A. O. Vet. Fak. Derg.
39 (1-2); 238-246. 1992
TERS (REVERSE) PASİF HEMAGLUTİNASYON (RPHA) TESTI ILE İSHALLİ BUZMilLARıN GAİTALARINDA ROTAVİRUSLARlN TESPİTİ
Feray Alkan' Hüseyin Pulat" İbrahim Burgu'
Zafer Yazıcı'
Detectioıı of bo"ine rotavirus in faeces of calves with diarrhea by rcverse passj,'e lıaemaglutination (RPHA) method.
Suınmary: The rotm irlises cause infeetion eharaeterizetl with diarrhea in newbom animals and the}' are widespread all eountries.
In this research, 97 feaees samples obtained from calres with diarrhea were tested for detection of rotaviruses using RPHA test. It is foıınd that 26 (26.8 %) of tested feaees samjJles eonüıirı.ed rotavirus.
This research elso indicaled that RPHA test is simlJle, time -sawing and .imsifiiıe method on detalion of rotavirus.
This is the first iııvest(f{ation of Tchi,h rotaviruses u..ere diagnosed usin/; the RPHA test bı Turkey.
Öze!: Rotaviruslar }'enidoğanlarda ishal ile karakterize bir enfeks!J'o-mm sebehi olup, tüm düı~rada )'o]gındırlar.
Bu ara~lt,.m(l.da, ishalli bu::ağzlardan sağlanan 97 gaita örneği rotavirus )'öniirıden RPHA testi ile kontrol edildi. Test edilen gaita örneklerinden 26
(%
2n.
8)'sında rotavirus varlığı saptandı.Ara,<tırmada, RPHA testinin rotavirus!arın tesbitinde kolo..-yı!ygulanabi-len, kısa zamanda çok sa.'y1damateT)'alin test edilebild(~i ve dUJ'erlı bir )'lintem olrt!l~lI helirlendi.
Bu araştırma, Tiirk(re'de rotavinıs enle/;sivnlarının te>'hisi71deRPIJA t~sliniıı kullanıldığı ilk çalışmadır.
i Dr., A.e. Veleriner Fakültesi" Viraloji Bilim Dalı, Ankara. 2 Dr., A.O. Veteriner Fakültesi., Viroloji Bilim Dalı, Kars. 3 Prof. Dr., .'\.0. Veteriner Fakiilte.i., Viroloji Bilim Dalı, Ankara.
TERS (REVERSE) PAsİF HEMAGLUTINASYON (RPHA)
Giriş
239
Yenidoğanlarda ishalin nedenleri çok çeşitli olup, enfcksiY0z C1:janlar,çevre, beslenme ve hijyenik faktörler hastalığın çıkışında rol oynar. Bunlardan başka parvo-, astro-, caliciviruslar, hovine viral diarrhea (BVDi virusu, Breda ajan ve virus benzeri partiküHer de yenidoğan buzağıların ishal olaylarının diğer ajanlarıdır (1).
Rotaviruslar ilk kez 1943 yılında Light ve ark. tarafından, çocuk-larda görülen bir ishal epidemisinde tesbit edilmişlerdir (13). Mebus ve ark. (17) da ighalli buzağılardan alınan gaitalar ile klostrum almamış buzağılarda deneysel olarak enfeksiyonu oluşturmuşlar ve hastalık etkeninin filtre si<;temlcrinden geçebildiğini saptamışlardır. Daha son-raki yıllarda Mcbus ve ark. (18)'nın Nebraska calf di.arrhea viru~u, Kapikian ve ark. (14) 'nın Norwalk virıısu olarak isimlendirdikleri virusları izole etmeleri ile rotaviruslara ilgili çalışmalar yoğunlaşmış ve nihayet 1974 ydında Flewett ve ark. (8) etkenin morfolojik olarak araba tekerleğine benzemesi nedeniyle bu virusu, latince termino-lojide tekerlek anlamına gelen "rota" kelimesi ile adlandırmışlardır.
Rotavirus enfeksiyonları genellikle genç hayvanlarda görülmek-tedir. Buzağı (16), kuzu (25), tay (1, 9) ve yavru domuzlardan (22) şiddetli ishal salgınlarında izole edilmişlerdir. Kedi (ll) ve köpek
(10) yavrularında da ishal ile karekterize enfeksiyonun nedenidirler. Rotavirusla.rın çoğalma alanı bağırsak kanalıdır ve virus sadece gaita ile saçılmaktadır. Enfekte bir hayvanın gaitası ile 109_1016 par-tiküllgr virus saçıldığı saptanmıştır (15). Hastalığın bulaşması enfekte gaita ilc bulaşık yem ve sular ile oral yoldan olmaktadır. Erişkin hay-vanlar genellikle subklinik enfekte olduklarından, hastalığın sürü içinde yayılmasında önemli roloynarlar.
Rotavirus enfeksiyonu sulu; sarı renkli, bazen nnıkuslu ve nadiren kanlı ishal ile karekterizedir. Hastalığın başlangıcında ateş normalin üstündedir. Daha sonra normale döner. Hayvanda kilo kaybı, tüylerde düzensizlik ve keçeleşme dikkati çeker. Dehidrasyon ve sıvı elektrolit dengesinde bozulmaya bağlı olarak hipovolemik şok ve ölüm şekille-nebilir. E. Coli, salmoneHa, clostridia, criptosporidium, v.s. gibi et-kenler ile kompEkasyon mertalitenin artmasına neden olur i,15).
Virusun başlıca replikasyon alanı ince bağırsaklardaki villus epi-tel hücreleridir. Bununla beraber virus antijeni kalın bağırsaklarda da tesbit edilmiştir. Ölen hayvanların otopsilerinde ise, özellikle
duedo-240 F. ALKAN, H. PULAT, Z. YAZıcı,t. BURGU
numda olmak üzere ince bağırsaklarda ödem ve tonüsitede azalma dikkati çeker. Bazı olaylarda bağırsak mukozasında hemorajik adak-lar görül ür ( 15) .
Rotavirus enfeksiyonlarmm teşhisi genellikle gaitada virusun ya da virus antijeninin varlığının saptanması esasına dayanmaktadır. Bu amaçla elektron mikroskobi (EM) (9, 19, 26), poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) (7), ELİSA (7, 27) ve hücre kültürlerinde im-munfloresan (2,iO) yöntemleri kullanılmaktadır. Son yıllarda rota-vii"uS enfeksiyonlarının teşhisinde kullanılmaya başlanan bir diğer yön-tem ise ters (reverse) pasif hemaglutinasyon (RPHA) testidir.
RPHA testi ilk kez Saneketa ve ark. (23) tarafından insan rota-viruslarının saptanması amacıyla tanımlanmıştır. Daha sonra buzağı (7), at (26) ve kedilerin (I 9) rotaviruslarının tesbiti için de kullanıl-mıştır.
Türkiye'de sığırlarda rotavirus enfeksiyonuna ilgili ilk çalışma Burgu ve Akça (3) tarafından yapılmıştır. Araştırmada (3), sağlıklı sığırların
%
31'inde rotavirus antikoru saptanmıştır. İshalli buzağılar-da rotavirusların araştırılmasına ilgili olarak Yazıcı (27) 'nın yaptığı çalışmada ise, ishalli buzağılardan sağlanan gaitaların ~.~ ITsinde rotavirus antijeninin varlığı ELİsA testi ile saptanmıştır.Bu araştırmada, RPHA testi ile O-I ay yaş grubuna dahil ishalli buzağıların gaitaları rotaviruslar yönünden kontrol edilerek, hem yenidoğanların rotavirus enfeksiyonu oranının, hem de RPHA testi-nin rotavirusların tesbitinde kullanılabilirliğinin araştırılması amaç-lanmıştır.
Materyal ve Metot
Hücre Kültürü: Madin darby hovine kidney (MDBK) ve fötal dana böbrek (FDB) hücre kültürleri kullanıldı. Hücre kültürlerinin üretilmesinde
%
lO dana serumlu Eagle MEM vasatı kullanıldı.Viruslar: RPHA testinin spesifitesi ve sensitivİtesinin kontrol edilmesi amacıyla bovine rotavirus Northern Irland 75/447 suşu ve bovine coronavirus Sı suşu kullanıldı.
Northern Irland 75/447 suşu l\fDBK. coronavirus Sı suşu FDB hücre kültüründe üretildi.
TERS (REVERSE) PAsiF HEMAGLUTlNASYON (RPHA) 2-ıl
Rotavirus Antiserumu: DK rotavirus ve B 223 (Bovine serotip 3) rotavirusa karşı tavşanlardan elde edilerek purifiye edilen ve 5 mg /ml 19 G içeren rotavirus antiserumu kullanıldL
Antiserum Moredun Araştırma Enstitüsü, Edinburg, İngiltere' den sağlandı.
Gaita Örnekleri: Araştırmada, O -1 ay yaş grubunda bulunan ve akut ishal semptomu gösteren 97 buzağıya ait gaita örneği kullanıldı. Materyaller Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dahiliye Klini-ğine tedavi amacıyla getirilen buzağılar ile Tarım ve Köyişleri Ba-kanlığı, Tarım İşletmeleri Genel Müdürlüğüne ba.ğlı İşletmelel'de bulunan buzağılardan sağlandı.
Buzağılardan direkt olarak alınan materyaller kullanılıncaya ka-dar -80°C'de saklandı.
Eritrositlerin Purifiye Antikoı larla Kaplanması: Bu amaçla Sato ve ark. (24) 'nın bildirdiğ'i yöntemden yararlanıldı.
Koyun kanı alsever solusyon u içine alındı. Eritrositler 5 kez PBS ilc yıkandıktan sonra, PBS içinde
%
IO'luk eritrosit süspansiyon u hazırlandı. Daha sonra eritrosit süspansiyon u PBS içinde hazırlanan%
1'lik glutaraldehit solusyonu ile eşit miktarda karıştırıldı. Karışım bir gece +4°C'de fikzasyon için bekletildi. Fikze olan eritrositler 4 kez PBS ile yıkanarak, PBS ile % IO'luk eritrosit süspansiyon u hazır-la.ndı. Bu süspansiyona PBS içinde hazırlanan 50 !Lgrrml tannik asit solusyonundan eşit miktarda ilave edilerek 37°C'de 15' inkube edil-di. Bu sürenin sonunda eritrositler tekrar 5 kez PBS ile yıkanarak, PBS içinde%
IO'luk eritrosit süspansiyonu hazırlandı. Eritrosit süs-pansiyonu PBS iç:nde hazırlanan ve 50 [LgI'/ml 19 G içeren rotavirus antiserumu ile eşit miktarda karıştırıldı ve 1 saat oda ısısında inkubc edildi. İnkubasycn süresi sonunda eritrositler 2 kez test sulandırma sıvısı (% 2 fötal dana serumu ve%
0.2 NaN"2 içeren PBS) ile yı-kandı ve sulandırma sıvısı kullanılarak%
1'lik eritrosit süspansiyon u hazırlandı.Gaita Örneklerinin Hazırlanması: Gaita örnekleri phenol rerl içermeyen PBS ilc 1/5 oranında sulandırılarak, 5000 devirde 30 daki-ka santrifüj edildi. Üst SlVılar alınarak -gaita örneklerinde bulunan ve non-spesifik reaksi.yonların oluşmasına neden olabilecek hemaglu-tininlerin uzaklaştırılması amacıyla - glutaraldehit ile fikze edilmiş koyun eritrositleri ile 37°C'de 30' inkubc edildi. İnkubasyon süresinin
242 F. ALKAN. H. PULAT, Z. YAZıcı,t. BURGU
sonunda eritrositler tüpün dibine çöktü. Üst sıvılar alınarak RPHA testinde kullanıldı.
RPHA Testi: Test Saneketa ve ark. (23)'nın bildirdiği yönteme göre yapıldı.
RPHA testi ıçın hazırlanan gaita örnekleri, test sulandırma sıvısı kullanılarak leg 2 tabanına göre sulandırıldı (1/2, 1/4, ... ,
i
II
28). Bu amaçla, tabIetin ilk ~ırasında bulunan gözlere her gaita örneği i(:in 2 göz kullanılarak 50'şer fllt gaita örneklerinden, diğer gözlere 25'er fllt test sulandırma sıvısından kon uldu. Özel bir pipetI yardımıyla ilk sıradan başlayarak a~ağıdaki gözlere 25'er fllt aktarıl-dı. Daha sonra tabletin tüm gözlerine bovine rotavirus antikoru ilc kaplanmış koyun eritrositlerinin%
i'lik süspansiyonundan 25 fl-lt ilave edilerek, tabletler oda ısısında i saat inkuba5yena bırakıldı. Bu siirenin sonunda gaita örneklerinin hemaglutinasyon de.~erlcri okundu.Test örneklerinin RPHA titresi, hemaglutinasyonun oluştuğu en yüksek sulandırma değeri olarak belirlendi.
Testte kontrol virus olarak bO\. ..ine rotavirus Northern Irland
75/447 suşu ve bovine coronavirus Sı suşu kullanıldı.
Bulgular
İshal semptomu gösteren 97 buzağıdan sağlanan gaita örnekle-rinden 26 (% 26.8)'sında rotavinıs varlığı saptandı (Tablo I). Araş-tırmada Sato ve ark. (24)'nın bildirdikleri gibi l/2 ve daha yüksek sulandırmalarda hemaglutinasyon veren gaita örnekleri rotavimslar bakımından pozitif kabul edildi.
Test örneklerinin RPHA testi titresi, hemaglutinasyonun görül-düğü en yüksek sulandırma basamağı olarak değerlendirildi. Gaita örneklerindeki rotavirusların RPHA titresinin 1/2 - i/128 arasında olduğu belirlendi (Tablo I).
Kontrololarak kullanılan rotavirus 75/41.7 Northern Irland suşu (104•45/0.1 ml) 1/32 titre verdi. Testin spesifitesini kontrol etmek amacıyla kullanılan bovine coronavirus Sı suşu (I 05•5 /0. 1 ml) ise hemaglutinasyon oluşturmadı.
TERS (REVERSE) PAsİF HEMAGLUTINASYON (RPHA) ~43
Tablo 1. RPHA testİ sonuçları.
RP~A '~'esti Test Materyali
i
tıtre.;ı sayısı ---"---<1/2 71 1/~ 10 1/4 1-1/8 2 IflG 2 1/32 7 1/64 1/128 TOPLAM * Pozi tif gai ta saYl51 ** Toplam gaita sayısı.
26*/97**
Rotavirus 75/447 Northern Irland su~u, glutaraldehit ilc fikze olmuş eritrositleri ya da fikze olmu~ ve tannik asitle muamele edil-mi~ eritrositleri hemaglutine etmedi. Rotavirus anti ~erumu ile kap-lanmış eritrositler de virusun yokluğunda aglutine olmadılar.
Tartışma
Rota-, corona-, astro-, caliciviruslar, Breda ajan ve BVD virusu yenidoğan buzağılarda ishal ile karakterize enfeksiyonun sebebidir-ler. Birçok ara~tırmada ishalli buzağılardan rotaviruslann varlığı tes-bit edilmiştir. Murakamİ ve ark. (21), Japonya'da 22 farklı sürüde bulunan 51 ishalli buzağıdan l4'ünde, Crouch ve ark. (6), 121 ishalli buzağının 53'ünde, 1\100n ve ark. (20), 12 ayn sürüde bulunan 18 ishalli buzağınm II'inde ve kontrol edilen sürülerden 6'sında, Ed-wards ve ark. (7), 209 buzağıdan 7Tsinde rotaviruslann varlığını bil-dirmi~lerdir .
Türkiye'de rotavirus enfeksiyonuna ilgili çalı~malar sınırlı sayı-da olup, ishalli buzağılarsayı-dan rotavirusların tesbitine ilgili bir tek ara!i-tırma (27) bulunmaktadır. Yazıcı (27) çalışmasında, ELİSA testi ilc kontrol ettiği 87 gaita örneğinden 13 (% l7)'ünde rotavirus antijeni-nin varlığını saptamı~tır. Bu ara!itırmada ise, O-I ay ya~grubunda bulunan 97 ishalli buzağıdan 26(% 26. 8)'sında rotavirus enfeksiyonu tesbit edilmİ~tir. Rotavirus enfeksiyonlarının te~hisinde RPHA tes-tinde başka, EM, hücre kültüründe IF, PAGE, ve ELİSA yöntemleri de yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmacılar (7,23,26), RPHA
244. F. ALKAN, H. PULAT, Z. YAZıCı, i. BURGU
testının PAGE testi ile benzer duyarlılık gösterirken, EM tekniği ve ELİSA testine oranla yüksek duyarlılığa sahip olduğunu bildirmişler-dir. Saneketa ve ark. (23), 94 çocuğa ait gaitalardan RPHA testi ilc S8'inde, EM tekniği ilc 45'inde rotavirus tesbit etmişlerdir. Edwards ve ark. (7)'nm çalışmalarında ise 209 gaita örneğinden 69'u PAGE ve RPHA testi il<: pozitif sonuç verirken, ELİSA testi ilc sadece 49 gaita örneğinde rotavirus varlığı saptanmıştır. Bu çalışmada gaita örnekleri yalnızca RPHA testi ilc test edilmiş ve rotavirus enfeksiyonu oranı Yazıcı (27)'nin bildirdiğinden oldukça yüksek bulunmuştur. Bu oran muhtemelen RPHA testinin ELİSA testine oranla daha yük-sek duyarlılığa sahip olmasından kaynaklanmakta ve Türkiye'de
1'0-tavirus enfeksiyonu oranının gerçekte Yazıcı (27) 'nın bildirdiğinden daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır. House (12), iki ayrı kay-nağa ait verileri değerlendirerek A.B.D.'de 1970-1976 yılları arasında yenidoğan buzağı ishalleri nedeniyle 9S milyon dolar jyıl ekonomik kayıbın olduğunu ve bu değerin 3.1 ve 8.7 milyon dolar' ının rota-virus enfeksiyonlarından kaynaklandığını bildirmiştir. Bu araştırma-dan elde edilen yenidoğan buzağıların rotavirus enfeksiyonu oranı gözönünde bulundurulduğunda, Türkiye'de de rotaviruslara ilgili ekonomik kayıpların küçümsenemeyecek ölçülerde olduğu açıkca görülmehedir.
Bu araştırmada kullanılan RPHA testi kolay uygulanan, kısa sürede çok sayıda materyalin test edilmesine İrp.kan sağlayan, duyarlı bir yöntcmdir. Crapage ve ark. (5), glutaraldehit ile fikzc edilmiş eritrositlerin uygun koşullarda uzun süre saklanabileceğini bildirmiş-lerdir. Edwards ve ark. (7)'da bir merkez laboratuvarda hazırlanan fikze olmuş eritrositlerin gerektiğinde daha küçük teşhis laboratuvar-ıarına nakledilmesi suretiyle birçc.k merkezde rotavirus enfeksiyonları-nın teşhisinin kolaylıkla yapılabilccfğini belirtmişlerdir. RPHA testi-nİn kullanımını sınırlayan en önemli etken ise, non-spesifik hemaglu-tinasyona neden olan faktörlerdir. Cranage ve ark. (5) bu amaçı" test sulandırma sıvısında deterjanların (Tween 20) ve rotavirus antikoru taşımayan serum ilavesini önermişlcrdir. Bu araştırmada, hem Cra-nage ve ark. (S)'nın önerdikleri gibi sulandırma ~lvISlnda fötal dana serumu kullanılarak ve hem de gaita örneklerinin 1/5'lik sulandırma-ları glutaraldehit ilc fikze edilmiş eritresitler ilc inkubasyona bırakı-larak, nonspesifik reaksiyonlar önlenmiştir.
Bu araştırma sonunda, RPHA testinin kolay uygulanabilen, kısa zamanda çok sayıda materyalin test edilebildiği, duyarlı bir test
oldu-TERS (REVERSE) PAsIF HEMAGLUTTNASYON (RPHA) us
ğu belirlenmiş ve RPHA testi rotavirus enfeksiyonlarının teşhisinde kullanılan diğer yöntemıert" alternatif olarak önerilmiştir. Ayrıca elde edilen veriler, Türkiye'de rotavirus enfeksiyonlarının yüksek oranda bulunduğunu da ortaya koymwitur.
Kaynaklar
I. Bachnıann, P.A. (1984).Viral gaslraenlerilis in calves. Rev. Sei. Teeh. üff. Int. Epiz., 3(4): 819-842.
2. Bamett, B., Spendlove, R.S., Peterson, M.W., Hsu, L.Y,. La Salle, V.A. and Egbert, L.N.(1975).Immwuiflorescent ceU assay of neonatal caif dümhoea virus. Can.Jour. of Comp. Med. 39: 462-465.
3. Burgu, I.ve Akça, Y. (I 983).Sığırlarda rotavirus anıikorlarının dağılımı üzerinde seralaJik
ararlırmalar. A.O. Vet. Fak. Derg. 30 (I): 35-44.
4. Corner, M.E. and Darlington, R.W. (1980). Rolavirus infectioıı in foals. Am. Jour. Vet. Res. 41(10): 1699-1703.
5. Cranage, M.P., Gurner, B.W. and Coombs, R.R.A. (1983).Glulardldehyde
slabilisa-tioıı of antibody linkcd erilroeytes for use in revers~ passive aııd related haemagglutination assays.
Jour. of. Immun. Methods. 64: 7-16.
6. Crouch, F.C. and Acres, D.S. (1984).Prevalance of rotavirus a/ld caroııavirus anligen iıı
the feces of normal cows. Can. J. Comp. Med. 48: 340-342.
7. Edwards, S., Chasey, D., Napthine, P., Banks, J., Hewitt-Taylor, C. and Cra-nage, M.P. (I 987).A comparison of three rapid diagnostic methods.for the deteclion of rotavirus
infection in calves. Vet. Mierobiol. 13: 19-25.
8. newett, J.K, Bryden, A.S., Dawies, H., Woode, G,N •• Bredger, J.C. and De-rick, J.M. (1974).Relatioı! bet:veen viruses from acute gastroenteritis of children and newbom
calves.Laneet, II: 6i-453.
9. newett, J.H., Bryden, A.S. and Dawies, H. (1975).Virus diarrhoea iııfoals and oth~r
animals. Vet. Rec. 96: 447.
10. Fu1ton, R.W., Johnson, C.A., Peanon, N.J. and Woode, G.B. (1987).Isola/ian qf
a rotavirusfrom a newbom dog with diarhea. Am. J. Vet. Res. 42 (5): 841-843.
1I. Hosbmo, Y., Baldwin, C.A. and Scott, F.W. (1981).Isolation and characterisation of
feline rotavirus. J. gen. ViroJ. 64: 313.
12. House, J.A. (1978).Economic impaeı of rotavirus and neonatal disease agent of animals. J.
Am. Vet. Med. Assos. 173: 573-576.
13. Jokhk, K.W. (1985). Virology. Second Edition. Appleton Centry Grofts, ~orwalk, Conneetieut, USA.
14. Kapikian. Z.A. and Chanock, M.R. (1990).Rotaviruses pp: 1353-1404. In: Fic1ds, N.B., Knipe, I'vLD.Virology. Second Edition. Raven Press, New York, USA. 15. Mc Nu1ty, M.S. (19711).Rotavirııses.J. gen. ViroJ. 4.0: I-LLL.
2,16F. ALKAN, H, PULAT, z, YAZıCı, t. BURGU
lG. Mc Nulty, M.S. and Mc Fcrran, J.B., Bryson, D.G., Logan, E.F. and Curran, W.L. (1976). Studies on rotavirus i'ifcction and diarrhoea in .l'o/mg calves. V ct. Rec. 99: 229-230.
17. Mebus, C.A., Underdahl, N.R., Rhoades, M.B. and Twichaus, M.J. (1969).
Ca!! diarrhoea (sclnırs) : Reproduced witlı a vimsfrom afie/d outbriJak. University of I'\ebra~ka
Agricultura! Experiment Station Rescarclı BuHetin. ?\o: 233.
18. Mebus, C.A., Kono, M., Underdahl, N.R., Rhoades, M.B. and Twiehaus, M.J.
(1971). Cell culture propagatiOll of neonatal calf diarrltea (scourJ) virus. Can. V ct. Jour. 12:
69-72.
19. MochlZuk, M. and Makoto, Y. (1987). Detection ofrotıvirures infeces. Jpn. J. Vet. Sci. 49(1): J59-1GO.
20. Moon, H.W., Mc Clurkin, A.W., Isaac:;on, R.E., Polıhnz, J., Skatvel T.S.M., Gillette, K.G. and Haetz, A.L. (I 978). Patlıogeııi:; relationships of rotavirus escherichia
coli and other agents ilimixed iııfectiolZs in calves. J.Am. Vet. Med. Assas. 173: 577-583.
21. Murakanıi, Y., Nısbıoka, N., Hashiguchi, Y. and Kunisayu, C. (1981).
Neutra-lising pattern of anti-bovine rotavirus (Lincoln) serum against ryı?pathie bovilZe rotavirllSes
isola-ted from calves in Japmı. Microbiol. ımmunobiol. 25(10): 1097-1100.
22. Rodger, S.M., Craven, J.A. and Williams, I. (197:;). Demonstration of reovirus -like
J,articıdes ilZintestinal concmls of piglets with diarrhoea. Aust. Vet. Jour. 51: '536.
23. Saneketa, T., Yoshida, Y. and Oda, K. (1979). Deteetion of rotavirusfrom fcces by
re-ı;ersed passive IwenıaglutinatiolZ method ..J. elin. Patlıo!. 32: 9G3.
24. Sato, K., Inaba, Y., Takubıso, S., Mıura, Y., Kaneko, N., Asagı, M. and Ma-twnato, M. (1984.). Detecıion of bovine coro,uıı'irus in fcces by reverseti I,assive
h~l1laggluıin(l-tion. Ardı. of. Viro!. 80: 23-3 ı.
25. Snodgrass, D.R., Smith, W., Gray, E.W. and Herring, J.A. (1976). il rotaviTIIs in
lambs witlı diarrlıce!l. Res. Vet. Sei. 20: 113-114.
26. Takahasbı, T., Goto, M., Imagawa, H., A!nta, H., Hayashı, S. and Ogata, S.
(1988). VirolJgical and serological studies qfrota:'irus htiırtiolZ infoals TaisedilZTace hOTS~rarms.
Res. Bulı' Obihiro. Univ. i (15): 25).-263.
27. Yazıcı, Z. ,(1992). Ru:;ahlC'Tda rotavirus eı!fiksiyonlmnm sf.roeJ,idemiyol1jisi ve EL/SA testi
