Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4217

Tam metin

(1)台北醫學大學臨床醫學研究所碩士論文 Taipei Medical University Graduate Institute of Clinical Medicine Master of Medical Science Thesis All trans-RETINOIC ACID 對於鼻咽癌細胞株之生長控制影響以及合併化療藥物治療之效用 Effect of All trans-RETINOIC ACID on the growth of nasopharyngeal cancer cell lines and treatment potential in combined use with cisplatin. 指導教授: 李飛鵬共同指導教授: 吳瑞裕研究生: 洪士涵學號：M102094033. 中華民國九十八年一月 January, 2009 1.

(2) 致. 謝. 感謝台灣大學病理學科林欽塘教授出借兩株由林教授實驗室培養出的本土鼻咽癌細胞株 NPC-TW01 以及 NPC-TW04。感謝國泰臨床醫學研究中心黃幸宜博士以及研究助理黃清閔的協助。. 2.

(3) 縮寫表(Abbreviations) 縮. 寫. 全. 文. NPC. Nasopharyngeal carcinoma. ATRA. All trans retinoic acid. 4-HPR. Fenretinide. EBV. Ebstein-Barr Virus. HLA. Human leukocyte antigen. 5FU. 5-Fluorouracil. RBP. Retinol-binding protein. RARs. Retinoic acid receptors. RXRs. Retinoic X receptors. DNA. Deoxyribonucleic acid. RNA. Ribonucleic acid. MTX. Methotrexate. DMEM. Dulbecco’s modified essential medium. DMSO. Dimethyl sulfoxide 3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium. MTT. bromide OD. Optic density. CDKs. Cyclin dependent kinase. pRb. Retinoblastoma protein. CKIs. Cyclin dependent kinase inhibitors. HMG protein. High Mobility Group protein. AP-1. Activator protein 1. JNK. c-Jun N-terminal kinases. 3.

(4) 章節目錄. All transtrans-RETINOIC ACID 對於鼻咽癌細胞株之生長控制影響以及合併化療藥物治療之效用. 中文摘要中文摘要 ………………………………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………………………… 1 英文摘要英文摘要 ………………………………………………………………………………………………………………………………… 4 第壹章：第壹章：緒論壹、頭頸癌簡介. ………………………………………………………………………………………………………… 8. 貳、鼻咽癌簡介. ………………………………………………………………………………………………………… 9. 參、All trans-retinoic acid (ATRA) 與 Cisplatin 肆、實驗計劃目的. …………………………………… 11. ……………………………………………………………………………………………………15. 第貳章：第貳章：實驗材料及方法實驗材料及方法壹、實驗材料. ……………………………………………………………………………………………………………18. 貳、實驗方法. ……………………………………………………………………………………………………………19. 第參章：第參章：實驗結果. 壹、細胞生長曲線測定. ………………………………………………………………………………………24. 貳、顯微鏡下觀察細胞加入 ATRA 之形態學變化. 4. …………………………………24.

(5) 參、測量加入不同濃度之 ATRA 以及 Cisplatin 對細胞生長抑制的效果. ……………………………………………………………………………………………………………………………………………24. 第肆章：第肆章：實驗討論……………………………………………………………………………………………………………… 實驗討論………………………………………………………………………………………………………………3 ………………………………………………………………………………………………………………30 參考文獻………………………………………………………………………………………………………………………………… 參考文獻…………………………………………………………………………………………………………………………………36 …………………………………………………………………………………………………………………………………36 圖表……………………………………………………………………………………………………………………… 圖表…………………………………………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………………………………………4 ……………………41. 5.

(6) 中文摘要. . 目的: Retinoids 是一群存在於自然界或是人工合成的維生素 A 的類似物，其中包. 括了 retinol、 isotretinoin、 tretinoin(ATRA)、 retinylpalmitate、 Fenretinide(4-HPR)、 etretinate， arotinoids 等等。此類化合物在許多的動物實驗上，對於許多上皮組織 (包括口腔，皮膚，膀胱，攝護腺和乳腺) 表現出明顯抑制癌化的效果。近年來各種維他命 A 的代謝衍生物更被運用到其他類型的癌症上試圖提供更好的腫瘤治療效果。將 ATRA 運用在頭頸部鱗狀細胞癌不論是在細胞株的試驗或是動物實驗上已經得到具體的成果，進一步的人體試驗同時也在不同的國家進行當中。甚至於在一些國家，對於頭頸部鱗狀細胞癌症的治療已經將 ATRA 納入了原本的化療配方組合之中。然而，同屬於源自上皮細胞組織的鼻咽癌，卻仍然缺少對於這類促細胞分化藥物的反應研究。本實驗計畫希望透過 ATRA 合併使用現有治療鼻咽癌化療藥物 Cisplatin，以鼻咽癌細胞株作為實驗材料，試圖找出 ATRA 對於鼻咽癌細胞的影響，以及合併使用 Cisplatin 是否具有加成的治療效果。. 1.

(7) . 方法: 實驗材料為兩株本土鼻咽癌細胞株 NPC-TW01 以及 NPC-TW04。各別於. 不同濃度之 ATRA 培養下，在光學顯微鏡下觀察細胞型態學的變化，並測量個別之生長曲線。最後將細胞株分別培養於混有不同濃度的 cisplatin、ATRA、以及兩者藥物合併的培養液中，選定 6 天之生長期，以 MTT assay 光學方法測光密度 OD 值來估算細胞的數目。. . 結果: NPC-TW01 細胞株在單獨使用 Cisplatin 0.5μmol/L 開始產生細胞生長抑. 制，並且隨著加入藥物的濃度增加而有加強。單獨使用 ATRA 1μmol/L 生長開始產生抑制，然而對於細胞生長的抑制作用並未能隨著 ATRA 濃度的增加而加強。而 NPC-TW04 細胞株則對個別使用 Cisplatin 以及 ATRA 的反應相較之下明顯變差。在合併使用的效用上，兩者皆有著顯著的加成效果。 NPC-TW01 在 ATRA 在合併較低濃度的 cisplatin 之下，對細胞生長抑制的作用與單獨使用 ATRA 並沒有差異。然而當 cisplatin 的濃度達到 5µM 的時候，合併 ATRA 1µM 比起對照組可以造成吸光值平均下降至 23.7%。比起單獨使用 cisplatin 5µM 以及單獨使用 ATRA 1µM，細胞抑制的差異皆可達到統計上的意義。 NPCTW04 的反應也有類似的結果，當 cisplatin 的濃度提升到 1 µM 以上的時候，加入原本合併 2.

(8) 使用時反應不甚明顯的最低濃度的 ATRA 1µM，就可以達到大幅下降吸光值的效果。. . 結論: ATRA 對於本實驗中的兩株鼻咽癌細胞株皆有抑制生長的作用，此外當合併. 使用 cisplatin 時可以於低濃度就達到良好的加成效果，顯示出 ATRA 作為鼻咽癌合併治療藥物的潛力。但是由於在合併 cisplatin 以及 ATRA 治療下，腫瘤的抑制加成效果須依賴一定的 cisplaitn 濃度，而且並未能隨同 ATRA 的濃度增加而更加明顯。因此除了同時使用 cisplain 與 ATRA 預期可以達到相當好的鼻咽癌合併治療效果之外，若能加入經由不同機轉作用的抗癌藥物，應能進一步再提高療效。. 3.

(9) Abstract . Objectives: Retinoids are a group of naturally existing or synthetic vitamin A. derivatives including retinal, isotretinoin, tretinoin(ATRA), retinylpalmitate, Fenretinide (4-HPR), etretinate, arotinoids. In many animal models, these compounds have shown significant anti-neoplastic effect on many epithelial tissues, and more recently they have been applied to other types of cancer in order to obtain better therapeutic effects. Previous research have already achieve remarkable results in the application of ATRA on human head and neck squamous cell carcinoma using cell line and animal models. In some countries, ATRA was included as a combined chemotherapy regimen. However, related researches about the nasopharyngeal cancer, which are also originated from the epithelial tissue, were still unclear. The purpose of this study is to understand the effect of ATRA on the nasopharyngeal cancer cell line and evaluate the additional effect when used together with Cisplatin which is currently a standard chemotherapeutic agent for nasopharyngeal carcinoma.. 4.

(10) . Materials and Methods: Two NPC cell lines NPC-TW01 and NPC-TW04 were used and observed. under optical microscope for morphological changes after treating with different concentrations of ATRA. Growth curves were also determined individually. Finally after six days culturing with various concentration of ATRA alone, cisplatin alone, and combination of both, viable cell numbers were estimated by OD value using MTT assay.. . Results: Cell growth inhibition can be observed on NPC-TW01 starting with. Cisplatin 0.5μmol/L, and this effect was further enhanced by increased cisplatin concentration. Growth inhibition also started with ATRA 1μmol/L treated alone, but unlike cisplain, was not enhanced by increased ATRA concentration. Both cisplatin and ATRA showed decreased inhibitory effect on NPC-TW04. Both cell lines showed remarkable growth inhibition under combined used of cisplatin and ATRA. Under low concentrations of cisplatin, NPC-TW01 cell growth showed no differences between combined use and using ATRA alone. However, when the concentration of cisplatin increased to 5µM, combined use 5.

(11) with ATRA 1µM results in decrease in OD value to 23.7% of control group, which is statistically significant comparing to treating with cisplatin and ATRA alone. Similar result was also found on NPC-TW04. When cisplatin level was raised above 1 µM, combined use with low concentration of ATRA showed remarkable decrease in measured OD value.. . Conclusion: Both cell lines used in this study respond to ATRA and results in cell. growth inhibition. Low concentration of ATRA is required for synergy effect while combining with cisplatin, implying the potential use for combination therapy regimen. However, the increased cytotoxicity is cisplatin concentration dependent, and also, not enhanced by further increase of ATRA concentration. Therefore, we expect quite effective nasopharyngeal cancer cell control using ATRA and cisplatin together, and possibly even better control effect if other anti-cancer agents using different mechanisms were added together.. 6.

(12) 第壹章緒論. 7.

(13) 壹、. 頭頸癌簡介. 一般而言頭頸部的區域涵蓋了鎖骨以上不含腦、脊椎以及眼睛之外的結構。而其中較受到重視的區域包含了泛稱的上呼吸消化道 (upper aerodigestive tract)。各細分為鼻腔、鼻咽、口腔、口咽、下咽、以及喉部。因胚胎發育的影響，鋪陳在上列區域的黏膜大多是源自上胚層組織。也因此在此區域發生的癌症也都多源自於上皮細胞。其中又以鱗狀細胞癌 (squamous cell carcinoma) 為最多，約佔全部口腔癌的九成。其他可能發生的癌症還包括了疣狀癌，唾液腺癌，淋巴癌，甲狀腺癌，惡性肉瘤，以及轉移癌等等。在台灣地區由於嚼食檳榔的人口逐漸增加，比例上口腔癌的發生率已超越鼻咽癌，目前更已達到國內十大癌症之前五位，在男性之中更已佔據第四高的比率。頭頸部鱗狀細胞癌的好發因素多為抽菸、喝酒、以及吃檳榔。這些致癌物在接觸的時候會直接對上呼吸消化道的黏膜作用。而在鼻咽癌則有所不同的是，危險因素包括了遺傳、環境因素、以及 EB 病毒感染。頭頸部癌症一旦發生，在臨床上的特性會表現出較多的局部破壞，而在腫瘤的轉移上，則表現出較多的局部頸淋巴轉移，以及較低比例的遠處轉移 (僅約 10~20%)。基本上的治療包括了手術切除，以及後續的放射治療或是放射治療合併化學治療。雖然在手術以及放射治療方面的技術日新月異，但是病患的五年存活率近二三十年來並未有顯著的提升。因此許多研究希望在化學治療的藥物上可以得到突破。 8.

(14) 貳、. 鼻咽癌的簡介. 鼻咽癌是華人特有之癌症，男女之比率約為 2~3:1。根據之前的統計，男性每十萬人每年罹患鼻咽癌的人數在台灣是 7.7 人，美國 0.63 人，日本 0.27 人。即使移居美國的第二代中國人也比當地白人罹患率多 7 倍。雖然鼻咽癌在台灣的發生率已掉出十大癌症排名之外，但是臨床上仍然佔有重要的位置。鼻咽癌發生之原因乃多重因素所構成，經研究結果約有三項，即遺傳因素， EB 病毒感染，環境因素。 . 遺傳因素：鼻咽癌病患的一等親罹患鼻咽癌的機率為一般的 19.2 倍。此外鼻咽癌被認為和一些特定的 HLA 特徵有關。. . EB 病毒感染：在鼻咽癌的細胞中大多都可以找到 EB 病毒之痕跡。. . 環境因素：之前的研究顯示鼻咽癌的發生與食用鹹魚，空氣中化學物質暴露，以及吸菸有關。. 鼻咽癌的初期症狀並不明顯，隨著腫瘤的增大，可能會逐漸的出現鼻塞，鼻涕帶血絲，耳脹或壓力不平衡感。若產生頸部淋巴的轉移則會在頸部產生無痛之腫塊。隨著原發鼻咽腫瘤的侵犯，後期會產生腦神經麻痺的症狀，尤其是容易侵犯第 4，5，6 對腦神經。根據 1997 年美國癌症聯合委員會(AJCC)的分類，如果腫瘤只局限在鼻咽腔，便是第一期。如果侵犯到鼻腔或口咽，或一邊頸部已有小於 6 公分長徑的轉移性淋巴結，便屬第二期。如果腫瘤侵犯顱底骨頭或鼻竇，或兩側頸部都有小於 9.

(15) 6 公分長徑的轉移性淋巴結，便是第三期。如果腫瘤侵入腦內或侵犯腦神經，下咽或眼窩或頸部有大於 6 公分的淋巴結，便是第四期。鼻咽癌之治療主賴放射治療，早期(第一、二期)單用放射治療之結果就很好，但晚期(第三、四期)或復發之病人可能需要併用化學及手術治療，經正規治療之結果，全部病人五年之存活率約有 60%，早期病人可高達 80%以上，而晚期病人也有 30%以上。由於鼻咽癌極易發生淋巴轉移和遠隔轉移，而鼻咽癌細胞對放射線治療和化學治療都非常敏感，所以鼻咽癌的治療以放射線治療為主，化學治療為輔。對早期的鼻咽癌，放射性治療即可得到相當不錯的治療成績，但對晚期鼻咽癌而言，常需合併化學治療，併行性化學放射治療法是常被採用的治療模式。. 遠端轉移好發的位置包括骨骼、肺臟及肝臟。骨骼轉移可能無症狀或是有疼痛的症狀，而治療方法包括放射治療，化學治療等等。若有骨折或導致脊髓壓迫的危險時，則可能需要加做手術治療。肺臟，肝臟轉移可能單一或是多發。肺臟轉移初期無症狀，嚴重時會咳嗽，咳血呼吸困難。肝臟轉移嚴重時甚至可能導致肝機能衰竭。. 通常發生內臟轉移時，一般以化學治療為主，部分的病人於化學治療後可有長期緩解之機會。較常使用藥物有 5FU、cisplatin、anthracyclines、mitomycin C 等。依臨床狀況及權衡其副作用，如血球降低，粘膜發炎，聽力或腎臟功能的. 10.

(16) 影響等，可給予單獨或合併化學治療，合併化學治療之緩解率約為 50%。新的藥物如 gemcitabine、paclitaxel，目前仍在臨床試驗中。(國家衛生研究院，鼻咽癌之診斷與治療共識). 參、 . All transtrans-retinoic acid (ATRA) 與 Cisplatin ATRA 概述. All trans-retinoic acid (ATRA)是維他命A的代謝物。可由自身製造或是合成. 在血漿中ATRA會與 retinol-binding protein (RBP) 以及白蛋白 Albumin 緊密的結合 (Blomhoff et al. 1990)。正常情況下血漿中的ATRA濃度大約是4-14 nmol/L (Blaner & Olson et al. 1994)。ATRA 以簡單滲透的方式進入細胞內，並於核内的受器結合並產生作用。核內的受器主要分為 retinoic acid receptors (RARs)(α，β，γ) 以及 retinoic X receptors (RXRs) (α，β，γ)，而其中 ATRA主要是和 RARs 結合 (Miller et al. 1998)。經由RAR-RXR形成的異雙單元體 (heterodimers) 作用在 RAR 或 RXR specific regulatory elements (RAREs & RXREs) 進而引發後續的轉譯事件。後續引發的基因功能包含了細胞生長以及分化的控制，以及細胞凋亡 (apoptosis) 的控制 (Sporn et al. 1994)。. 11.

(17) . ATRA 作用於血癌細胞株. 西元 1980 年 Breitman et al. 發現 ATRA 作用在血癌細胞株上可以促使癌細胞分化成熟。將 1μM 的 ATRA 加入到 leukemic cell line HL-60 可造成 95%的細胞進行分化並失去分裂的能力。ATRA 之後經由臨床試驗被大量的應用在 acute promyelocytic leukemia (APL) 的治療上並有著顯著的成績。在控制細胞週期中最重要的元素就是所謂的 cyclin-dependent kinases (CDKs)，並藉此控制 retinoblastoma protein (pRb) family members 以及 E2F 的基因表現。而它的活性與 cyclins 以及所造成之磷酸化與否有關。另外它的活性也會受到 CDK inhibitors (CKIs)所抑制。因此要造成細胞的生長抑制與分化，可以藉由包含 cyclins 的 down-regulation 或是 CKIs 的 up-regulation 來達成。 ATRA 作用在血癌細胞株上，被發現可以造成 cyclin A，B，D3，以及 E3 的下降。除此之外也會造成 CKIs p21 的上升。而控制 cyclin E 的表現以及抑制 p27 與 cyclin E-CDK2 結合的 c-Myc 也可以觀察到下降的現象。這些因素促使了細胞產生 G0/G1 arrest，進一步促使細胞產生不可逆的分化現象。(Dimberg et al. 2002) . ATRA 作用於頭頸部鱗狀細胞癌細胞株與鼻咽癌細胞株. ATRA 作用在頭頸部鱗狀細胞癌細胞株上，同樣可以觀察到 G0/G1 arrest 的現象。Cyclin D1 亦可以發現有大量下降的情形，部分表現出 p27 的增加，以及 pRB 以磷酸化形式存在比例的下降。作用的機制與血癌細胞株類似。藉由 ATRA 的 12.

(18) 作用腫瘤細胞也會提高 JNK1 的表現與活化，可促使細胞走向凋亡 apoptosis。有研究顯示，ATRA 合併使用 cisplatin，5-FU，paclitaxel，以及放射治療等，會有加成的效用可能是因為上述的治療也會同時提高 JNK1 的表現。(Masuda 2002) 相對之下，ATRA 作用在鼻咽癌細胞上的研究較少。與頭頸部鱗狀細胞癌同樣源自於上呼吸消化道的鼻咽癌細胞，在組織的來源上都是來自上胚層的黏膜細胞，在特性上應有著類似的表現。由 Jiang et al 的實驗中發現鼻咽癌細胞株投予 retinoic acid 會有抑制生長的現象，並可以發現 c-myc 的基因表現亦受到抑制。因此推測鼻咽癌細胞株對於 ATRA 應會得到類似的反應。. . Cisplatin 1965 年，Rosenberg 發現大腸桿菌(E. coli)的複製可被通過鉑電極間的電子. 流所抑制，這抑制是由鉑複合物的釋放所造成，目前已知鉑複合物可以廣泛地抑制動物和人類的腫瘤。其中最重要的成員就是 cis-diaminedichloroplatinum(II) (cisplatin)。 Cisplatin 是一個無機複合物，由鉑原子(II)被氯原子和氨原子所包圍，以水平面的順式(cis-)位置存在。鉑複合物需要電荷和順式位置的平衡才能表現其抗腫瘤效果。在血漿中是高氯環境，鉑複合物穩定而非離子化，可允許藥物進入細胞內。而在細胞內氯的濃度低，鉑複合物的氯被水分子取代，形成帶正電荷的高 13.

(19) 反應性複合物 (Trzaska 2005)。此複合物抑制 DNA 的合成遠甚於 RNA 或蛋白質的合成。Cisplatin 與 DNA 結合的主要形式是股內交叉鏈結 (intrastrand cross-linking)，但是其他形式的結合，如 interstrand cross-linking，DNA-protein cross-links，與 messenger RNA 的結合也會發生。而這些與 DNA 的結合是為了抑制 DNA 當做細胞複製的模板，以達到抑制細胞分裂的目的。此外 Cisplatin 也會與 DNA 形成附加物 (non-functional adducts)，這樣的 adduct 會進一步的促使 DNA 與 HMG 蛋白的結合，使得 DNA 無法被修復進而造成細胞死亡。 Cisplatin 的抗藥性機轉雖然也見於其他烷化劑 (alkylating agents)和放射線療法，但 Cisplatin 一般不與其他烷化劑產生交互抗性(cross-resistance)，反而常和各種抗代謝藥物如 5-FU 和 MTX 有交互抗性 (Stordal et al. 2007)。 Cisplatin 運用在頭頸部腫瘤的治療已經有數十年的歷史，目前利用在對鼻咽癌的治療上面，可以分為 1. 做為放射治療之敏感劑 (radiosensitizer)，鼻咽癌原發部位以及頸部以放射治療做為主軸時可以加強局部控制率。2. 作為引導性化療 (induction chemotherapy) 在已有嚴重頸部轉移的患者身上，於放射治療前給予，試圖消去可能的微小轉移.。3. 作為癌症已經轉移之後的全身性化學治療。 Cisplatin 的治療與 DNA 修復的機轉息息相關，目前對於 cisplatin 的抗性可能與下列基因的引發有關：DNA polymerase beta，ERCC1，Proliferating Cell. Nuclear Antigen (PCNA)，C-fos & C-myc，p53。 14.

(20) . Cisplatin 合併 ATRA 已有許多將 Cisplatin 合併使用 ATRA 對細胞生長的抑制的實驗被完成，. 其中在人類卵巢癌細胞株，人類頭頸部鱗狀細胞癌細胞株，人類子宮頸癌細胞株，以及人類皮膚鱗狀細胞癌細胞株上，已被證實具有加成抑制細胞生長的效果，再較嚴重的皮膚鱗狀細胞癌方面已有 retinoic acid 合併 cisplatin 治療的 phase II 研究。顯示出此類合併治療再許多癌症上具有相當的潛力。. 肆、. 實驗計劃目的. ATRA 此類的化合物因為可使細胞走向分化的作用，在腫瘤的控制上也因此而受到重視。新類型的腫瘤控制藥物除了傳統試圖殺死癌細胞的機制以外，有更多的方向是針對細胞生長的控制。希望藉由影響細胞生長的行為，來使得所謂癌細胞這種不受到調控的細胞生長可以拉回到正常的型態，即重新取得對癌細胞生長的控制。同樣屬於源自上皮細胞的鼻咽癌，是在華南沿海地區所特有的惡性腫瘤。因為對於放射治療以及化學治療屬於高度敏感性，因此目前的主流以放射治療合併化學治療為首要。因此選擇有效的化療藥物將影響病患的治療效果。 2000 年由 Jiang et al 的實驗，證實了鼻咽癌細胞株投予 retinoic acid 會有抑制生長的現象，並可以發現 c-myc 的基因表現亦受到抑制。由於 ATRA 對於細胞產生的生長抑制，與 cisplatin 一樣是屬於與細胞週期 (cell cycle) 相關的藥 15.

(21) 物。此外 c-myc 的表現強度對於 cisplatin 藥物抗性具有相關性。因此合併使用 ATRA 以及 cisplatin 可能可以得到相當的加成作用。在本研究中將以之前所得知結果，針對鼻咽癌細胞株分別或是合併投予不同濃度的 ATRA 以及 cisplatin，並觀察細胞株生長的情形是否受到抑制，並且評估 ATRA 合併 cisplain 是否有加成的療效。. 16.

(22) 第貳章. 實驗材料及方法. 17.

(23) 壹、. 1.. 實驗材料. 實驗所需鼻咽癌細胞株感謝台灣大學病理學科林欽塘教授出借兩株由林教授實驗室培養出的本土. 鼻咽癌細胞株 NPC-TW01 以及 NPC-TW04。本實驗將以此為實驗之細胞。培養條件為 37 ﾟ C，5% 濃度之二氧化碳 (CO2)。培養基值 (culture medium)為 DMEM 混入 10%之馬血清 (horse serum) 加上 penicillin 與 streptomycin (1%)。. 2. i.. 實驗藥品 ATRA (購自 Sigma) 以 DMSO 製成 0.5 mol/L 的 stock solution，並儲存於 -20℃。. ii.. Cisplatin (0.5 mg/ml) (購自 ABIC 93.148.590-B). iii.. DMSO (購自 Sigma). iv.. 0.4% trypan blue solution (購自 Sigma T8154). v.. PSB solution (Dulbecco‘s phosphate buffered saline) (購自 GIBCO 21600-051). vi.. MTT (購自 Sigma M5655). vii.. HCl (10N) (購自 Riedel-deHaen 30721) 18.

(24) viii.. 3.. Isopropanol (購自 Fluka 59300). 實驗儀器. i.. Laminar flow / 無菌操作台. ii.. 離心機. iii.. CO2 incubator / 二氧化碳細胞培養箱. iv.. 細胞計數盤 Haemocytometer/coverslip. v.. 顯微鏡 Olympus BX40. vi.. Elisa reader for MTT assay: Anthos 2001. 貳、. I. i.. 實驗方法實驗方法. 細胞生長曲線測定 Growth Curve Determination 細胞計數以 heamocytometer 測量，將培養的細胞離心取下後，以 culture medium. 均勻打散至 200 µl 之容積。X 組取 10 µl 以 pipetman 慢慢滲入 coverslip，Y 組取 10 µl 加上 10 µl (0.4%) trypan blue solution 混和後同樣取 10 µl 以 pipetman 慢慢滲入 coverslip。以 Heamocytometer 在光學顯微鏡下觀察做細胞計數。加總九大格之細胞總數計為 x 以及 y。估算之細胞濃度為 (x/2 + y) / 9 x 103 19.

(25) cell/ml。將此濃度乘上 200 µl 之容積可以得到此 well 內的細胞總數。. ii.. 細胞生長曲線測定以上述測定方法，於時間起始點投入 10000 顆細胞於 96 well 中培養，容積. 為 200 µl。並於第 2 天，第 4 天，第 6 天，第 8 天，第 10 天，以及第 12 天，測量 well 中細胞之總數，以此得到細胞生長曲線。. II.. 顯微鏡下觀察細胞加入 allall-trans retinoic acid 之形態學變化將分盤兩天之後的細胞株分別投與 ATRA. 10-3 ，10-4 ，以及 10-5 mol/L，. 作用 48 小時後加以拍照記錄，並比與對照組的差異。. III. 測量加入不同濃度之 ATRA 以及 Cisplatin 對細胞生長抑制的效果以 96 well 孔盤做為培養盤。初始投入之細胞數量為 10000 顆/100µl/well，並使其穩定培養附著 24 小時之後，加入所要測試的藥品，並以加入藥品的時刻定為實驗起始時間點，並在第六天進行 MTT assay 之測定。加入的測試藥品濃度分別為 100µl 之 Cisplatin 與原 well 中之細胞混和後達到最終濃度為 0.5，1，2.5，以及 5µM。 ATRA 也是以相同方法加入使其最終濃度為 1，5，以及 10µM。另有兩種藥物合併使用最終濃度分別為 Cisplatin 0.5µM 加上 ATRA 1，5，10µM，Cisplatin 1µM 加上 ATRA 1，5，10µM，Cisplatin 20.

(26) 2.5µM 加上 ATRA 1，5，10µM，以及 Cisplatin 5µM 加上 ATRA 1，5，10µM。於第六天開始進行 MTT assay 以測量細胞存活率。首先先將 MTT 粉末以 PBS 為溶劑製成 5mg/ml 的溶液，並加以無菌過濾. HCL 以 isopropanol 稀釋成 0.04N 的濃度。將每一個 well 加入 MTT/PBS 溶液 20µl 並在 37℃，5% CO2 之環境下培養 4 小時。之後將懸浮之培養液完全吸除，並加入 100µl 之 HCL 溶液，並在室溫下混合數分鐘。 Well 中產生的紫色結晶則以 Elisa reader 測量在 570nm 的吸光值。. IV. MTT 測量法介紹 MTT assay 是一種生物學上常用以測定細胞存活率或增殖作用的方法。MTT 全稱為 3-(4，5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3，5-di-phenytetrazoliumromide，是一種黃顏色的染料。其主要依賴活細胞內粒線體中的琥珀酸去氫脢之作用將 MTT 之 tetrazolium 轉為藍色（或藍紫色）不溶於水的產物 MTT formazan，堆積於細胞中，加入 DMSO 將其溶解。Formazan 的多少可以用儀器在 570nm 處進行測定。在通常情況下，Formazan 生成量與活細胞數成正比，因此可根據光密度 OD 值推測出活細胞的數目。由於死細胞中不含琥珀酸脫氫，因此加入 MTT 不會有反應。故 MTT assay 可用作細胞存活率的指標。MTT assay 因為擁有快速、經濟和無放射性元素污染之問題，常被使用為細胞存活率及巨噬細胞吞噬能力之測定。 21.

(27) V.. 統計方法. 各組數據以 student`s t-test (雙尾) 做檢定，p<0.05 代表有意義的統計學差異。. 22.

(28) 第叁章. 實驗結果實驗結果. 23.

(29) 壹、. 細胞生長曲線測定細胞生長曲線測定 Growth Curve Determination 以細胞數 10000 做為起始點，隔兩日測量估計細胞總數。可以發. 現不論是 NPC TW01 或是 NPC TW04，都是在起始日到第四天呈現較緩慢的生長。第四天起細胞的數量開始快速增加，並持續到第十天. 第十天之後細胞的數量呈現大幅下降，顯示出細胞培養的環境已經產生大幅劣化。由此生長曲線之特性，我們選定第六天做為收集細胞的時間點。在這個時間點裡，細胞呈現快速的增加且尚未表現出生長劣化的現象。(圖一和圖二). 貳、. 顯微鏡下觀察細胞加入 allall-trans retinoic retinoic acid 之形態學變化. 分盤兩天之後的細胞株分別投與 ATRA. 10-3 ， 10-4 以及 10-5 mol/L，. 作用 48 小時後，在顯微鏡下觀察可以發現隨著 ATRA 濃度的增加，貼附於培養皿的細胞數量有明顯的減少。此外貼附的細胞會因為 ATRA 的加入，產生細胞扁平化，並產生更多向外延伸的突起。(圖三和圖四). 參、. 測量加入不同濃度之 ATRA 以及 Cisplatin 對細胞生長抑制的效. 果 . NPC TW01 以 MTT 法測量得到的吸光值比較，在三個時間點分別進行了三組數據的實 24.

(30) 驗。 A.. 單獨使用 cisplatin 單獨加入 cisplatin 的組別裡，分別加入 cisplatin 0.5，1，2.5，以及 5µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 77%，67.7%，67.2%，以及 50.7% (p 值皆小於 0.05，達到統計意義)。而比較加入 cisplatin 0.5 以及 5µM 的兩組數據差異達到統計意義，表示 cisplatin 對於細胞生長抑制的作用隨著加入藥物的濃度增加而有加強。(圖五). B.. 單獨使用 ATRA 單獨加入 ATRA 的組別裡，分別加入 ATRA 1 ， 5，10µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 51.3%，41.8%，以及 47.3% (p 值皆小於 0.05，達到統計意義)。而在三種不同 ATRA 濃度的組別裡，組間的吸光值並沒有統計上的差異，顯示單獨加入 ATRA 對於細胞生長的抑制作用並未能隨著 ATRA 濃度的增加而加強。(圖六). C.. 合併使用 ATRA 與 cisplatin 在合併加入 ATRA 以及 cisplatin 的組別裡，在 0.5，1，以及 2.5 µM 濃度的 cisplatin 之下，加入最低濃度的 ATRA 1µM，以及更高的濃度，皆可以達到大幅下降吸光值的效果。但是這些抑制細胞生長的效果，比 25.

(31) 較起單獨加入相同濃度的 ATRA 所造成的抑制，並無法達到統計上的意義。( cisplatin 0.5µM + ATRA 1µM 比 ATRA 1µM p=0.389，cisplatin 1µM + ATRA 1µM 比 ATRA 1µM p=0.881，cisplatin 2.5µM + ATRA 1µM 比 ATRA 1µM p=0.35 )，表示 ATRA 在合併較低濃度的 cisplatin 之下，對細胞生長抑制的作用與單獨使用 ATRA 並沒有差異。因此在較低的 cisplatin 濃度之下，額外加入 ATRA 並無法得到額外的加成效果。而當 cisplatin 的濃度達到 5µM 的時候，合併 ATRA 1µM 比起對照組可以造成吸光值平均下降至 23.7% (p<0.05)。而經由合併藥物使用所達到的抑制效果比起單獨使用 cisplatin 5µM (下降至 50.7%) 以及單獨使用 ATRA 1µM (下降至 51.3%)，細胞抑制的差異皆可達到統計上的意義。然而此種加成的效應並未能隨著 ATRA 濃度的增加而有更好的效果。Cisplatin 5µM 合併 ATRA 1，5，10µM 所測得知吸光值彼此之間並無統計上之差異 (p=0.94， 0.29)。(圖七). . NPC TW04. 以 MTT 法測量得到的吸光值比較，目前完成了一個時間點分別進行了三組數據 26.

(32) 的實驗。 A.. 單獨使用 cisplatin 單獨加入 cisplatin 的組別裡，分別加入 cisplatin 0.5，1，2.5，以及 5µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 102.5%，94.7%， 90.6%，以及 78.5%，而其中只有加入 2.5µM 與 5µM 此兩組達到統計意義 (p 值分別為 0.023 與 0.005)。顯示 cisplatin 對於 NPC TW04 細胞生長抑制的作用需在較高的濃度下始有表現。(圖八). B.. 單獨使用 ATRA 單獨加入 ATRA 的組別裡，分別加入 ATRA 1，5，10µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 92.2%，77.6%，以及 73% (p 值各為 0.04，0.12，以及 0.02，僅部分達到統計意義)。顯示單獨加入 ATRA 對於 NPC TW04 細胞生長的抑制作用雖然似乎可以隨著 ATRA 濃度的增加而加強，唯 p 值數值仍偏大 (p=0.028)，對藥物的反應不如 NPC TW01 來的明顯。(圖九). C.. 合併使用 ATRA 與 cisplatin 在合併加入 ATRA 以及 cisplatin 的組別裡，與 NPC TW01 的反應 27.

(33) 有著相當程度的不同。在低濃度 cisplatin 0.5µM 之下，加入最低濃度的 ATRA 1µM 時所產生的吸光值下降比起個別加入時並不明顯，需將 ATRA 的濃度提高到 5 µM 時，整體吸光值下降為 66.9%，比起單獨使用 cisplatin 的 102%以及單獨使用 ATRA 的 77.6% 皆達到統計上的差異 (p 值各為 0.005 與 0.024)。而當 cisplatin 的濃度提升到 1 µM 以上的時候，產生了明顯不同的效果。此時加入原本合併使用時反應不甚明顯的最低濃度的 ATRA 1µM，就可以達到大幅下降吸光值的效果。這時同時合併 cisplatin 與 ATRA 所造成的吸光值下降皆與單獨使用 cisplatin 有著顯著統計上之差異 (cisplatin 1，2.5，5 µM + ATRA 1µM 比較 cisplatin 1，2.5，5µM， p 值皆小於 0.05)。與 NPCTW01 不同的是這些抑制細胞生長的效果，比較起單獨加入相同濃度的 ATRA 所造成的抑制，足以達到統計上的意義 ( cisplatin 1µM + ATRA 1µM 比 ATRA 1µM p<0.05，cisplatin 2.5µM + ATRA 1µM 比 ATRA 1µM p<0.05)，表示原本對 ATRA 反應不強烈的 NPC TW04 在合併一定濃度的 cisplatin 之下，開始產生明顯的對細胞生長抑制的作用。然而如同 NPC TW01 的結果一般，此加成的效果無法隨著合併加入 ATRA 濃度的提高而有進一步的加強。(圖十). 28.

(34) 第肆章實驗討論. 29.

(35) 壹、細胞生長曲線測定 Growth Curve Determination 細胞生長曲線的測定，在兩株細胞上測得的生長峰值差異頗大。 NPC TW01 呈現較旺盛的生長，於第 10 天超過總細胞數 7 萬。而 NPC TW04 則同樣在第十天達到峰值，然而總細胞數在三萬以下。雖然兩只細胞株表現出不一樣的生長狀況，但是在生長的趨勢上卻是雷同的。一樣在第 0 到第 4 天呈現較緩慢的生長，而在第 4 天起直到第 10 天呈現快速狀況良好的生長達到峰值，而在第十天之後因為生長過度以及環境劣化，細胞數目在第 12 天產生大幅下降。因此兩株細胞的後續實驗都取第 6 天做為實驗點，以生長狀況最佳的時間點求取最佳的生長差異值。. 貳、顯微鏡下觀察細胞加入 allall-trans retinoic acid 之形態學變化本次實驗的細胞株與之前由 Jiang et al (2000) 的實驗所得到的結果類似。細胞在投予 ATRA 後，明顯的細胞黏附與生長的情形受到了抑制，並且產生了許多懸浮的死亡細胞。進一步觀察細胞的形態，在顯微鏡下細胞產生扁平化的現象，並由細胞表面向外產生許多突起。這樣的現象推論可能是由於 ATRA 會引起細胞的分化，屬於上皮組織來源的鼻咽癌細胞株分化後可能會表現出類似表皮細胞扁平化的特色。然而，此種形態上的變化也有可能是因為 30.

(36) 細胞的生長數量減少，使得附著在培養皿表面的細胞呈現較鬆散分布而造成的現象。. 參、測量加入不同濃度之 ATRA 以及 Cisplatin 對細胞生長抑制的效果單獨投予 cisplatin 在兩株鼻咽癌細胞株上，細胞生長抑制的表現是如同預期般的，隨著 cisplatin 濃度的增加而呈現正比的關係。而在生長表現較旺盛的 NPC TW01 上，也表現出較佳的效果，顯示 cisplatin 這種屬於 cell cycle dependent 類的化療藥物作用的特性。較令人意外的是在單獨投予 ATRA 的組別裡，NPC TW01 表現出對於 ATRA 極佳的敏感性。對照 Jiang et al (2000) 的實驗裡，細胞需在 ATRA 達到 10µM 時才顯現出抑制的效果，NPC TW01 在 ATRA 1µM 的濃度之下就產生了極佳的抑制效果，兩者有著不小的差異性。而在 NPC TW04 細胞株上 ATRA 單獨使用的抑制效果就比較不顯著，雖然部分達到統計上的意義，但整體來說抑制的量不如 NPC TW01 來的明顯。個別細胞株對於 ATRA 的不同反應影響到後續臨床治療上的應用甚劇，因此在這部分仍需進一步研究找出影響對 ATRA 敏感性差異的因素，甚至於找出臨床上實用的檢測方法。值得一提的是，在 NPC TW01 上， ATRA 的生長抑制效果並未能隨著濃度的上升而增加，隱約顯示出 ATRA 對於細胞生長抑制的作用機轉似乎有很快達到飽和狀 31.

(37) 態的現象。而在本實驗最重要的合併使用這方面，兩株細胞株的實驗結果均顯示出 cisplatin 合併 ATRA 使用治療的潛力。然而這樣的現象似乎仍須建構在維持有相當的 cisplatin 有效濃度之下，合併使用時去提高 ATRA 的濃度所提高的效果並不足以去彌補 cisplatin 濃度降低對於細胞生長抑制的損失。或許也反映出 ATRA 作用機轉的快速飽和與限制，因此在合併治療上的傾向上，cisplatin 濃度仍佔決定性的影響而有著很大的不可取代性，而 ATRA 合併使用時，只要 cisplatin 達到足夠的濃度，ATRA 僅需以最小的 1µM 濃度加入就可以達到最大的藥物合併效果。. 肆、綜合討論由此實驗得到的結果，證實了在針對鼻咽癌以 ATRA 合併傳統化學治療藥物的潛力。之前針對人類卵巢癌，子宮頸細胞癌以及頭頸部以及皮膚鱗狀細胞癌所進行的研究已充分證實了這樣的效應。然而在臨床上對於 retinoids 的應用仍然存在許多疑問。目前也僅有部分頭頸部鱗狀細胞癌的治療是納入了 retinoids 做為合併使用的藥物(Masida 2002)。以此實驗所得到的結果，ATRA 在合併使用時僅需要很低的濃度就可以達到很好的加成效果，況且，繼續增加 ATRA 的濃度並無法顯著 32.

(38) 的增加這種效用。就臨床的觀點來說是非常適合當作合併藥物，因為其副作用與 cisplatin 不同，而且需要的濃度低表示可能之副作用將較小。 . 然而另一方面由實驗的數據來看，要達到相當的加成作用需有一定作用濃度的 cisplatin 下才可發揮。因此若是病患無法承受較高劑量之 cisplatin，或是腫瘤細胞對於 cisplatin 有抗性，此時合併治療的效果就可能大打折扣。另外就是目前人類使用的 ATRA 並沒有針劑的形式，因此口服劑型在血中濃度的穩定性及可掌控性目前仍不易掌握 (Adamson 1995)。另一個需要考慮進去的因素就是關於人體內 retinoid 的代謝。由於人體內參予 retinoid 代謝的 cytochrome P450 (CYP)會有 up-regulation 之現象，因此若是連續使用此類藥物，經過一段時間之後在體內的濃度會大幅降低。可能的解決之道包括間歇性的投予藥物，或是同時合併使用 ATRA 代謝的抑制劑 (Saadeddin 2004)，若能順利解決上述問題，則可以預見 ATRA 將在鼻咽癌的合併化學治療上面佔有一席之地。尤其是對於有遠處轉移的患者，若能提供較低毒性且更有效的合併治療方式想必對於患者的存活時間以及生活品質將有很大的助益。 c-Myc 是一個轉譯的因子 (transcription factor) 會與 E-box 結合並引發許多基因的表現。在人類黑色素瘤細胞中可以發現 c-Myc 的 down-regulation 會增加細胞對於 cisplatin 的敏感度。鼻咽癌細胞株投 33.

(39) 與 ATRA 會使得 c-Myc 表現降低的現象，是否依樣經由類似的機轉而增加對 cisplatin 的敏感度則需進一步證實 (Torigoe 2005)。 ATRA 被認為可以降低 Jun/Jun homodimers 或 Fos/Jun heterodimers 對於 AP-1 cis element 的結合，因而阻止之後轉譯事件的發生。而 AP-1 所調控的基因則控制細胞的生長分化與細胞凋亡。最近的研究顯示，鼻咽癌細胞中的 p53 基因的突變較少，但是同屬一個家族的 p63 基因對於鼻咽癌的致病機轉有很大的關連。在老化以及表現出分化的癌細胞中 p63 蛋白的表現下降，而在生長旺盛的癌細胞上則有大量之表現. P63 的表現與細胞生長的程度呈現相當正比的關係.。(Yip and Tsao， 2008) Cisplatin 對癌細胞的作用一般認為與 p53 與 p73 有關，最近在乳癌細胞上發現， cisplatin 的抗性與 p63/p73 有著相關性。因此可能在 p53 變異較少的鼻咽癌上，對 cisplain 的敏感性也是與 p63 有著密不可分的相關性。而 ATRA 對於 p63 表現的抑制有著很顯著的功效。目前對於 ATRA 如何調控 p63 的表現並不清楚，值得再往後的計畫裡進一步探討。此外 p63 的表現由於在鼻咽癌上與 ATRA 與 cisplatin 的效果皆有相關，臨床上或許具有當做檢測合併化學治療是否有效的指標。 (Leong 2007)。由之前的文獻，對照本次的實驗結果，我們推測使用 ATRA 的效 34.

(40) 果無法隨增加的濃度進一步提升，可能是因為當合併 cisplatin 使用時， ATRA 的角色多半是去調控並降低會造成 cisplatin 抗性的因子，因此最終對癌症細胞的抑制效果仍需依賴 cisplatin 的濃度。. 35.

(41) 參考文獻. 36.

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(46) 圖表. 41.

(47) NPC TW01. 圖一 NPC TW01 之生長曲線以細胞數 10000 做為起始點，隔兩日測量估計細胞總數。在起始日到第四天呈現較緩慢的生長。第四天起細胞的數量開始加速增加，持續到第十天。第十天之後細胞的數量呈現大幅下降。. NPC TW04. 圖二. 圖二. NPC TW04 之生長曲線. 42.

(48) NPCNPC-TW01. -5. 10 mol/L. Control. -4. -3. 10 mol/L. 10 mol/L. -4. 10 mol/L. Control. 圖三. 圖三. 光學顯微鏡下觀察 NPC TW01 細胞株加入 ATRA 後形態學的變化分盤兩天之後的細胞株分別投與 ATRA 小時後，在顯微鏡下觀察。. 43. 10-3 ，10-4，以及 10-5 mol/L，作用 48.

(49) NPCNPC-TW04. -5. 10 mol/L. Control. -4. -3. 10 mol/L. 10 mol/L. -4. 10 mol/L. Control. 圖四. 圖四. 光學顯微鏡下觀察 NPC TW04 細胞株加入 ATRA 後形態學的變化分盤兩天之後的細胞株分別投與 ATRA 48 小時後，在顯微鏡下觀察。. 44. 10-3 ， 10-4 ，以及 10-5 mol/L，作用.

(50) 圖五 NPC TW01 單獨加入 Cisplatin 造成之生長抑制單獨加入 cisplatin 的組別裡，分別加入 cisplatin 0.5，1，2.5，以及 5µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 77%，67.7%，67.2%，以及 50.7% (p 值皆小於 0.05)。. 45.

(51) 圖六. 圖六. NPC TW01 單獨加入 ATRA 造成之生長抑制單獨加入 ATRA 的組別裡，分別加入 ATRA 1、5、10µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 51.3%，41.8%，以及 47.3% (p 值皆小於 0.05)。而在三種不同 ATRA 濃度的組別裡，組間的吸光值並沒有統計上的差異。. 46.

(52) 圖七. 圖七. NPC TW01 合併使用 ATRA 與 cisplatin 造成之生長抑制合併加入 ATRA 以及 cisplatin 的組別裡，分別在 0.5，1，以及 2.5 µM 濃度的 cisplatin 之下，個別加入 ATRA 1，5 以及 10µM 的濃度的比較。 47.

(53) NPCTW04 + Cisplatin OD value ratio 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 control. cis 0.5. cis 1. cis 2.5. cis 5. µM. 圖八. 圖八. NPC TW04 單獨加入 Cisplatin 造成之生長抑制單獨加入 cisplatin 的組別裡，分別加入 cisplatin 0.5，1，2.5，以及 5µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 102.5%，94.7%，90.6%，以及 78.5%，而其中只有加入 2.5µM 與 5µM 此兩組達到統計意義 (p 值分別為 0.023 與 0.005)。. 48.

(54) NPCTW04 + ATRA OD value ratio 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 control. ATRA 1. ATRA 5. ATRA 10. µM. 圖九. 圖九. NPC TW04 單獨加入 ATRA 造成之生長抑制單獨加入 ATRA 的組別裡，分別加入 ATRA 1，5，10µM 與對照組比較，可使吸光值平均降低為 92.2%，77.6%，以及 73% (p 值各為 0.04，0.12，以及 0.02，僅部分達到統計意義)。. 49.

(55) NPCTW04 Cisplatin 0.5µM + ATRA OD value ratio 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Control. cis 0.5+ATRA 1. cis 0.5+ATRA 5. cis 0.5+ATRA 10. µM. NPCTW04 Cisplatin 1µM + ATRA OD value ratio 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Control. cis 1+ATRA 1. cis 1+ATRA 5. cis 1+ATRA 10. µM. NPCTW04 Cisplatin 2.5µM + ATRA OD value ratio 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Control. cis 2.5+RA 1. cis 2.5+RA 5. cis 2.5+RA 10. µM. NPCTW04 Cisplatin 5µM + ATRA OD value ratio 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Control. cis 5+ATRA 1. cis 5+ATRA 5. cis 5+ATRA 10. µM. 圖十 NPC TW04 合併使用 ATRA 與 cisplatin 造成之生長抑制合併加入 ATRA 以及 cisplatin 的組別裡，分別在 0.5，1，以及 2.5 µM 濃度的 cisplatin 之下，個別加入 ATRA 1，5 以及 10µM 的濃度的比較。 50.

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