, tür içinde korunan fakat türler arasında farklılık gösteren yapıda olduklarından, taksonların sistematik yönden incelenmesi ve filogenetik ilişkilerin belirlenmesinde oldukça faydalı olmaktadır.
Ribozomal DNA türlerin birbirlerinden ayrılmasında kullanılan önemli bir hedef bölgedir. Çünkü ribozomal gen bölgeleri yüksek oranda korunmuştur. Ribozomal gen bölgelerinden büyük alt birim (28S) ve ITS2; birbiriyle benzer olan türlerin ayrımında, cryptic türlerin teşhisinde hatta populasyon genetiği çalışmalarında kullanılmıştır (Wagener ve ark., 2004; Ashfaq ve ark., 2005; Prinsloo ve ark., 2002; Stouthamer ve ark., 1999; Alvarez ve Hoy, 2002; Campbell ve ark., 1993; Rokas ve ark., 2002). Ribozomal DNA gen bölgeleri, kendi içerisinde birçok kopyaya sahip olduğundan polimer zincir reaksiyonu (PCR) ile kolayca çoğaltılabilir. Bu yüzden özellikle internal transcribed spacer bölgeleri (ITS-1 ve ITS-2), tür içi veya türler arası düzeyde, böceklerde önemli bir taksonomik araç olarak kullanılmaktadır (Campbell et al., 1993; Ercan ve ark., 2011; Ciociola ve ark., 2001; Alvarez ve Hoy, 2002). ITS2’nın sekansları tür içinde çok az değişiklik gösterirken, türler arasında anlamlı farklılıklar meydana getirmektedir.
Morfolojik olarak birbirine yakın türlerin teşhisinde kullanılabilecek moleküler markör seçimi oldukça önemlidir. Bazı taksonların ayırımında kullanılabilen markörler, diğer taksonların ayırımında uygun olmayabilir. Bu çalışmada incelenen ITS2 primerlerinin Prionys kirbyi – Prionyx nudatus, Sphex pruinosus – Sphex melanocnemis ve Ammophila heydeni – Ammophila sabulosa türlerini birbirinden ayırmaya uygun bir markör olabileceği görülmüştür. İncelenen örneklerde 28S-D2 rDNA primerleri ile
18
yapılan çalışmalarda ise tür ve cinsler arasında önemli farklılık bulunmamıştır. Birbirine morfolojik olarak oldukça yakın olan Sphex flavipennis ile Sphex funerarius türlerine ait örneklerden elde edilen PCR ürünlerinin sekans analizleri sonucu birbirinden farklılık göstermemiştir. Dolayısıyla bu gen bölgesine ait primerin çalışılan bu Sphex türlerini ayırmada kullanılabilecek veri içermediği görülmektedir.
ITS2 ve 28S D2 rDNA gen bölgelerine ait primerler, Sphecidae familyasına ait türlerin teşhisinde de tek başına kullanılamaz. Ancak elde edilen bu çeşit moleküler veriler, geleneksel yöntemlerle teşhis edilen taksonların doğrulanması veya bazı sistematik problemlerin çözümünde yararlı sonuçlar sağlayabilir. İleride yapılacak çalışmalarla daha kesin sonuç verebilen yöntemler geliştirilip, taksonların teşhislerinde moleküler anahtarlar hazırlanabilir.
Bu çalışmanın sonuçları çalışmada kullanılan primerlerin çalışılan türlerin moleküler sistematiği için yeterliği olmadığını göstermiştir. Bu nedenle bu türlerin ayrılması için türlerin moleküler sistematiğinde kullanılabilir yeni primerlerin dizayn edilmesi ve test edilmesi gerekmektedir.
19
KAYNAKLAR
Al-Barrak, M, Loxdale, H.D., Brookes, C.P., Dawah, H.A., Biron, D.G., andO. Alsagair(2004). Molecular evidence using enzyme and RAPD markers for sympatric evolution in British species of Tetramesa(Hymenoptera: Eurytomi-dae). Biol. J. Linn. Soc.. 83, 509-525.
Alvarez, J. M., ve Hoy, M. A. 2002. Evalution of the Ribosomal ITS2 DNA Sequence in Separating Closely Related Populations of the Parasitoid Ageniapsis (Hymenoptera: Encyrtidae)
Ashfaq A., Erlandson M. & Braun L., 2005: Hyperparasitismby Mesochorusspp.(Hymen-optera: Ichneumonidae) in Peristenus sp. (Hymenoptera: Braconidae) and development of PCR primers for hyperparasitoid detection. Biol. Control 32: 371-377.
Bitsch, J.,Barbier, Y., K. Schmidt, S.F. Gayubo, A.V., OHL, M., 1997. Hymenopteres Sphecidaed’ Europe Occidentale, Volume 2, Fédération Française des Sociétés De Sciences naturelles, 429 p, France.
Bohart, R.M., and A.S. Menke, 1976. Sphecid Wasps of the World. A generic revision. University of California Press, Berkeley, Los Angeles, London. 1 color plate, IX+695 pp.
Cameron, S. A. 1993. Multiple origins of advanced eusociality in bees inferred from mitochondrial DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:8687-8691. Campbell, B. C., J. M. Heraty, J. Y. Rasplus, K. Chan, J. D. Steffen-Campbell, and C.
S. Babcock. 2000. Molecular systematics of the Chalcidoidea using 28S-D2 rDNA. Pp. 59–73 in A. D. Austin and M. Dowton, eds. Hymenoptera, evolution, biodiversity and biological control. CSIRO Publishing, Collingwood, Australia.
Campbell, B., Steffen-Campbell, J. D. ve Werren, J. H. 1993. Phlogeny of the Nasonia species complex (Hymenoptera: Pteromalidae) inferred from an internal transcribed spacer ITS2 and 28S rDNA sequences. Insect Molecular Biology, 2:225-237.
Carpenter, J.M. ve Wheeler, W.C. 1999. Towards simultaneous analysis of morphological and molecular data in Hymenoptera. Zoologica Scripta, 28, 1-2, pp251-260.
Carr, M., Young, P.W. and Mayhew, P.J., 2010. Phlogeny of bethylid wasps (Hymenoptera:Bethylidae) inferred from 28S and 16S rRNA genes. Insect Systematics and Evolution 41 (2010) 55-73.
Chang, S.C., Hu, N.T., Hsin, C.Y., and C.N. Sun. 2001. Characterization of differences between two Trichogramma wasps by molecular markers. Biol. Control. 21, 75-78.
Chen, Y., Xiao, H., Fu, J., ve Huang, D. 2004. A molecular phylogeny of eurytomid wasps inferred from DNA sequence data of 28S, 18S, 16S and COI genes. Molecular Phylogenetics and Evolution. 31(2004) 300-307.
Chitimia, L., Lin, R.Q., Cosoroaba, I., Braila, P., Song, H. Q., ve Zhu, X. Q. 2009. Molecular characterization of hard and soft ticks from Romania by sequences of the internal transcribed spacers of ribosomal DNA. Parasitol. Res., 105:907–911.
20
Ciociola Jr., A.I., Querino, R.B., Zucchi, R.A. and Stouthamer, R. 2001. Molecular Tool for Identification of Closely Related Species of Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae): T. rojasi Nagaraja and T. lasallei Pinto. Journal of Neotropical Entomology, 30(4): 575-578.
De Beaumont, J. 1967. Hymenoptera from Turkey. Sphecidae, I. Bull. Brit. Mus. (Nat. Hist.)Entomol., 19; 253–382.
De León J. H. ve Jones, W. A. 2005. Genetic differentiation among geographic populations of Gonatocerus ashmeadi, the predominant egg parasitoid of the glassy-winged sharpshooter, Homalodisca coagulata. J. Insect Sci. 5: 1– 9. Doğanlar, O., Doğanlar, M., ve Frary, A. 2010. Preliminary phlogeny of the trips
parasitoids of Turkey based on some morphological scales and 28S D2 rDNA with description of a new species. Turk. J. Zool. 34 (2010) 279-289.
Dowton, M., ve Austin, A.D. 1998. Phylogenetic Relationships among the Microgastroid Wasps (Hymenoptera: Braconidae): Combined Analysis of 16S and 28S rDNA Genes and Morphological Data. Mol. Phy. and Evolution, Vol. 10, No. 3, pp 354-366
Field, J., Ohl, M. and Kennedy, M., 2011.A molecular phylogeny for digger wasps in the tirbe Ammophilini (Hymenoptera,Apoidea , Sphecidae). Systematic Entomology, 36, 732- 740.
Gauld , I.D. & Bolton , B. ( 1988 ). The Hymenoptera. British Museum (Natural History), London, and Oxford University Press, Oxford, 332.
Goulet, H. and J. T. Huber. 1993. Hymenoptera of the world: An identification guide to families. Centrefor Land and Biological Resources Research, vii+668 pp, Ottawa, Ontario.
Gülmez, Y. and Tüzün, A (2005): Spheciformes (Hymenoptera: Apoidae) from Ankara Province. Subfamilies: Sphecinae, Pemphredoninae and Astatinae. Journal of The Entomological Resarch Society 7: 41-57.
Hensen, R. V., and P.D.J. van Ooijen, 1987. Notes on Turkish Tachysphex Kohl (Hymenoptera: Sphecidae). Entomol. Ber. 47, 12–16.
Landais, I., Chavıgny, P., Castagnone, C., Pızzol, J., Abad, P. ve Vanlerberghe-Masuttı, F. 2000. Characterization of a highly conserved satellite DNA from the parasitoid wasp Trichogramma brassicae. Gene 255: 65–73.
Landry, B.S., Dextraze, L., and G. Boivin 1993. Random ampli-fied polymorphic DNA markers for DNA fingerprinting and genetic variability assessment of minute parasitic wasp species (Hymenoptera: Mymaridae and Trichogrammati-dae) used in biological control programs of phytophagous insects. Genome. 36(3), 580-7.
LaSalle, J. & Gauld, I. D. 1993. Hymenoptera and Biodiversity. CAB International Wallingford, 368 pp.
Ljubomirov, T. ve Yıldırım, E., 2008. Annotated catalogue of the Ampulicidae, Sphecidae and Crabronidae (Insecta : Hymenoptera) of Turkey. Pensoft Publishers, 316 s, Sofya.
Lohrmann, V., Ohl, M., Bleidorn, C. ve Podsiadlowski, L. 2008. Phylogeny of the "Sphecidae" (Hymenoptera: Apoidea) based on molecular data. Mitt. Dtsch. Ges. Allg. Angew. Ent. 16.
Mardulyn, P., and Cameron, S.A. 1999. The major opsin in bees (Insecta:Hymenoptera): A promising nuclear gene for higher level phylogenetics. Molecular Phylogenetics and Evolution 12: 168-176.
21
Menke, A. S., and Pulawski, W. J. 2000. A Rewiev of the Sphex flavipennis Species Group (Hymenoptera: Apoidea: Sphecidae: Sphecini). J. Hym. Res. Vol. 9(2), pp. 324-346.
Pizzol, J., Khoualdia, O., Ferran, A., Chavigny, P., and Vanlerberghe-Masutti, F. 2005. A single molecular marker to distinguish between strains of Trichogramma cacoeciae. Biocontrol Sci. Tech. 15(5), 527-531.
Prinsloo G., Chen Y., Giles K.L. & GreenstoneM.H., 2002: Release and recovery in South Africa ofthe exotic aphid parasitoid Aphelinus hordeiverified by the polymerase chain reaction. BioControl 47: 127-136.
Pulawski, W.J., 2013. Catalog of Sphecidae sensulato, http://research.calacademy.org/ent/catalog_sphecidae (06.01.2013).
Rokas, A., Nylander, J. A. A., Ronquist, F., and Stone, G. N. 2002. A maximum likelihood analysis of eight phylogenetic markers in gallwasps (Hymenoptera: Cynipidae); implications for insect phylogenetic studies. Mol. Phylogenet. Evol. 22:206–219.
Quicke, D. L. J., Laurenne, N.M., Fitton, M. G., ve Broad, R. B. 2011. A thousand and one wasps: a 28S rDNA and morphological phylogeny of the Ichneumonidae (Insecta: Hymenoptera) with an investigation into alignment parameter space and elision. Journal of Natural History. 43:23-24, 1305-1421.
Sappal, N.P., Jeng, R.S., Hubbes, M., andF. Liu 1995. Restriction fragment length polymorphisms in polymerase chain reaction amplified ribosomal DNAs of three Trichogramma (Hymenoptera: Trichogrammatidae) species. Genome. 38(3),419-25.
Silva, I.M.M.S, Honda, J., van Kan, F., Hu, J., Neto, L., Pintureau, B., and Stouthamer, Richard., 1999. Molecular Differentation of Five Trichogramma Species Occuring in Portugal. Biological 16, 177-184.
Stouthamer, R., Hu, J., Van Kan, F.J.P.M., Platner, G.R., ve J.D. Pinto. 1999. The utility of internally transcribed spacer 2 DNA sequences of the nuclear ribosomal gene for distinguishing sibling species of Trichogramma. BioControl. 43, 421-440
Tüzün, A., Gülmez, Y., Bağrıaçık, N., 1999. Studies on Sphecidae of Aegean Region (Insecta: Hymenoptera). Entomofauna, 20(23), 381–388.
Vanlerberghe-Masutti, F(1994). Molecular identification and phylogeny of parasitic wasp species (Hymenoptera: Trichogrammatidae) by mitochondrial DNA RFLP and RAPD markers. Insect Mol. Biol. 3(4),229-37.
Wagener B., Löhr B., Reineke A. & ZebitzC.P.W., 2004a: Molecular identification of Diadegma species (Ichneumonidae) parasiting diamondback moth Plutella xylostella (Plutellidae)in eastern and southern Africa. In: Kirk A. & Bordat D., (eds.): Improving biocontrol of Plutella xylostella (L.). CIRAD. Montpellier, 252-256.
22
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Adı - Soyadı : İlyas CAN Doğum Tarihi ve Yeri : 16.06.1987
Medeni Hali : Evli
Yabancı Dili : İngilizce
Telefon : 0543 916 90 89
e-mail : ilyas.can@gop.edu.tr
Eğitim Durumu
Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi
Yüksek Lisans Gaziosmanpaşa Üniversitesi 2013 Lisans Ondokuz Mayıs Üniversitesi 2009 Lise Gölcük Barbaros Hayrettin Lisesi 2004
İş Deneyimi
Yıl Yer Görev
2010- Devam Ediyor
Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü
