183 G‹R‹fi
Septisemiye neden olan mikroorganizmalar›n sap-tanmas›, izolasyonu, identifikasyonu ve antibiyotik-lere duyarl›l›klar›n saptanmas› klinik mikrobiyoloji laboratuvarlar›n›n en önemli fonksiyonlar›ndan biri-sidir (1). Bakteriyemili hastalar›n tedavilerinin bafl-lamas›nda kan kültür raporlar›n›n önemi büyüktür (2). Bu nedenle mikrobiyologlar etkenin h›zl› bir fle-kilde saptanmas› ve izolasyonunda optimal yöntem-leri seçmelidirler (1). Bu çal›flmada ampirik tedaviyi yönlendirmede yol göstermek amac›yla kan kültürle-rinde mikroskopik incelemenin öneminin
vurgulan-mas› amaçlanm›flt›r. GEREÇ VE YÖNTEM
Çal›flmaya üç ayl›k period s›ras›nda BacT/Alert oto-matize kan kültür sisteminde pozitif sinyal veren ve negatif olan toplam 750 kan kültürü al›nm›flt›r. Kan kültür fliflesi olarak hem standart BacT/Alert aerobik flifleler hem de BacT/Alert FAN flifleleri kullan›lm›fl-t›r. fiiflelerdeki besiyerlerinden haz›rlanan preparatlar hem Gram hem de metilen mavisi boyama yöntem-leriyle boyanm›fl , ayr›ca kanl› triptik soy agar, eosin methylene blue (EMB) ve çikolatams› besiyerlerine ekimler yap›lm›flt›r. Kanl› ve EMB besiyerleri aerop ortamda , çikolata besiyerleri % 5 CO2’li ortamda 48
Kan Kültürlerinde Mikroskopik ‹ncelemenin Önemi
Çi¤dem KUZUCU(*), Melek AYAN(*), Bengül DURMAZ(*)
ÖZET
Kanda bulunan mikroorganizmalar›n h›zl› bir flekilde sap-tanmas› klinik mikrobiyoloji laboratuvar›n›n en önemli görevlerinden birisidir. Bu çal›flmada BacT/Alert otomati-ze kan kültür sisteminde, tüm kültür fliflelerinden Gram ve metilen mavisi boyama yöntemleri kullan›larak yap›lan mikroskopik incelemenin önemi araflt›r›lm›flt›r. Çal›flmaya 142’si pozitif alarm veren, 608’si negatif toplam 750 kan kültürü al›nm›flt›r. Pozitif alarm veren 142 kan kültürünün 115’inde bakteri görülmüfl ve bunlar›n 110’unda aerop, 5’inde anaerop bakteri üremifltir. Pozitif alarm veren 27 örnekte her iki boyama yöntemi ile bakteri görülmemesine ra¤men, bunlar›n 2’sinde inkübasyonun sekinzinci günün-de Brucella cinsi bakteri üremifl, di¤erlerinin kültürleringünün-de de aerop ve anaerop üreme olmam›flt›r (Yalanc› pozitiflik oran› % 18). Üreme alarm› vermeyen 608 örne¤in 606’s›n-da bakteri görülmemifl ve bunlar›n kültürlerinde de üreme olmam›flt›r, iki örnekte Gram negatif bakteri görülmüfl ve kültürde Pseudomonas aeruginosa üremifltir (yalanc› ne-gatiflik oran› % 0.3). BacT/Alert FAN fliflelerden yap›lan mikroskopilerde besiyerindeki kömür tozu partikülleri ne-deniyle Gram boyaman›n de¤erlendirilmesinde güçlük ya-flan›rken, metilen mavisi ile yap›lan boyamada bu sorun olmam›flt›r. Bu nedenle her iki boyama yönteminin birlikte de¤erlendirilmesinin uygun oldu¤u düflünülmüfltür.
Anahtar kelimeler: Kan kültürü, Gram boyama, metilen mavisi boyama
SUMMARY
The Importance of the Microscopic Examination of Blo-od Cultures
Rapid, reliable determination of microorganisms from blo-od is one of the most important functions of clinical micro-biology laboratory. In this study, the importance of Gram stain and methylene blue stain were investigated for all of the blood culture bottles monitored by the BacT/Alert system. A total of 750 blood cultures were examinied. Of these 142 were positive signaling bottles and 608 had no signal. Microorganisms were observed in 115 out of 142 positive blood culture bottles. Of these 110 were aerobic and five were anaerobic microorganisms. No microorga-nisms were detected in 27 blood culture bottles despite po-sitive signaling, Brucella spp. were isolated from two blo-od cultures on the eighth day of incubation (The false po-sitive rate was 18 %). No microorganisms were detected in 606 out of 608 negative signaling bottles. Gram negative microorganisms were observed in two bottles and P.aeru-ginosa were isolated from both of these cultures (The false negative rate was 0.3 %).
Although the evaluation of Gram stained smears were mo-re difficult for BacT/Alert FAN media due to the charcoal particles in the media, there were no problems associated with mehylene blue stain . Therefore, both staining met-hods can be used simultaneously for microscopic examina-tion.
Key words: Blood culture, Gram stain, methylene blue sta-in.
(*) ‹nönü üniversitesi T›p Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mik-robiyoloji Ana Bilim Dal›,Malatya.
184
saat inkübe edilmifltir. Pozitif alarm veren fliflelerden yap›lan kültürlerde üreme olmad›¤› durumlarda vita-min K ve hevita-min ilaveli kanl› Brucella besiyerine ekim yap›larak befl gün inkübe edilmifltir. Pozitif alarm verip aerop ve anaerop üreme olmayan flifleler yalanc› pozitif olarak de¤erlendirilmifltir. Tüm ya-lanc› pozitif olarak saptanan fliflelerden yedinci gü-nün sonunda yeniden ekimler yap›lm›flt›r. Mikroor-ganizmalar›n identifikasyonu klasik yöntemlerle ya-p›lm›fl, gerekti¤i durumlarda do¤rulamak amac›yla API 20 E ve BBL Crystal Anaerobe ID sistemleri kullan›lm›flt›r.
BULGULAR
Toplam 750 kan kültür fliflesinin 142’si pozitif alarm vermifl 608’i negatif olarak sistemden ç›kar›lm›flt›r. Pozitif alarm veren 142 kan kültüründen 115’inde mikroorganizma görülmüfl ve bunlar›n 110’unda ae-rop beflinde anaeae-rop bakteri üremifltir. Üreyen mik-roorganizmalar›n listesi Tablo I’de gösterilmifltir. Po-zitif alarm veren 27 kan kültürünün Gram ve metilen boyamas›nda mikroorganizma görülmemifl, bunlar›n 25’inde aerop ve anaerop ekim sonucu üreme olma-m›fl ve yalanc› pozitif olarak de¤erlendirilmifltir ( Ya-lanc› pozitiflik oran› %18). Di¤er iki kan kültürü bruselloz ön tan›s› ile infeksiyon hastal›klar› klini-¤inde yatmakta olan bir hastaya ait olup inkübasyo-nun yedinci gününde ayn› zamanda pozitif alarm vermifltir. Yap›lan boyamalar sonucu mikroorganiz-ma görülmemifl ve inkübasyonun 48. saatinde üreme olmamas› nedeniyle plaklar›n inkübasyonu uzat›l-m›flt›r. ‹nkübasyonun sekizinci gününde Brucella cinsi bakteri üremifltir.
‹nkübasyon süresinin sonunda negatif ç›kan 608 kan kültürünün 606’s›nda her iki boyama yöntemi ile mikroorganizma görülmemifl ve kültürlerinde de üreme olmam›flt›r. Negatif ç›kar›lan iki fliflede ise bo-yama sonucu Gram negatif bakteri görülmüfl ve her iki kültürde de Pseudomonas aeruginosa üremifltir (Yalanc› negatiflik oran› % 0.3). Tablo 2’de tüm kül-türlerde Gram ve metilen boyamas›yla üreme sonuç-lar› de¤erlendirilmifltir. Gram boyama ve metilen bo-yamas› ile mikroorganizmalar›n % 98 ‘i saptanm›flt›r. TARTIfiMA
Kanda mikroorganizmalar›n bulunmas› önemli mor-bidite ve mortalite nedeni oldu¤undan klinik
mikro-biyoloji laboratuvarlar›nda kan kültürlerinin incelen-mesi kritik bir öneme sahiptir (3). Ço¤u laboratuvar-da bu amaçla otomatize kan kültür sistemleri kulla-n›lmaktad›r. Antimikrobiyal tedavinin seçiminde yol gösterici olaca¤›ndan pozitif kan kültürleri, Gram boyama ile boyanarak klinisyene rapor edilmelidir (4). Kan kültür sistemlerinin de¤erlendirildi¤i çal›fl-malar›n tümünde pozitif alarm veren örneklerden Gram boyama yap›lm›flt›r (2,5,6,7,8). Çal›flmam›zda hem pozitif hem de negatif toplam 750 kan kültürü Gram ve metilen mavisi boyama yöntemi ile incelen-mifltir. Pozitif alarm veren 142 kan kültürünün 115’inde mikroorganizma görülmüfl ve bunlar›n sub-kültürlerinde de üreme olmufltur. Pozitif alarm veren 27 kültürde boyama ile mikroorganizma görülmemifl ve bunlar›n 25’inde aerop ve anaerop üreme saptan-mam›flt›r (Yalanc› pozitiflik oran› % 18), ancak iki
Say› 7 5 16 8 4 2 2 5 3 32 10 3 1 1 1 2 4 1 11 119 Tablo 1. ‹zole edilen mikroorganizmalar›n da¤›l›m›:
Mikroorganizma Candida spp Candida albicans Klebsiella oxytoca Salmonella spp. Enterobacter cloacae Escherichia coli Brucella spp. Pseudomonas aeruginosa Non fermentatif Gr(-) çomak Koagülaz (-) stafilokok Staphylococcus aureus Enterokok D grubu streptokok G grubu streptokok C grubu streptokok S.aureus + Enterokok Propionibacterium acnes Anaerop bakteri (tan›mlanamad›) Kontaminasyon
Toplam
Gram/metilen boyama sonucu mikroorganizma
Tablo 2. Gram/metilen mavisi ile boyama ve üreme sonuçlar›
+ 117 2 119 Üreme -25 606 631 + 115 2 117 27 606 633 Pozitif Negatif Toplam Alarm (142) (608) (750)
185 kültürde Brucella türü bakteri üremifltir. BacT/Alert
otomatize kan kültür sistemleriyle yap›lan çal›flma-larda genellikle yalanc› pozitiflik oran› % 0.4-8.4 aras›nda de¤iflmektedir (5,9,10). Çal›flmam›zda bu oran % 18 olarak bulunmufltur.
Zor üreyen bir bakteri olan Brucella üremesi için özel besiyerleri ve uzun bir inkübasyon dönemi ge-rektirir. BACTEC besiyerlerinde yaklafl›k 3-30 gün-de üremektedir (3). Özyurt ve ark (11) BacT/Alert sisteminde bruselloz türlerini 23 günde saptad›klar›-n› bildirmifllerdir. Çal›flmam›zda infek-siyon hasta-l›klar› klini¤inden Brucellloz ön tan›s›yla gönderilen ayn› hastaya ait iki kan örne¤i inkübasyonun yedinci gününde pozitif alarm vermifl, Gram ve metilen ma-visi boyamalar›nda mikroorganizma görülmemifl, 48 saatlik kültür-lerinde de üreme olmam›flt›r. Bruselloz ön tan›s› olmas› nedeniyle ekim besiyerlerinin inkü-basyonlar› uzat›lm›fl ve inkübasyonun sekizinci gü-nünde Brucella cinsi bakteri üremifltir. Geç üreyebil-mesi nedeniyle bruselloz ön tan›l› hastalarda hem kan kültür fliflelerinin inkübasyonunun, hem de besi-yerlerinin inkübasyonunun uzat›lmas› gereklidir. Negatif 608 kan kültürünün 606’s›nda boyamada mikroorganizma görülmemifl ve bunlar›n kültürlerin-de üreme olmam›flt›r, 2 kültürkültürlerin-de Gram negatif bakte-ri görülmüfl ve her ikisinde de Pseudomonas aerugi-nosaüremifltir (Yalanc› negatiflik oran› % 0.3). Ya-p›lan çal›flmalarda yalanc› negatiflik oran› % 0.3-6 aras›nda de¤iflmektedir (7,9,12). Her laboratuvar hasta populasyonu ve izole edilen mikroorganizma-lar› göz önünde bulundurarak yalanc› negatifli¤i de-¤erlendirmeli ve subkültürlerin yap›l›p yap›lmamas›-na karar vermelidir.
Toplam 527 kan kültürünün incelendi¤i bir araflt›r-mada mikroorganizmalar›n saptanma oran› metilen mavisi boyama yöntemi ile % 99, acridin oranj boya-ma ile % 94 ve Gram boyaboya-ma ile % 93 bulunmufltur . Bu çal›flmada floresan mikroskop gerektirmedi¤i ve laboratuvarlarda kolayl›kla yap›labilece¤i için kan kültürlerinde mikroorganizmalar›n varl›¤›n› do¤rula-mada metilen mavisi boyama yöntemi önerilmekte ve mikroorganizma görüldü¤ünde Gram boyama ya-p›lmas› önerilmektedir (13). Çal›flmam›zda her iki boyama yöntemi birlikte yap›lm›fl ve ikisi birlikte de¤erlendirilmifl olup mikroorganizma saptama
ora-n› % 98 olarak bulunmufltur. BacT/Alert standart fli-flelerde her iki boyama yöntemi ile de¤erlendirme sorunu yaflanmam›flt›r. BacT/Alert FAN fliflelerden yap›lan mikroskopilerde ise besiyerindeki kömür to-zu partikülleri nedeniyle Gram boyaman›n de¤erlen-dirilmesinde güçlük yaflan›rken, metilen mavisi ile yap›lan boyamada bu sorun olmam›flt›r. Bu nedenle her iki boyama yönteminin birlikte de¤erlendirilme-sinin uygun oldu¤u düflünülmüfltür. Yap›lan çal›flma-larda da kömür tozu partikülleri içeren FAN besiyer-lerinden yap›lan Gram boyama sonucu, kömür tozu partikülleriyle benzer büyüklükteki bakteri ve maya hücrelerini de¤erlendirmenin güçlü¤ünden ve zaman al›c›l›¤›ndan bahsedilmektedir (7,9).
Sonuç olarak klinisyene tedaviyi planlamada yar-d›mc› olmak için tüm pozitif kan kültürlerinde hem Gram boyama hem de metilen mavisi boyama yönte-mi ile yönte-mikroskopik inceleme yap›lmal›, yine negatif örneklerde de subkültür yap›lmayacaksa mikrosko-pik inceleme yap›larak sonuç rapor edilmelidir.
KAYNAKLAR
1.Washington JA: Blood cultures:An overview, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 8: 803 (1989).
2.Cunney RJ, McNamara EB, Alansari N, Loo B, Smyth EG:The impact of blood culture reporting and cli-nical liaison on the empiric treatment of bacteraemia, J Clin Pathol 50: 1010 (1997).
3.Reimer LG, Wilson ML, Weinstein MP:Update on de-tection of bacteremia and fungemia, Clin Microbiol Rev 10: 444 (1997).
4.H›ndler JA, Dunne WM, Nolte FS, W›lson ML: Blo-od cultures III, Cumitech series, American Society for Microbiology, Cumitech 1B, Washington DC. 1997. 5.Smith JA, Bryce EA, Nguiyen JH, Roberts FJ: Com-parison of BACTEC 9240 and BacT/Alert blood culture systems in an adult hospital, J Clin Microbiol 23:1905 (1995).
6.Murray PR, Holl›ck GE, Jerris RC, Wilson ML: Mul-ticenter comparison of BACTEC 9050 and BACTEC 9240 blood culture systems, J Clin Microbiol 36:1601 (1998). 7.Ziegler R, Johnscher I, Martus P, Lenhardt D, Just HM: Controlled clinical laboratory comparison of two supplemented aerobic and anaerobic media used in auto-mated blood culture systems to detect bloodstream infecti-ons, J Clin Microbiol 36:657 (1998).
8.Pohlman JK, K›rkley BA, Easley KA, Basille BA, Washington JA:Controlled clinical evaluation of BAC-TEC Plus Aerobic/F and BacT/Alert Aerobic FAN bottles for detection of bloodstream infections, J Clin Microbiol 33: 2856 (1995).
186
9.Jorgensen JH, M›rrett S, McDonald LC, Murray PR, Weinstein MP, Fune J, Trippy CW, Masterson M, Rel-ler B: Controlled clinical laboratory comparison of BAC-TEC Plus Aerobic/F resin medium with BacT/Alert Aero-bic FAN medium for detection of bacteremia and fungemi-a, J Clin Microbiol 35:53 (1997).
10.Saniç A, Günayd›n M, Özdemir fi, Alt›ntop L, ‹fllek ‹: Kan kültürlerinde h›zl› tan› sisteminin etkinli¤inin arafl-t›r›lmas›, Klimik Derg 8:135 (1995).
11.Özyurt M, Albay A, Y›ld›ran fiT, Baflustao¤lu A,
Gün H: BacT/Alert otomatize kan kültür sistemi ile iki y›ll›k dönemde al›nan sonuçlar: Retrospektif bir çal›flma, ‹nfek Derg. 12: 323 (1998).
12.Shigei JT, Shimabukuro, Pezzlo MT, De La Maza LM, Peterson EM:Value of terminal subcultures for blo-od cultures monitored by BACTEC 9240, J Clin Microbi-ol 33:1385 (1995).
13.Scolea LJ, Baldigo SM:The detection of positive blo-od cultures in children using the acridine orange, gram, and methylene blue stains, Can J Microbiol 29: 729 (1983).
Türk Mikrobiyol Cem Derg 32: 183-186
