Mersin Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, Mersin
Feza Ota¤, Gönül Aslan, Sebahat fien, Gürol Emekdafl
‹letiflim / Correspondence: Yrd. Doç. Dr. Feza Ota¤ Adres / Address: Mersin Üniversitesi T›p Fakültesi T›bbi Mikrobiyoloji Anabilim Dal›, 33079, Mersin Tel. 324 337 43 00/1541, Faks. 324 337 43 05 E-mail: fezaotag@mersin.edu.tr
ÖZET
CHROMagar Candida besiyeri (CAC) C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata ve C. parapsilosis' in tan›mlanmas›n-da kullan›lan seçtirici ve ay›rt ettirici bir besiyeridir. Bu besiyeninde sufllar, 35°C'de bir gecelik inkübasyonun ard›ntan›mlanmas›n-dan s›-ras›yla yeflil, çelik mavi, pembe, parlak beyaz ve koyu pembe-mor renkte kolayl›kla ay›rt edilebilen koloniler oluflturmakta-d›rlar. Bu çal›flmada, fiubat 2002-A¤ustos 2003 tarihleri aras›nda çeflitli klinik örneklerden izole edilen toplam 35 stok Can-dida suflu ile Eylül 2003-Mart 2006 tarihleri aras›nda çeflitli kliniklerden gönderilen ve maya hücreleri saptanan toplam 283 kan kültürü örne¤i CAC besiyerinin etkinli¤inin ve rutin maya tan›s›ndaki yerinin saptanmas› amac›yla de¤erlendirilmifltir. Kontrol amac›yla ayn› zamanda Sabouraud Dekstroz Agara da ekim yap›lm›flt›r. Stok sufllar›n ve kan kültürlerinden izole edi-len sufllar›n %92-94'den fazlas›n› oluflturan C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. Krusei ve C. glabrata kolonileri morfolojilerine ve renklerine göre do¤ru tan›mlanm›flt›r. CAC besiyerinin kullan›m› ile Candida türlerinin do¤rudan tan›s› klinisyenlere yüksek riskli fungemi flüpheli hastalar için do¤ru antifungal seçiminde h›z kazand›raca¤› gibi morbidite ve mor-talitenin düflmesine de yard›mc› olacakt›r.
Anahtar sözcükler: Chromagar Candida, Candida türleri, fungemi, mayalar›n h›zl› tan›s› SUMMARY
CHROMagar Candida is a new differential medium that allows selective isolation of yeasts and simultaneously identifies co-lonies of Candida albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. glabrata and C. parapsilosis. Colony morphology and color have be-en well defined whbe-en CAC has bebe-en used to isolate yeast directly from clinical specimbe-ens. We evaluated the designation of effectiveness and ability of this medium with 35 stock Candida strains, isolated from different clinical specimens, between February 2002-Agust 2003, and 283 hemoculture specimens which yeast cells were determined, between September 2003-March 2006. As a control the same isolates were inoculated on SDA simultaneously. Stock and clinical isolates, consisting of over 92-94% of C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. Krusei and C. glabrata, were correctly identified on the basis of colony morphology. Direct isolation could allow mycology laboratories to more rapidly identify Candida strains, enable clinicians to more quickly make antifungal drug selections, and potentially decreases patient mortality and morbidity. Key words: Chromagar Candida, Candida spp., fungemia, rapid identification of yeast
Fungemi etkeni Candida türlerinin h›zl› tan›s›nda
CHROMagar Candida besiyerininin kullan›m›
Use of CHROMagar Candida for rapid identification
of Candida species isolated from bloodstream infections
G‹R‹fi
Son yirmi y›lda Candida türleri kan kültürlerin-den izole edilen hastane infeksiyonlar› patojenle-ri aras›nda dördüncü s›rada olup mortalite oran› %40 olarak bildirilmektedir (1). C. albicans fun-geminin en s›k etkeni olarak bilinmekteyken izo-le ediizo-len türizo-lerin albicans d›fl› Candida türizo-leri izo- le-hine giderek artmakta oldu¤u ve beraberinde an-tifungal ajanlara duyarl›l›k azalmas›n›n görüldü¤ü bildirilmektedir (2). Dolay›s›yla klinisyenlerin uy-gun antifungal ajan seçimi için etkenin çabuk izolasyonu önem kazanm›flt›r. H›zl› maya identi-fikasyonu amac›yla birçok kromojenik besiyeri gelifltirilmifltir. Türe özgü kromojenik substratlar içeren bu besiyerlerinde mayalar ürettikleri en-zimlerle reaksiyona girerek çeflitli renkte koloni-ler oluflturmaktad›rlar (3, 4, 5). CHROMagar Candida (CAC) haz›r besiyeri öncelikle C. albi-cans, C.tropicalis ve C. krusei için tasarlanm›fl olup 35°C' de bir gecelik inkübasyonun ard›ndan s›ras›yla yeflil, çelik mavi ve toz pembe renkte kolayl›kla ay›rt edilebilen koloniler oluflturmakta-d›rlar (6, 7, 8). C. glabrata ve C. parapsilosis tür-lerinin de CAC besiyerinde kolayl›kla tan›nabil-di¤ini bildiren çal›flmalar bulunmaktad›r (4, 6, 7). CAC besiyerinin kullan›m› uygun antifungal aja-n›n çabuk seçilmesi ve tedaviye erken bafllanma-s› aç›bafllanma-s›ndan klinisyene ve hastaya zaman kazan-d›racakt›r. Bu çal›flmada, fiubat 2002-A¤ustos 2003 tarihleri aras›nda çeflitli örneklerden izole edilmifl 35 stok Candida suflu ile Eylül 2003-Mart 2006 tarihleri aras›nda çeflitli kliniklerden gönderilen 283 kan kültürü örne¤i çal›flmaya al›n-m›fl ve mayalar›n h›zl› tan›s› için CAC besiyeri-nin etkinli¤i ve kullan›m kolayl›¤› araflt›r›lm›flt›r. GEREÇ VE YÖNTEM
Stok sufllar. Mersin Üniversitesi T›p Fakültesi Araflt›rma ve Uygulama Hastanesi kliniklerinden fiubat 2002-A¤ustos 2003 tarihleri aras›nda labo-ratuvar›m›za gönderilen çeflitli klinik örneklerden izole edilen toplam 35 maya suflu [C. albicans (20 sufl), C. tropicalis (5 sufl), C. glabrata (1 sufl), C. lusitaniae (1 sufl), C. parapsilosis (6 sufl),
C. guillermondii (1 sufl), C. krusei (1 sufl)], CAC besiyerinin etkinli¤inin araflt›r›lmas› amac›yla çal›flmaya dahil edilmifltir. Konvansiyonel yöntemler (m›s›r unu-tween 80 agarda hif ve blastospor oluflumunun izlenmesi, çimlenme borusu deneyi) ve API 20 C AUX (Bio-Merieux, Fransa) ticari kiti kullan›larak tan›mlanan bu sufllar birer örnek olmak üzere serum fizyolojikli ve gliserinli buyyonlu ortamlarda korunarak saklanm›flt›r. Tüm sufllar 90-mm. petride haz›rlanm›fl ticari CAC (BBL, Becton-Dickenson, Fransa) besiyerine ve Sabouraud dekstroz agara (SDA) (Oxoid) ekilerek 35˚C'de, aerobik ortam-da, 24-48 saat inkübasyona b›rak›lm›flt›r. Klinik örnekler. Eylül 2003-Mart 2006 tarihleri aras›nda çeflitli kliniklerden gönderilen ve maya hücreleri saptanan toplam 283 kan kültürü örne-¤i CAC besiyerinin rutin maya tan›s›ndaki yeri-nin saptanmas› amac›yla de¤erlendirilmifltir. Kan kültürleri BACTEC-9120 (Becton-Dickenson, ‹n-giltere) otomatik inkübatör sisteminde takip edi-lirken pozitif sinyal veren ve Gram boyama ile maya hücreleri saptanan fliflelerden SDA ve CAC besiyerlerine ekim yap›lm›fl, 35˚C'de, aerobik or-tamda, 24 saatlik inkübasyondan sonra SDA'da üreyen koloniler hif ve blastokonidyum yap›lar›-n›n ve germ tüp oluflumunun incelenmesi için s›-ras›yla m›s›r unu-tween 80 agara (Oxoid) ve in-san serumuna ekimleri yap›lm›flt›r. Ayr›ca gerek-ti¤inde API 20 C AUX veya ID 32 C (Bio-Me-rieux, Fransa) ticari kiti kullan›lm›flt›r. C. albicans ve C. dubliniensis ayr›m› için 42ºC'de üreme de-neyi uygulanm›fl ve Staib agara ekim yap›lm›flt›r. Mikrobiyolojik çal›flma. CAC besiyerinde üreyen maya kolonileri 7 gün süreyle, oda ›s›s›nda ve ›fl›ktan korunarak muhafaza edilirken, renk, genifl-lik, koloni çevresindeki renk difüzyonu, gibi özellikleri en az iki mikrobiyolog taraf›ndan iz-lenerek kaydedilmifltir. Birinci, ikinci ve üçüncü günlerde örneklerin foto¤raflar› çekilmifltir. CAC'deki renk de¤iflimleri referans sufllarla kar-fl›laflt›r›lm›flt›r. Kontrol suflu olarak ATCC (100231) C. albicans, ATCC (750) C. tropicalis,
ATCC (6258) C. krusei, ATCC (66032) C. glabra-ta ve ATCC (22019) C. parapsilosis kullan›lm›flt›r. BULGULAR
CHROMagar Candida besiyerinde kontrol sufllar›, bir gecelik inkübasyonun ard›ndan, C. albicans yeflil, C. tropicalis çelik mavi, C. kruse-i yass›-düz, kenarlar› beyazlaflm›fl toz pembe renkte ve tüylü görünümlü, C. glabrata koyu pembe-mor ve C. parapsilosis ise parlak beyaz renkli koloniler oluflturmufltur (4, 5, 9)
CAC ve SDA'ya ekimleri yap›lan otuzbefl stok suflun 33'ü (%94.3), 20 C. albicans, befl C. tropicalis, alt› C. parapsilosis, bir C. glabrata ve bir C. krusei tür düzeyinde tan›mlanm›flt›r. Di¤er iki tür, C. lusitaniae ve C. guillermondii ay›rt edilemeyen küçük pembe renkte koloniler oluflturmufltur. Ancak C. guillermondii kolonileri 48 saatten sonra oluflturmaya bafllad›¤› karakteristik yap›s›yla di¤erlerinden ayr›lmaya bafllam›flt›r; koloni rengi pembe-leylak tona kayarken koloni yüzeyi kuru ve pürtüklü bir görünüm kazanm›flt›r. Eylül 2003-Mart 2006 tarihleri aras›nda çeflitli kli-niklerden gönderilen ve maya hücreleri saptanan toplam 283 kan kültürü örne¤inden 287 Candida suflu izole edilmifltir. Dört örnekte ikifler tür üre-mifltir. Rutin laboratuvar ifl ak›fl› s›ras›nda kullan›-lan identifikasyon yöntemleriyle (konvansiyonel yöntemler ve gerekti¤inde API kitleri kullan›larak) s›kl›k s›ras›yla, C. parapsilosis (155 sufl), C. albi-cans (62 sufl), C. tropicalis (34 sufl), C. glabrata (12 sufl), C. kefyr (6 sufl), Geothrichum capitatum (6 sufl), C. guillermondii (5 sufl), C. lipolytica (3 sufl), C. krusei (2 sufl), C. inconspicua/norvegensis (1 sufl), Saccharomyces cerevisiae (1 sufl) olarak tan›mlanm›flt›r.
En çok izole edilen 265 sufl (%92.3), C. parapsi-losis, C. albicans, C. tropicalis ve C. glabrata, CAC besiyerinde 24 saatlik inkübasyondan sonra türe özgün tan›mlanm›fl renkte koloniler oluflturmufllar-d›r. Germ tüp ve klamidospor oluflturan Candida sufllar›n›n tamam› CAC besiyerinde yeflil renkli ko-loniler oluflturmufltur. C. albicans olarak tan›mlanan
sufllara uygulanan 42˚C deneyi ve Staib agar'a ekim sonucunda C. dubliniensis lehine sonuç al›n-mam›flt›r. Germ tüp ve klamidospor oluflturmayan albicans d›fl› sufllar öncelikle m›s›runu agarda olufl-turduklar› hif ve blastokonidyum yap›lar›na göre ayr›lm›fl ve API ID 32 C veya API 20C AUX oksonogram kiti kullan›larak konfirme edilmifltir. CAC besiyerinde oluflturduklar› pigmentasyonlar›na göre de¤erlendirilmifltir.
C. albicans, C. tropicalis, C. krusei ve C. glabrata' n›n 48 satten sonraki koloni renklerinde sadece renk koyulaflmas› gözlenmifltir. C. parapsilosis kolonileri 24 saatlik inkübasyondan sonra parlak beyaz renkte iken, 48 saatten sonra kirli beyaz ve 72 saatten sonra uçuk pembe renge dönüflmüfltür. C. kefyr 24 saat sonunda oluflturdu¤u kirli beyaz-krem renkli kolonilerinde ilerleyen günlerde de¤ifliklik saptanmam›flt›r.
C. lipolytica, kolonileri 24 saat sonra parlak-pembe iken 48-72 saatten sonra bombeleflmeye, yüzeyi kuru ve tüylümsü görünüm kazanmaya bafllam›fl ve kimi kolonilerin etraf›nda halo gözlenmifltir. C. inconspicua/norvegensis, 24 saat sonra krem-beyaz renkte, yay›k, bombesiz koloniler oluflturmuflken sonraki günlerde kolonilerde renk de¤iflikli¤i olmaks›z›n yüzeyde kuruma, tüylümsü, tebeflir tozu görünüm meydana gelmifltir
Geothrichum capitatum ve Saccharomyces cerevi-siae türleri de 24 saatlik inkübasyondan sonra pembe renkli koloniler oluflturmufllard›r. Saccha-romyces cerevisiae kolonileri küçük, pembe-mor renkte iken Geothrichum capitatum kolonilerinde 48 saatten itibaren pembe-beyaz renk ve burufluk yüzey görünümü hakim olmaya ve koloni çap› genifllemeye bafllam›flt›r.
Dört kan kültürü örne¤inde ikifler maya türü üre-mifltir; kalp-damar cerrahisinde ve beyin cerrahi-sinde yatan hastalara ait olan kan kültürü örnek-lerinde C. parapsilosis+C. tropicalis, reanimasyon-daki hastaya ait örnekte C. albicans+C. parapsi-losis, ve gö¤üs cerrahisindeki hastaya ait örnek-te C. albicans+C. kefyr beraberli¤i saptanm›flt›r.
TARTIfiMA
CHROMagar Candida besiyerinde hem kontrol sufllar› hem de klinik örneklerden izole edilen C. albicans, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis ve C. glabrata sufllar› kolayl›kla identifiye edilmifltir. Pozitif kan kültürü fliflesinden do¤rudan ya da SDA'daki kolonilerinden CAC'a yap›lan ekimler-den sonra oluflan koloni renkleri aras›nda bir fark saptanmam›flt›r (4, 10).
Çeflitli kliniklerden gönderilmifl kan kültürü ör-neklerinden C. parapsilosis (%40) en s›k izole edilen maya olmufltur. Bunu s›ras›yla C. albicans (62 sufl), C. tropicalis (34 sufl) ve C. glabrata (12 sufl) izlemifltir. Gerek klinik örneklerden izole edilen stok sufllar›n, gerekse kan kültürlerinden izole edilen maya sufllar›n›n yaklafl›k %92'den fazlas› CAC ile 24 saatte kolayca tan›mlanm›flt›r. Dolay›s›yla bu dört Candida suflunun h›zl› tan›s› önemlidir (1 3, 7, 11).
Polimikrobiyal üremelerde CAC besiyerinde fark-l› renkte koloniler gözlenmifl ve SDA ilk gün ekim petrisinden birden fazla farkl› koloninin saf kültür izolasyonunun yap›lmas› gerekti¤i konu-sunda özellikle mikoloji laboratuar›n›n yeni yap›-land›r›ld›¤› ünitelerde uyar›c› ve e¤itici olmufltur. Bu nedenle polimikrobiyal üremelerde CAC be-siyerinden identifikasyon zaman ve maliyet aç›-s›ndan avantaj oluflturmaktad›r (11, 12, 13). Di¤er az s›kl›kta izole edilen türlerin (C. kefyr, C. lusitaniae, C. guillermondii, C. lypolitica, C. in-conspicua/norvegensis, Geotrichum capitatum, Saccharomyces cerevisiae) CAC besiyerinde olufl-turduklar› kolonilerinden tan›nmas› kolay olmad›-¤›ndan h›zl› tan› için konvansiyonel yöntemlere ve ayn› zamanda haz›r ticari identifikasyon yön-temlerine baflvurulmufltur (14, 15).
Yo¤un bak›m, yan›k, onkoloji gibi immün siste-mi zay›flam›fl hastalar›n uzun süreli tedavi gör-dü¤ü ünitelerde özellikle ender rastlanan Candi-da türleriyle oluflan epidemilere rastlanmaktad›r (16, 17, 18, 19). CAC besiyerinin kullan›m› en-der rastlanan türlerin varl›¤›n›n h›zla fark›na
var-mam›z› sa¤layacakt›r (20).
Fungemi etkeni Candida türlerinin tan›mlanmas›n-da laboratuvar ifl ak›fl›ntan›mlanmas›n-da germ tüp, m›s›r unu-tween 80 agar, API identifikasyon panelleri s›ra-s› izlendi¤i takdirde, pozitif sinyal veren ve ma-ya hücresi saptanan flifleden ekim ma-yap›lan ilk gün petrisi SDA' da üreyen kolonilerin saf kültür ol-du¤unu varsayarsak, C. albicans sufllar› yaklafl›k olarak en erken 24+24 saat sonra tan›mlanabile-cektir. Albicans d›fl› türlerde ise tür düzeyinde ta-n›mlama sadece konvansiyonel yöntemlerle en er-ken 48-72 saat sonra yap›labilecektir. API kulla-n›m›na baflvuruldu¤u takdirde bu süreye 24 saat-lik bir süre daha eklenebilir. Oysa maya hücresi saptanan pozitif flifleden do¤rudan CAC besiyeri-ne ekim yap›lacak olursa klinik olarak s›kl›kla izole edilen sufllar›n yaklafl›k %90'dan fazlas›, sa-dece SDA petrisinde maya kolonilerin üremesi için gereken süre olan, 24 saat sonra tür düze-yinde tan›mlanabilecektir. Ayr›ca polimikrobiyal üremelerin fark›na varmak daha kolay olacakt›r. Fungemi tan›s›yla yatan hastaya h›zl› sonucun ulaflt›r›lmas›n›n sa¤lanabilece¤i bu ifl ak›fl›nda CAC besiyeri API identifikasyon panellerine gö-re daha fazla kullan›laca¤›ndan laboratuvar mali-yeti de azalacakt›r.
Kan kültürlerinden mayalar›n primer izolasyonu için CHROMagar Candida besiyerinin kullan›m› klinik olarak önemli Candida türlerinin izolasyo-nuna izin vermesi, laboratuvar ifl yükünü ve ma-liyetini düflürmesi ve daha önemlisi klinisyenlere antifungal ajan seçimini h›zla yapt›rarak hasta mortalite ve morbiditesini düflürmesi aç›s›ndan önemlidir.
Kaynaklar
1. Pfaller MA, Jones RN, Doern GV, Sader HS, Hollis RJ, Messer SA. International surveillance of bloodstream infecti-ons due to Candida species: frequency of occurrence and an-tifungal susceptibilities of isolates collected in 1997 in the United States, Canada, and South America for the SENTRY Program. The SENTRY Participant Group. J Clin Microbiol 1998; 36: 1886-1889.
2. Rangel-Frausto MS, Wiblin T, Blumberg HM, Saiman L, Patterson J, Rinaldi M, Pfaller M, Edwards JE Jr, Jarvis W, Dawson J, Wenzel RP. National epidemiology of mycoses
survey (NEMIS): variations in rates of bloodstream infecti-ons due to Candida species in seven surgical intensive care units and six neonatal intensive care units. Clin Infect Dis 1999; 29: 253-258.
3. Odds FC, Bernaerts R. CHROMagar Candida, a new dif-ferential isolation medium for presumptive identification of clinically important Candida species. J Clin Microbiol 1994; 32: 1923-1929.
4. Horvath LL, Hospenthal DR, Murray CK, Dooley DP. Di-rect isolation of Candida spp. from blood cultures on the chromogenic medium CHROMagar Candida: J Clin Microbi-ol 2003; 41: 2629-2632.
5. Louwagie B, Surmont I, Verhaegen J, Odds F. Differen-tial and enrichment media for selective culture and recogni-tion of yeast species from clinical material: Eur J Clin Mic-robiol Infect Dis 1995; 14: 406-411.
6. Pfaller MA, Houston A, Coffmann S. Application of CHROMagar Candida for rapid screening of clinical speci-mens for Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kru-sei, and Candida (Torulopsis) glabrata. J Clin Microbiol 1996; 34: 58-61.
7. Powell HL, Sand CA, Rennie RP. Evaluation of CHRO-Magar Candida for presumptive identification of clinically im-portant Candida species. Diagn Microbiol Infect Dis 1998; 32: 201-204.
8. Cooke VM, Miles RJ, Price RG, Midgley G, Khamri W, Richardson AC. New chromogenic agar medium for the iden-tification of Candida spp. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 3622-3627.
9. Yücesoy M, Marol S. Performance of CHROMAGAR can-dida and BIGGY agar for identification of yeast species. An-nals Clin Microbiol Antimicrobial 2003; 2: 8.
10. Birinci A, Akkurt L, Acuner C, Unlu M, Durupinar B: Rapid identification of the Candida species from direct blood cultures by CHROMagar Candida. J Int Med Res 2004; 32: 484-487.
11. Pulimood S, Ganesan L, Alangaden G, Chandrasekar P.
Polymicrobial candidemia. Diag Microbiol Infect Dis 2002; 44: 353-357.
12. Yera H, Poulain D, Lefebvre A, Camus D, Sendid B. Polymicrobial candidemia revealed by peripheral blood sme-ar and chromogenic medium. J Clin Pathol 2004; 57: 196-198.
13. Houang ETS, Chu KC, Koehler AP, Cheng AFB. Use of CHROMagar Candida for genital specimens in the diag-nostic laboratory. J Clin Pathol 1997; 50: 563-565. 14. Koehler AP, Chu KC, Houang ET, Cheng AF. Simple, reliable, and cost-effective yeast identification scheme for the clinical laboratory. J Clin Microbiol 1999; 37: 422-426. 15. Hospenthal DR, Beckius ML, Floyd KL, Howarth LL, Murray CK. Presumptive identification of Candida species ot-her than C. albicans, C. krusei, and C. tropicalis with the chromogenic medium CHROMagar Candida. Annals Clin Microbiol Antimicrobial 2006; 5: 1-5.
16. Hazen KC. New and emerging yeast pathogens. Clin Microbiol Rev 1995; 8: 462-478
17. Otag F, Kuyucu N, Erturan Z, Sen S, Emekdas G, Su-gita T. An outbreak of Pichia ohmeri infection in the paedi-atric intensive care unit: case reports and review of the li-terature. Mycoses 2005; 48: 265-269.
18. Ersoz G, Otag F, Erturan Z, Aslan G, Kaya A, Emek-das G, Sugita T. An outbreak of DipoEmek-dascus capitatus infec-tion in the ICU: three case reports and review of the litera-ture. Jpn J Infect Dis 2004; 57: 248-252.
19. Taj-Aldeen SJ, Doiphode SH, Han XY. Kodamaea (Pic-hia) ohmeri fungaemia in a premature neonate. J Med Mic-robiol 2006; 55: 237-239.
20. Hospenthal DR, Murray CK, Beckius ML, Green JA, Dooley DP. Persistence of pigment production by yeast iso-lates grown on CHROMagar Candida medium. J Clin Mic-robiol 2002; 40: 4768-4770.
