BAKTERİ KÜLTÜRÜ
Doç. Dr. Hilâl Özdağ
GÜVENLİ VE ETKİN
LABORATUVAR UYGULAMALARI
111-546
RİSK GRUPLARI
• Sınıf 1 (risksiz): Patojen olmayan (E. coli, B.
subtilis)
• Sınıf 2 (düşük risk): Shigella, Salmonella
• Sınıf 3 (soluma durumunda yüksek risk):
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis…
• Sınıf 4 (birey ve toplum için yüksek risk):
arbovirüs, arenavirüs, filovirus.
RİSK GRUPLARI
• Sınıf 1 (risksiz): Bençte çalışılabilir.
• Sınıf 2 (düşük risk): Sınıf 2 biyogüvenlik kabini.
• Sınıf 3 (soluma durumunda yüksek risk): Ayrı bir oda gerektirir. Diğer odalarla kapı veya havalandırma yolu ile hava değişimi olmamalıdır. Giriş çıkış kontrollü olmalı, özel kıyafet giyilmeli ve bütün çalışmalar biyogüvenlik kabinlerinde yürütülmelidir.
• Sınıf 4 (birey ve toplum için yüksek risk): Hükümet
nezninde izni olan az sayıda laboratuvarda yürütülebilen
çalışmalardır.
ALTYAPI
• Lab tezgahında:
– Mutant seçimi
– Organizmaların büyütülmesi
– Bakteri konsantrasyonunun belirlenmesi – Transformasyon
– Plazmid izolasyonu yapılabilir.
ALTYAPI
• İnkübatör: Genellikle 37oC
• Çalkalamalı inkübatör (aerobik büyüme için)
• Santrifüjler
• Vorteks
• Bek (bunsen burner)
• Biyogüvenlik kabini (petri dökmek, besiyeri bileşenlerinin filtre sterilizasyonlarını gerçekleştirmek için)
• Elektroporatör (transformasyon için)
• Spektrofotometre (büyümeyi gözlemek için)
Çalışma Kuralları
• Yemek, içmek, ağızla pipetleme yapmak, açık ayakkabı giymek veya lab önlüğünü lab dışında giymek yasaktır.
• Çalışma alanınızı günde en az bir kez ve her bakteri döküldüğünde bir dezenfektan ile silin.
• Bulaşıcı (enfeksiyöz) atıkları atmadan önce dekontamine edin.
• Eldiven giyiyorsanız dahi laboratuvardan çıkmadan önce muhakkak ellerinizi yıkayın.
• Sıvı atığı son konsantrasyonu %10 olacak şekilde çamaşır suyunda 30 dakika bekletip lavabodan akar suyun altında dökün.
• Katı atığı tıbbi atık çöpüne atın.
Çalışma Kuralları
• Aerosol oluşumunu minimalize edecek şekilde çalışın.
Pipetleme, dökme, kapak açma aşamalarına itina edin.
• Petri kaplarını ve tüpleri gereksiz yere biriktirmeyin.
Buzdolabındaki gereksiz kültürler tam bir
kontaminasyon kaynağıdırlar.
Bakterileri Nereden Elde Edeceğiz?
• Lab üyeleri
• Diğer araştırıcılar
• ATCC
• Firmalar
BAKIM VE BÜYÜTME
• Aerobik/Anaerobik
• Durağan/Çalkalamalı
• Sıvı/Yarı-katı
• Bir bakteriyi üretmeden önce fizyolojisini bilmelisiniz.
SIVI KÜLTÜRLER
• Mümkünse besiyerini laminar kabinde hazırlayın.
• Eğer besiyerinin kontamine olduğunu düşünüyorsanız
gece boyu 37 o C’de inkübe edin, üreme olup olmadığını
görün.
KATI KÜLTÜRLER
• 100 mm hücre kültürü kaplarını bakteri kültürü için kullanmayın. Gereksiz ve pahalı bir harcama yapmış olursunuz.
• Katı kültürleri birbirinden ayırmak için kod veya renk uygulaması yapılmasında fayda vardır.
• 50 o C veya üstündeki sıcaklıktaki besiyerini eldivenle
tutup dökebiliyorsanız da dökmeyin zira çok sıcak
dökülen besiyerleri aşırı kondensasyona neden olur.
KATI KÜLTÜRLER
• Besiyerinin şişenin kenarından taşıp akmasına fırsat vermeyin. Petri kabına damlayıp kontaminasyona neden olabilir. Böyle sızıntıları hemen temizleyin.
• Petri kabının yüzeyi pürüzsüz olmalı. Petri yüzeyinde kabarcık oluşursa hızlıca alevden geçirip kabarcığı yok edin. Plastik petrilerde bu aşamaya dikkat edin.
• Kullandığınız antibiyotik ışığa duyarlı ise petri kaplarını
alüminyum folyo ile kaplayın veya bir kutuya koyun
(örn. Tetrasiklin)
DONDURULMUŞ KÜLTÜRLER
• Çözülüp yeniden ekilen kültürlerin lag fazları biraz uzayacaktır. Bu nedenle bu tip kültürlere normalden iki kat fazla süre verin.
• Bakteri kültürlerini sürekli olarak dondurup çözmekten kaçının.
• Eğer kültürünüz antibiyotik direnç geni içeren plazmid taşıyorsa besiyerine antibiyotik ilave etmelisiniz.
Ancak Tetr, Ampr, Kanr veya Camr taşıyan suşların
antibiyotik direnç genleri ifade bulana dek
antibiyotiksiz olarak kültür edilmeleri gerekmektedir.
ANTİBİYOTİKLER
• Genetik olarak tasarlanmış plazmidlerin genellikle en azından bir antibiyotik için direnç geni taşırlar. Bu ilgili bakterinin araştırıcının istediği geni ifade etmesi durumunda seçilebilmesini mümkün kılar.
• Plazmidlerin hemen tamamı bir veya daha fazla direnç geni taşır (amp, tet, chl, kan).
• Antibiyotikler ısıya duyarlıdır bu nedenle besiyeri
sterilize olup soğuduktan sonra eklenir. Genellikle
dondurulmuş ve tek kullanımlık hacimlere bölünerek
saklanır.
TEK KOLONİ EKİMİ
• Öze ile
• Tek tip bakteri üretmek için muhakkak gerekli.
• Kontaminasyonu asgariye indirmek için:
– Eğer sağ elinizi kullanıyorsanız alevi sağınıza yerleştirin.
– Petri kaplarını solunuza.
– Bakteri örnekleri ortada olmalı.
– Tüp veya şişelerin ağızlarını gevşetmiş olun.
• Bütün petri kaplarını baş aşağı yerleştirin ki kondensasyon kolonilerin üzerine damlamasın.
• Yayma yapmadan önce özenizi petrinin yayma yapmayacağınız
bir köşesinde soğutun.
SAKLAMA
• Kısa dönemli: Petri kaplarındaki koloniler ve sıvı kültürler 4
oC’de birkaç hafta saklanabilir. Petri kaplarının ömrünü uzatmak için parafilm ile iyice kaplanmalıdır.
• Uzun dönemli: Her bakteri için tercih edilmesi gereken usul değişebilir.
– Altkültür: Sürekli büyütme ve saklama
• Avantaj: Hemen ulaşılabilirlik. Düşük maliyet.
• Dezavantaj: Hayatiyet kaybı, kontaminasyon riskinin yükselmesi, fenotip stabilitesinin kaybı.
– Kurutma: Su uzaklaştırılır. Mantar için sık kullanılır. Bazı bakteriler için de uygundur.
• Avantaj: Ucuz, kontaminasyona açık değil.
• Dezavantaj: Hangi suşa uygun olduğu bilgisi çok açık değil.
– Dondurma/Kurutma: Donmuş kültürden süblimasyon ile su uzaklaştırılır.
Kurutulduktan sonra örnekler vakum altında cam ampüllerde saklanır.
• Avantaj: Uzun dönemli kültürler kolayca korunur.
• Dezavantaj: Gerekli cihazlar bütün laboratuvarlarda mevcut değildir.
– Dondurma ve düşük ısıda saklama: Gliserol stokları -70 veya -196
oC’de saklamak mümkündür.
• Avantaj: Birçok hücre için uygundur.
• Dezavantaj: Dondurucular pahalıdır. Soğutmadan dondurmaya ve eritme aşamalarında hücrelere hasar verilmesi mümkündür.
