T.C.
TRAKYA ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
FİZİK TEDAVİ VE REHABİLİTASYON
ANABİLİM DALI
Tez Yöneticisi Prof. Dr. Ferda ÖZDEMİR
RATLARDA OLUŞTURULAN KIRIK MODELİNDE
ELEKTROMANYETİK ALAN ve LİNEER POLARİZE
POLİKROMATİK IŞIK TEDAVİSİNİN ETKİNLİĞİNİN
RADYOLOJİK ve HİSTOLOJİK YÖNTEMLERLE
İNCELENMESİ ve MANYETİK ALANA MARUZ KALAN
RATLARDA İÇ ORGAN ve BEYİN DOKUSUNDAKİ
HİSTOLOJİK DEĞİŞİMLERİN ARAŞTIRILMASI
(Uzmanlık Tezi)
Dr. Gülşah YAŞA ÖZTÜRK
TEŞEKKÜR
Asistanı olmaktan gurur duyduğum, Anabilim Dalı Başkanımız Sn. Prof. Dr. Ferda Özdemir’e, eğitimime bilgi ve tecrübeleriyle katkılarından dolayı Prof. Dr. Murat Birtane, Doç. Dr. Hakan Tuna, Doç. Dr. Nurettin Taştekin, Doç. Dr. Derya Demirbağ Kabayel’e, tezimdeki emeklerinden dolayı Ç.Ü. Diş Hekimliği Fakültesi’ne, TÜTF Ortopedi ve Travmatoloji, Histoloji ve Embriyoloji, Nükleer Tıp ve Radyoloji Anabilim Dallarına, asistanlık dönemimdeki güzel paylaşımlarından dolayı asistan arkadaşlarıma ve servis çalışanlarımıza teşekkür ederim.
İÇİNDEKİLER
GİRİŞ VE AMAÇ
... ..1GENEL BİLGİLER
... ..3KEMİĞİN OLUŞUMU VE YAPISI ... ..3
KIRIK İYİLEŞMESİ ... ..5
LİNEER POLARİZE POLİKROMATİK IŞIK UYGULAMASI ... 16
MANYETİK ALAN TEDAVİSİ ... 18
GEREÇ VE YÖNTEM
... 22BULGULAR
... 31TARTIŞMA
... 47SONUÇLAR
... 56ÖZET
... 57SUMMARY
... 59KAYNAKLAR
... 61EKLER
SİMGE VE KISALTMALAR
BMP : Kemik morfojenik protein
Ca : Kalsiyum
DYKU : Düşük yoğunlukta kesikli ultrason
ELF-EMF : Extremely low frequency electric and magnetic fields HBO : Hiperbarik oksijen
HE : Hematoksilen eozin
Hz : Hertz
IGF : Insulin-like growth factor
LPPI : Lineer polarize polikromatik ışık MAT : Manyetik alan tedavisi
NSAI : Nonsteroid antienflamatuar
P : Fosfor
PBS : Fosfat buffer solusyonu
PEMAT : Pulse elektromanyetik alan tedavisi PGE2 : Prostaglandin E2
PTH : Parathormon
R1 : Kırık bölgesi kemik mineral yoğunluğu ölçümü değeri TGF-β : Transforming growth factor beta
1
GİRİŞ VE AMAÇ
Kemiğin anatomik bütünlüğünün ve devamlılığının bozulmasına kırık denir. Günümüzde artan trafik ve iş kazalarının yanı sıra, yaşlı nüfusun artması nedeniyle kırıkların sık görülmesi, kırık iyileşmesini önemli bir sağlık problemi haline getirmiştir. Bu konudaki çalışmalar kırık iyileşmesini hızlandırmak üzerine yoğunlaşmaktadır.
Ortopedi kliniklerinde kırık tedavisindeki başlıca hedefler; hastaya bir an evvel gerekli cerrahi veya konservatif müdahalenin yapılması, fizik tedavi ve rehabilitasyon yöntemleri ile ağrısız hale getirilip, mümkün olan en hızlı şekilde kırık iyileşmesine yardımcı olunarak hastanın mobilizasyonunun sağlanmasıdır.
Hastaların konservatif ve cerrahi tedavi sonrasında, normal fonksiyonlarını daha hızlı şekilde kazanmaları amacıyla, günümüzde kemik iyileşmesini hızlandırmak ve komplikasyonları önlemek için birçok uygulama mevcuttur. Bunların arasında; lokal ve sistemik ilaç uygulamaları (kalsiyum, fosfat, kemik morfojenik proteinler, vitamin D, büyüme faktörleri, hormonlar), elektromanyetik alan ile uyarı, hiperbarik oksijen tedavisi ve fiziksel stimülasyon sayılabilir. Bu yöntemlerden biriside son yıllarda uygulama sıklığı artan ve araştırma konusu olan manyetik alan tedavisidir (MAT). MAT, doğal ve hassas bir tedavi şekli olan manyetik alan etkileşimine dayanan, girişimsel olmayan fiziksel tedavi metodudur. Kırık iyileşmesinin tüm fazlarında rol oynadığı ve kırık iyileşmesini hızlandırdığı düşünülmektedir (1-5). Çalışmamızda manyetik alanın kırık iyileşmesinde etkinliğini göstermek amaçlanmıştır. Manyetik alana maruz kalan ratlarda beyin ve iç organlarda (böbrek, karaciğer ve akciğer) oluşabilecek histolojik değişimler de çalışmamızda incelenmiştir.
2
Çalışmamızda kullanılan bir diğer fiziksel ajan, lineer polarize polikromatik ışıktır (LPPI, bioptron). 2500-4000 nmdalga boyunda ultraviyole (UV) içermeyen bir ışıktır. LPPI tedavilerinin, biyostimülasyon özelliği bulunduğu, yara iyileşmesinin tüm fazlarına etkili olduğu, enfeksiyonu engellediği, analjezik etkisi olduğu, immün sistemi aktive ettiği, neovaskülarizasyonu sağlayarak kan dolaşımını düzenlediği, lenf akmını arttırdığı ve metabolizmayı düzenlediği bilimsel olarak kanıtlanmıştır (6). Çalışmamızda, PEMAT ve LPPI uygulamalarının kırık iyileşmesindeki etkilerinin karşılaştırılması amaçlandı.
3
GENEL BİLGİLER
KEMİĞİN OLUŞUMU VE YAPISI
Organizmanın en büyük organlarından biri olan kemik, durağan görünmesine rağmen, metabolik açıdan ömür boyu aktif olan bir dokudur. Vücut için destek oluşturur, hemopoetik sistem ile pelvis, kraniyum, toraks içindeki yapıları korur, eklemler ve kaslara destek ve yapışma yeri sağlar. Kalsiyum (Ca), fosfor (P), magnezyum, sodyum gibi iyonlar için depo vazifesi görür (7).
Kemik doku, sürekli dönüşüm halinde olan, yüksek yapısal stabiliteye sahip, karmaşık bir bağ dokusundan meydana gelir. Kemik insan vücudunun en sert dokularından birisi olup gerilme ve basınca karşı dirençlidir. İskelet sistemini meydana getiren kemikler, kasların mekanik hareketlerini gerçekleştirmelerine olanak sağlar. Kemik, yapısında kemik iliğini barındırır ve hemopoetik sistem içinde rol alır. Histolojik açıdan kemik, büyük kısmı mineralize olmuş olan yoğun ve homojen ekstraselüler matriks ile kemik oluşumu ve yeniden yapılanmasından sorumlu olan kemik hücrelerinden (osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlar) meydana gelir (7).
Kemiğin Organik ve Mineral Bileşimi
Kemiğin mineral kısmı, %70’lik bölümünü oluştururken, organik kısmı, %30’unu oluşturmaktadır. Kemiğin organik bileşimi, hücre ve matriks kısımlarından oluşur. Hücreler; organik bileşimin %2’lik kısmını oluşturur. Bunlar; osteoblastlar, osteositler ve osteoklastlardır. Osteoblastlar, kemik iliğindeki mezenşimden köken alırlar. Osteoklastların
4
rezorbe ettiği kemiğin yerine, haftalar içinde yenisini sentezlerler. Temel işlevi, kemik matriksinin, özellikle kollogen Tip 1’in sentezidir. Kemik matriksini, minerilizasyona hazırlayan önemli bir enzim olan kemik alkalin fosfatazını büyük miktarda sentezlerler. Osteoblastların komşu osteoblastlar ile temaslarını sağlayan sitoplazmik uzantıları vardır. Osteoblast yeni sentezi yapılmış matriks ile sarıldığında, osteosit adını alır. Osteosit, elips şeklindedir. Sayıca en fazla olan kemik hücreleridir. Kemik içinde lakün adı verilen boşluklarda bulunurlar. Lakünler birbirlerine ve kemik yüzeyine, kanalikül denilen ince kanallar aracılığıyla bağlıdır. Bu kapsamlı osteosit-kanalikül bağlantısının hücre metabolitlerinin taşınmasında, hücreler arası iletişimde ve mineral homeostazının düzenlenmesinde yaşamsal rol oynadığına inanılır. Osteoklastlar, büyük, ileri derecede dallanmış, hareketli hücreler olup, 100 kadar çekirdek içerebilirler (8,9). Osteoklastların hücre membranı, kemik yüzeyine bakan çok sayıda kıvrımdan oluşur. Mineralize kemik matriksini rezorbe ederler. Dolaşımdaki kemik iliği hücrelerinden veya monosit-makrofaj yolağındaki, preosteoklastlardan köken aldıkları düşünülmektedir (10,11). Lizozom ve enzimler (asit fosfataz içeren) açısından zengindirler ve kendi membranları ile kemik arasındaki boşluğa bol miktarda proteolitik ve diğer enzimlerini salgılayıp, mineralleri ve kemik matriksinin bir kısmını eritirler, kalan kısımlar ise fagosite edilerek osteoklastların sitoplazmasında metabolize olurlar (8,9).
Kemik matriksi, organik kısmın, %98’lik bölümünü oluşturur. %95’lik kısmını kollajen (özellikle kollajen Tip 1), %5’lik kısmını, kollajen olmayan proteinler (Osteokalsin, osteonektin, kemik proteoglikanı, kemik siyaloproteini, kemik morfojenik proteini, kemik proteolipidi, kemik fosfoprotein) oluşturur(10,11).
Kemiğin mineral bileşimi, kemiğin %70’lik kısmını oluşturur. Bunun %95’i hidroksiapatitten meydana gelir. Kemik apatit karışımı, yüksek konsantrasyonda karbonat, küçük miktarlarda magnezyum, sodyum, potasyum, florid ve klorid içerir(10,11).
Kemiğin Mimari Şekillenmesi
Kemik dokusu, mimari şekillenmesi göz önüne alındığında, kompakt veya spongiyoz yapıda olabilir. Kemik kütlesinin %80’i kortikal kemikten, %20’si trabeküler kemikten oluşur. Kortikal kemik, kemik gövdesinin duvarını oluştururken, trabeküler kemik her iki uçta yoğunlaşmıştır (10).
Kortikal (kompakt) kemik dokusu: Uzun kemiklerin dış tabakasını oluşturur, çok yoğun ve serttir, metabolik hızı yavaştır. Esas fonksiyonel ünitesi, osteon veya haversian
5
sistemidir. Haversian kanallar, kemiği besleyen damar ve sinirleri içerir. Volkmann kanalları olarak adlandırılan lateral dalları, bir osteondan diğerine kan damarlarını taşır. Kortikal kemik remodolizasyonu, periosteal, endosteal ve haversian kanal yüzeyindeki kemik hücreleri tarafından yapılır. Kortikal kemik, eğici, bükücü, torsiyonel kuvvetlere karşı dirençlidir. Kemik korteksinin kalınlığını, periosteum ve endosteum belirler. Periosteum, kemik dokunun beslenebilmesi, büyüyebilmesi ve onarımı için gerekli olan yeni osteoblastları aralıksız sağlar. Bu nedenle kemik cerrahisinde bu yapıların korunmasına dikkat edilir (10).
Kemiğin dış yüzeyinde yoğun fibröz bağ dokusu halinde uzanan periosteumun dış tabakası kollajen lifler ve fibroblastlardan oluşmuştur. Demetler halinde periostal kollajen liflerden oluşan sharpey lifleri, matriks içine girerek periostu kemiğe bağlarlar. Periosteumun iç yüzündeki osteoprogenitör hücreler, kemiğin büyümesi ve onarımında başlıca rolü oynarlar. Uzun kemiklerin meduller kavitesini döşeyen endosteum tabakasında, yaşam boyu kompleks, metabolik ve yapısal aktiviteler gerçekleşir(10).
Trabeküler (spongiyoz) kemik dokusu: Kesişen kavisli tabaka ve tüplerden oluşur. Osteositler, burada konsantrik olarak yerleşmiştir ve kanalikül bağlantıları iyi gelişmiştir. Trabeküler kemik, tipik olarak kemik uç kısmında yerleşir ve mekanik stresi uygun şekilde dağıtır. Trabeküler kemiğin metabolik aktivitesi, kortikal kemikten 8 kat fazladır. Trabeküldeki bir dizi osteoblastlar, yeni kemik birikimi oluştururken, karşı kenardaki osteoklastlar tarafından remodeling sağlanır (10).
KIRIK İYİLEŞMESİ Kırık İyileşmesi Çeşitleri
Kırık kemiğin tamiri, kırık oluştuktan hemen sonra başlar. Kırık iyileşmesi, 2 ana grupta incelenir: Primer kırık iyileşmesi; ayrılmamış ve rijit osteosentez uygulanan kırıklarda görülür. Radyolojik olarak kallus dokusu görülmez. Kırık bölgesindeki nekrozu osteoklastlar rezorbe eder ve yeni kemik doku oluşur. Sekonder kırık iyileşmesi ise, tabii iyileşmedir. Kallus radyolojik olarak gözlenir.
Kırık İyileşmesinin Dönemleri
Kırıkların çoğu intramembranöz ve enkondral kemikleşmenin birleşimi ile onarılırlar. Kaynama sürecinin %10’u enflamasyon, %40’ı tamir ve %70’i yeniden şekillenme sürecidir;
6
1) Yangı (enflamasyon) evresi (1-4 gün): Kemik kırıldığında, endosteum, periost ve çevre yumuşak dokulardaki kan ve lenf damarları parçalanır, dokular arasına kan ve lenf sıvısı ile eksuda birikir, buna kırık hematomu denir. Deneysel çalışmalarda kırık hematomu kaybolursa, kırık iyileşmesinin bozulduğu görülmüştür. Kırık tamirinde, kırık bölgesi hematomu oluşumu ve organizasyonu ilk basamaktır. Kırık uçlarında, 48 saat içinde nekroz sahası gelişir ve nekrotik hücrelere karşı akut enflamatuar yanıt oluşur ve polimorfonükleer lökositler olaya katılırlar. Bu dönemde oluşan yumuşak kallus, osteoid, kıkırdak ve kollajenden oluşmaktadır (9,10) (Şekil 1).
Şekil 1. Enflamasyon evresi görünümü (12)
2) Onarım (reperasyon) evresi (2-40 gün): Kırık hematomu, ilk 48 saat içinde organize olarak tamir dönemini başlatır. Hematomun çevresindeki damarlardan hematom içine fibroblast infiltrasyonu gelişir ve immatür vaskülerize kallus dokusunu oluşturur. Bu dönem, fibröz kallus dönemi adını alır ve ilk 7 günlük süreyi içerir. Fibröz doku, kıkırdak ve olgunlaşmış genç kemik fibrillerinden oluşur. Ortamda yeterli oksijen varsa, kemik gelişimi ve iyileşme olur. Zamanla kıkırdak doku belirginleşir, kıkırdak kallus oluşur. Kalsiyum hidroksiapatit kristallerinin olaya katılmasıyla, sert kallus meydana gelir. Klinik kaynama, kırık uçları stabil ve ağrısızsa gerçekleşir. Radyolojik kaynama, direkt grafide kemik trabeküllerinin görülmesi ve kırık hattında kortikal kemik atlaması olarak değerlendirilir. (9,10) (Şekil 2).
3) Yeniden şekillenme (remodelizasyon) evresi (25-100 gün): Bu dönemde, bir taraftan kemikleşme oluşurken, diğer taraftan osteoklastik faaliyetle rezorbsiyon devam eder. Oluşan kallus, bazı düzenleyici mekanizmaların uyarımı ile yeniden şekillenerek yeni kemik dokuyu oluşturur. Kemiğin yeniden şekillenmesi, uzun ekseni yönünde etkileyen stres
7
kuvvetlerinin ortaya çıkardığı elektromanyetik alan sayesinde olur ve ortalama bir yıl sürer. Bu süre sonunda, kemik iliği ve kemik korteksleri yeniden devamlılık kazanır(9,10) (Şekil 3).
Şekil 2. Reperasyon evresi görünümü (12)
Şekil 3. Remodelizasyon evresi görünümü (12) Kırık İyileşmesini Etkileyen Faktörler
Kırık iyileşmesini etkileyen faktörler, lokal ve sistemik etkenler olarak iki grupta toplanırlar;
Lokal faktörler: Kırık alanındaki etkenler, kırığın iyileşme kalitesini ve süresini etkilerler. Kırık iyileşmesini kötü yönde etkileyen faktörler arasında; kırığın dışarı ile bağlantısı olması, parçalı olması, travma sırasında kemik doku kaybı olması sayılabilir. Spongioz yapıdaki kemiklerin kırıkları, kortikal kemik kırıklarına göre daha kolay kaynar. Kırık uçları birbirinden uzaksa, kaynama gecikmesi veya kaynamama görülebilir. Eklem içi kırıklar, sinovyal sıvının taşıdığı fibrinolizin nedeniyle daha geç kaynarlar. Malign hastalıklar,
8
metabolik hastalıklar (Diabetus mellitus, rikets), radyasyon, kırık iyileşmesini kötü yönde etkiler. Enfeksiyonlar, kırık iyileşmesini geciktirir. Radyoterapi uygulaması hücresel rejenerasyon ve osteojenik kapasitenin azalmasına neden olmakta ve kırık iyileşmesini olumsuz yönde etkilemektedir. Kırık bölgesinin lokal tespiti, kırık tedavisinde önemlidir. Son yıllarda yapılan yayınlarda, yarı rijit tespitin, sınırlı harekete izin verdiği, lokal kan akımını hızlandırdığı, osteoblastik aktiviteyi arttırdığı savunulmaktadır. İyi redükte ve tespit edilmiş kırık kemiklerde ise erkenden fonksiyon ve kontrollü yük verilmesi sağlanıp, kemik gelişimi uyarılarak kırık iyileşmesinde olumlu sonuçların alındığı tespit edilmiştir. Buna neden olarak bölgesel hareket ile prostaglandin E2 (PGE2) miktarının artması, dolaşımın rahatlaması gösterilmektedir (13,14).
Sistemik faktörler: Sistemik faktörler arasında; beslenme, hormonal faktörler, sistemik hastalıklar, ilaçlar, yaş ve alışkanlıklar sayılabilir.
Beslenme: Kırık iyileşmesinde matriks sentezi, hücre migrasyonu ve proliferasyonu, kollajen, proteoglikan ve diğer makromoleküllerin sentezlenmesi için yüksek düzeyde protein ve karbonhidrata ihtiyaç duyulur. Travma ve major cerrahi, immun direnci azaltmakta ve malnutrisyona neden olabilmektedir. Bu hastalarda beslenmeye özen gösterilmelidir. Kemik özellikle büyüme çağında beslenme faktörlerine hassatır. Yetersiz protein alımı sonucunda, osteoblastların kollajen sentezi azalır (15).
Kalsiyum ve D vitamini kırık iyileşmesinde önemli role sahiptir. Ca eksikliği organik kemik matriksinin yetersiz kalsifikasyonuna neden olur. Postmenapoz osteoporotik bayanlarda, kalsiyum tedavisi ile kemik mineral yoğunluğunda (KMY) artış olduğu gösterilmiştir. D vitamini, Ca ve P’un, gastrointesitnal sistemden emilimini arttırır, osteidin olgunlaşmasını ve minerilizasyonunu uyayarak, kemik yapımını stimüle eder. Balık, yumurta, tereyağında yüksek oranda bulunur. D vitamini içermeyen, Ca’un zengin olduğu kültür ortamında, kemik dokunun gerektiği gibi kalsifiye olamadığı görülmüştür. D vitamini yüksek dozda toksiktir ve yumuşak dokuların kalsifikasyonuna neden olur (16).
Sodyum, kalsiyumun böbreklerden atılımını arttırır. Düşük oranda tuz tüketen kişiler, daha az kalsiyum alımına ihtiyaç duyarlar(17).
A vitamini, normal dozda mezanşimal hücre farklılaşmasını uyararak kırık iyileşmesine yardımcı olur. Eksikliğinde, osteoblast regülasyonunda ve osteoklast aktivitesinde bozulma olur ve kemik oluşum aktivitesi azalır. A vitamini fazlalığında ise, kıkırdak kolonlarında erozyon meydana gelir, osteoklastlara dönüşüm fazla uyarılır ve kırık
9
iyileşmesi gecikir (18).
C vitamini, osteoblast ve osteositlerin ürünü olan kollajenin sentezinde rol alır ve iyileşmeyi dolaylı yoldan etkiler. Eksikliğinde kemiğin büyümesi ve onarımı kötü yönde etkilenir(19).
B6 vitamini ve çinko eksikliğinin kırık iyileşmesini yavaşlattığı görülmüştür (20). Fibula kırığı oluşturulan 30 tavşana, 5 gün proflaktik olarak kas içi E vitamini verilmiş, kırık iyileşmesine olumlu etkileri gösterilmiştir. Bu durumun, kırık alanındaki serbest oksijen radikalleri üzerinden, antioksidan etki sonucu olduğu düşünülmüştür (21).
Hormonal faktörler: Parathormon (PTH), paratiroid bezinin esas hücrelerinden salınan bir polipeptiddir. PTH, kemikte osteoklast sayısını yükseltir. Kalsitriol varlığında, kemik rezorbsiyonunu tetikleyip, serum Ca ve P seviyesini arttırır. Osteoblastların sayı ve fonksiyonunu arttırarak kemik formasyonunu arttırır. Osteoblastların üzerine dolaylı etkisi olsada, net sonuç kemik kaybı ve kırık iyileşmesinin yavaşlamasıdır. Düşük dozlarda, trabeküler kemik oluşumunu arttırdığı gözlenmiştir (22).
Kalsitonin, tiroid bezinin parafolliküler hücreleri tarafından salgılanan polipeptid bir hormondur. Plazmadaki Ca ve P düzeylerini düşürür, kemik rezorpsiyonunu azaltır, osteoblastik aktiviteyi arttır. Kalsitonin, PTH’nun antagonistidir. Kompakt ve trabeküler kemik yapımını arttırır. Kalsitonin dozu ile yeni kemik oluşumu arasında korelasyon vardır fakat iyileşmeyi olumlu yönde etkileme mekanizması henüz açıklık kazanmamıştır(23).
Ovaryumdan salgılanan östrojen, kemik rezorbsiyonunu önleyerek kemik kaybını önler. Eksikliğinde, osteoporoz riski artar. Overektomi yapılmış hayvanlarda, kırık iyileşmesinin kötü yönde etkilendiği gösterilmiştir(24,25).
Tiroid hormonu, paratiroid hormonu gibi kemiğin yeniden şekillenmesine yardım eder. Kırık iyileşmesine yardım ettiği ileri sürülmüştür(12). Hipotiroidi tedavisinde verilen, tiroid hormonu, uzun dönem kullanımında osteoporoz ve kırık riskini arttırabilir(26).
Kortikosteroidler, ilacın miktarı ve kullanım süresine de bağlı olarak, kırık iyileşmesini yavaşlatırlar. Mezanşimal hücrelerden osteoblast gelişimi ve matriks oluşumu için gerekli yapı taşlarının sentezini yavaşlattıklarından dolayı, kırık iyileşmesini geciktirip, kallus oluşumunu azaltırlar. Prednizolon uygulaması gereken hastalara, sigarayı bırakması, Ca ve D vitamini alması önerilir (26). Kortikosteroidler, fibroblast kaynaklı büyüme faktörü ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü üzerine antagonist etki yaparlar(27).
İnsülin ve büyüme hormonu gibi anabolizan hormonlar kırık iyileşmesini hızlandırmaktadır. Büyüme hormonu ve diğer anabolizan hormonlar, proteine bağlı Ca artışını
10
etkileyerek kırık iyileşmesine yardımcı olurlar. Büyüme hormonu, hipofiz ön lobundan sentezlenir ve kallus hacminde artışa sebep olur. Kırık iyileşmesini hızlandırdığı klinik çalışmalarda gösterilmiştir(28,29).
Sistemik hastalıklar: Diyabet, anemi, tüberküloz, raşitizm gibi hastalıklar ve beslenme bozukluklarına neden olan nontropikal sprue gibi gastrointestinal hastalıklar, kırık iyileşmesini geciktirir. Diyabette, osteoblast aktivasyonundan sorumlu faktörlerin salgılanmasının azalması ve buna bağlı olarak kemik iyileşmesinin bozulmasının etken olduğu ileri sürülmüştür. İltihabi olaylar da (tüberküloz, kronik hastalıklar), hiperemi nedeniyle, Ca tuzlarının çözünmesini etkiler. Artan lökositlerin proteolitik enzimleri, matriksin bozulmasına neden olur ve osteoid oluşumunu engeller(30).
Osteopetrosis, rikets, osteomalasia, Paget’s hastalığı, osteogenesis imperfekta, Gaucher hastalığı gibi iskelet sistemini tutan hastalıklar da kırık iyileşmesini olumsuz yönde etkilemektedir (26).
İlaçlar: Kondroitin sülfat ve hiyalüronidaz, kırık iyileşmesine olumlu yönde etki ederler. Deneysel çalışmalarda, L-Dopa ve klonidinin büyüme hormonunu arttırarak, kırık iyileşmesini olumlu yönde etkilediği gösterilmiştir (31,32). İndometazinin, yüksek dozlarda kırık iyileşmesini durdurduğu bilinmektedir (30,32). Uzun süre kortikosteroid kullanımını gerektiren, romatoid artrit gibi romatizmal eklem hastalıkları, otoimmun deri hastalıkları, cushing sendromu, sistemik lupus eritematozus gibi durumlarda da kırık iyileşmesi olumsuz yönde etkilenmektedir(33).
Yapılan bazı çalışmalar, NSAI’ların, kırık iyileşmesini yavaşlattığını göstermektedir. NSAI’ların, prostaglandinlerin osteoblastik aktiviteyi arttırıcı etkisini önleyerek kırık iyileşmesini geciktirdiği düşünülmektedir (34).
Yapılan çalışmalarda, heparinin kırık iyileşmesi üzerine olumsuz etkiler gösterdiği tespit edilmiştir. Heparinin osteoblast yapımını azaltıp, osteoklastları arttırmasının bu etkiye neden olduğu düşünülmektedir (35). Simvastatinin kırık kaynaması üzerine olumlu etkileri gösterilmiştir (36). Kinolon grubu antibiyotikler, gentamisinin de kırık iyileşmesini engellediğine dair yayınlar mevcuttur (37). Nitrik oksit ile yapılan bir çalışmada, kemik iyileşmesinde radyolojik ve histolojik olarak iyi sonuçlar gösterilmiştir (38). Kolşisinin, kaynamayı kötü etkilediği ve kemik direncini azalttığı gösterilmiştir(39).
Yaş: Küçük yaşlarda, mezanşimal hücre farklılaşması, yeni kemik dokusu gelişimi ve kırığın yeniden şekillenmesi hızlıdır. Bu durum, ileri derecedeki deformitelerin düzeltilmesine
11
olanak sağlar. Yaşın ilerlemesi ile beraber, osteoblastların aktivitelerinde yavaşlama meydana gelmektedir. İleri yaştaki hastalar, kemiklerde spontan kırık oluşması ve kırık iyileşmesindeki güçlükler nedeni ile risk altındadırlar (40-42).
Alışkanlıklar: Klinik çalışmalar, sigara içmenin kırık iyileşmesini inhibe ettiğini göstermiştir. Tibial osteotomi uygulanan tavşanlarda, nikotin verilen grupta kontrol grubuna göre kırık iyileşmesinin geciktiği gösterilmiştir. Kemik grefti uygulanan tavşanlarda, nikotinin otojen kemik greftinin vasküleritesini inhibe ettiği gösterilmiştir(43).
Kronik alkol kullanımının kemik yapımını azalttığı, etanolun osteoblast aktivitesini inhibe ettiği bilinmektedir(44).
Kırık İyileşmesini Hızlandırmak Amaçlı Yapılan Tedaviler
Kırık iyileşmesini iyi ve kötü yönde etkileyen sistemik ve lokal etkenler değerlendirilerek iyileşmeyi hızlandırmak, hastanın günlük yaşam aktivitelerine erken dönemde kavuşmasını sağlamak amacı ile birçok tedavi yöntemi uygulanmaktadır. Bu yöntemler, ilaç tedavileri ve fiziksel tedaviler olarak iki grupta sınıflandırılabilirler.
İlaç uygulamaları: Kırık iyileşmesini hızlandırmak amacı ile birçok ilaç kullanılmaktadır.
Büyüme faktörleri: Yapılan araştırmalar, bazı büyüme faktörlerinin kırık iyileşmesini arttırdığını göstermiştir. Büyüme faktörleri, dokulara özgü polipeptidler olup, hedef hücrelerin yüzeylerindeki reseptörlere bağlanarak etki ederler. Hücresel farklılaşma, çoğalma ve protein sentezinde rol alırlar. Dönüştürücü büyüme faktörü-beta (TGF-β), trombosit kaynaklı büyüme faktörü, fibroblast büyüme faktörü, kemik morfojenik proteini (BMP), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), makrofaj kaynaklı büyüme faktörü üzerine çalışmalar yapılmıştır (45).
Dönüştürücü büyüme faktörü-beta, kondrosit ve osteoblastlarda sentezlenir ve enkondral kemikleşme esnasında hücre dışı matrikste birikir. TGF-β, trombosit reseptörleri aracılığı ile kırık bölgesindeki hematom içerisine salınır. İntegrin reseptörünü hücrede uyararak, kollajen, fibronektin ve proteoglikan oluşumunu arttırır. Bağ dokusunda hasara yol açan proteolitik enzimleri inhibe eder. Osteoblastların sayısı ve aktivitesini arttırarak intramembranöz kemikleşmeyi arttırır. Tibia fraktürü oluşturulan ratlara, lokal TGF-β enjeksiyonu uygulanmış ve sonuçta kırık hattında doza bağımlı olarak kallus dokusunda artış olduğu görülmüştür (45).
12
Trombosit kaynaklı büyüme faktörü, iki adet polipeptide sahip bir dimerdir. Fibroblast ve kemik hücreleri için mitojeniktir. Trombositler, makrofajlar, monositler ve endotel hücreleri tarafından sentezlenir. Kan dolaşımında ve kırık sahasında da bulunmaktadır. Kollajen sentezini arttırır. Fibroblast çoğalmasını, mezanşimal hücre mitozunu, monosit ve makrofajların kırık bölgesine göçünü arttırır. Nash ve ark.(46) tibial osteotomi uyguladıkları tavşanların, 4 hafta boyunca kırık bölgesine 80 mikrogram PDGF enjeksiyonu uygulamışlar ve radyografik, mekanik ve histopatolojik olarak kırık iyileşmesi üzerine olumlu etkisini göstermişlerdir.
Fibroblast kaynaklı büyüme faktörü, kıkırdak ve fibroblastlar için mitojeniktir. Kıkırdak oluşumu aşamasında kallusu genişletir. Kırık iyileşmesinin vaskularizasyon fazında etkinlik gösterir. Wei-Jia ve ark. (47) metafizyel fraktür oluşturulan tavşanlarda, FGF-2’nin yerel uygulaması ile iyileşme üzerine olumlu etkilerini göstermişlerdir.
Kemik morfojenik proteini, osteojenik aktivitesi olan proteinlerdir. Mezanşimal hücrelerin kıkırdak ve kemik hücrelerine farklılaşmasına, ektopik kemik uyarımının artmasına neden olduğu düşünülmektedir. Hayvan kaynaklı kemik greftleri elde edilirken, BMP’lerin etkinliğinin kaybolmaması için özel işlemler geliştirilmiştir. Kloen ve ark. (48) yaptıkları çalışma ile BMP’nin kırık iyileşmesinde kallus üzerine olumlu etkilerini göstermişlerdir.
İnsülin benzeri büyüme faktörü, büyüme hormonuna cevap olarak salınır. Özellikle kortikal kemik oluşumunu ve kemik matriksi sentezini tetikler. Trippel (49) yaptığı çalışmada, IGF’nin kondrosit ve osteoblast tarafından matriks sentezini teşvik ettiğini ve kallus oluşumuna katkı sağladığını göstermiştir.
Makrofaj kaynaklı büyüme faktörü, sıçanlarda, kondrositler ve osteoblastlar için mitojenik olduğu gösterilmiştir (45).
Kalsiyum sülfat dihidrat ve hidroksiapatit: Ortopedide, kemik defektlerinin tamirinde, otogreftlere alternatif olarak değişik biyomalzemeler tercih edilmektedir. Bunlardan benzer osteokonduktif etkiye sahiptir. Kalsiyum sülfat dihidrat (KSD) ve mercan kaynaklı hidroksiapatit (MKH), yıllardır ortopedi literatüründe yer almaktadır. Tıbbi amaçla kullanılan kalsiyum sülfat, rezorbe olabilecek hale getirilmiş formda, kemik greftlerinin içerisine karıştırılarak kemik rejenerasyonunda rol alır. Göğüş ve ark. (50) 48 adet sıçan üzerinde yaptıkları çalışmada, tibia metafizlerine açtıkları defektleri, KSD ve MKH ile doldurmuş, iki grup arası istatiksel olarak anlamlı fark bulamamışlardır. KSD ve MKH gruplarında, kemik iyileşmesinin kontrol grubuna göre daha iyi olduğunu göstermişlerdir. KSD'nin,
13
osteokondüktif etkisi ile yeni gelişen damar tomurcuklarına ve osteoblastlara zemin hazırlayıp, kemik iyileşmesini sağladığı yönünde yayınlar bulunmaktadır.
Kalsiyum ve D vitamini: Ca ve D vitamini kırık iyileşmesinde önemli role sahiptir. Ca eksikliği, organik kemik matriksinin yetersiz kalsifikasyonuna neden olur ve iyi bir kırık iyileşmesi sağlanamaz. Ca’un, gastrointestinal sistemden emilimi için D vitamini gereklidir. Balık, yumurta, tereyağında yüksek oranda bulunur. D vitamini olmadığı, Ca’dan zengin kültür ortamında, kemik dokusu iyi düzeyde kalsifiye olmadığı gösterilmiştir. Postmenapozal osteoporotik bayanlarda, Ca tedavisi ile KMY’de artış olduğu birçok çalışmayla gösterilmiştir. Antikonvulsan ilaç kullanan 50 epilepsi hastasında yapılan çalışmada, osteomalazi görülmüş ve D vitamini tedavisi ile iyi sonuçlar alınmıştır (51). Kalça kırığı geçiren hastaların, ikinci bir kalça kırığı geçirme riski yüksek olup, kırıkların engellenmesi için minimum etkin doz Ca ve D vitamini kullanımı önerilmektedir. D vitamini yüksek dozda toksik olup, yumuşak dokuların kalsifikasyonuna neden olabilir (52).
Diğer tedaviler: Kırık iyileşmesi konusunda birçok ajan üzerinde, çok sayıda çalışma yapılmakta olup, bunlar arasında; gen terapileri, sistemik çinko tedavisi, sistemik kalsitonin, alendronat ve östrojen tedavileri bulunmaktadır.
Fiziksel Tedaviler
Kırık iyileşmesini hızlandırmak amacıyla birçok fiziksel ajan kullanılmaktadır. Bunlar arasında; egzersiz ve mekanik stimulasyon, hiperbarik oksijen tedavisi (HBO), ekstrakorporal şok dalgası tedavisi, elektrik akımı tedavisi, düşük yoğunlukta ultrason (US), düşük enerjide lazer, LPPI ve PEMAT uygulamaları bulunmaktadır:
Egzersiz ve mekanik stimulasyon: İyi redükte ve tespit edilmiş kırık kemiklere erken dönemde, fonksiyon ve kontrollü yük verilirse, kemik gelişimi uyarılarak iyileşme üzerine olumlu sonuçlar alınmaktadır. Egzersiz esnasında, PGE2 miktarının artması ve dolaşımın rahatlamasının bu durumda etkisi olduğu düşünülmektedir. Kemik dokusu üzerine yük uygulandığı zaman, elektrik potansiyelinde artış meydana gelmekte ve bu etki piezoelektrik etki olarak adlandırılmaktadır. Piezoelektrik etki, kemik yapımı ve yıkımı için düzenleyici rol oynamaktadır ve Wolf kanunlarındaki “Kemik üzerine gelen yüklere ve fonksiyona göre yeniden şekillenir” ifadesine açıklık getirmektedir. Kemik kütlesini arttırmak amacıyla yapılan yükleyici egzersizlerde, yükün günlük yaşam aktivitelerine göre daha fazla olması
14
gerekmektedir. Egzersiz sırasında iskelet sisteminde oluşan gerilim, osteojenik cevaba neden olmaktadır (53). Çesitli hayvan deneylerinde, kemikler üzerinde mekanik yük oluşturan egzersizlerin, kemik yapımını uyardığı ve KMY’yi arttırdığı gösterilmiştir. Yüksek aktiviteli spor yapanlarda (hentbol, tenis, basketbol, voleybol, karate, jogging ve futbol) KMY’nin, düşük aktiviteli spor yapanlara (aerobik, dans) göre daha fazla olduğu gösterilmiştir (54).
Kırık bölgesine uygulanan sınırlı hareketlerin, iyileşme üzerine iyi etkilerinin izlenmesi üzerine, kırık tespitinde rijit veya yarı rijit sabitleme tartışılmaya başlanmıştır. Kırık bölgesine rijit fiksasyon uygulandığında, kırık parçaları primer iyileşme ile temasta bulunurlar ve kırık sahasına osteoblast göçü olur. Periosteal ve endoesteal alanlarda yeni kemik oluşur. Kenwright ve ark. (55) 82 tibia kırığı olan hastanın, eksternal fiksatörlerinin üzerine, aksiyal hareket siklusu sağlama amacı ile bir pompa yerleştirmişlerdir. Bu tedavinin, kırık iyileşme süresini %30 oranında kısalttığını bildirmişlerdir.
Hiperbarik oksijen tedavisi: Dekompresyon hastalığı (vurgun) tedavisinde sıkça başvurulan bu tedavi, hava ve gaz embolisi, karbonmonoksit zehirlenmesi, gazlı gangren, yumuşak dokunun nekrotizan enfeksiyonları, crush yaralanmaları, kompartman sendromu ve diğer akut travmatik iskemiler, diabetik hastalarda sıkça görülen yara iyileşmesinin geciktiği durumlarda ve özellikli uzamış kırık iyileşmesinde de kullanılmaktadır. HBO, tamamen kapalı bir basınç odasında, 1 atmosferden (1 ATA= 760 mmHg) daha yüksek basınç altında, hastanın maske veya başlıkla, aralıklı olarak %100 oksijen solumasıdır (56).
Yara bölgesinde parsiyel oksijen basıncı, 5-15 mmHg’ya kadar düşebilir. Yara iyileşmesi için gerekli olan kollajenin, fibroblastlarca sentezlenebilmesi için en az 30-40 mmHg parsiyel oksijen basıncı gereklidir. HBO ile doku oksijen parsiyel basıncının arttırılması, fibroblastik aktivite artışına ve kollajen matriks birikimine yol açar. HBO sensları dışında, rölatif hipoksi de angiogenezisi uyarır. HBO, kemik dokusunda hipoksiyi düzeltip, osteogenezisi uyararak kemikte remodelizasyonu sağlar. Hücresel aktiviteyi ve protein sentezini arttırır, yaralanmış dokuda yeniden damarlanmayı sağlar. HBO tedavisi, birçok çalışma ile de desteklenmiş olarak kırık tedavisinde kabul gören bir yöntemdir. Bir HBO seansı, olguya göre değişmekle birlikte, genellikle 2,4-2,8 ATA’da, 90-120 dakika uygulanır. Toplam seans sayısı hastalığa göre değişmektedir(56).
Ekstrakorporal şok dalgası tedavisi: ESWT, yüksek amplitüdlü ses dalgalarının vücudun istenen bölgesine odaklanması esasına dayalı tedavi şeklidir. ESWT temel olarak ürolojide, üriner sistem kalsifikasyonlarının parçalanması amaçlı kullanılmaktadır. Plantar
15
fasiit ve kalsifik tendinit gibi bazı yumuşak doku bozuklukları tedavisinde sıkça tercih edilmektedir(57).
Haupt ve ark.(58) fareler üzerinde çalışmışlar, ESWT’nin kırık iyileşmesi üzerinde etkili olduğunu göstermişlerdir. Uslu ve ark. (59), osteotomi hattına ESWT uygulanan tavşanlarda daha fazla kallus oluştuğunu tespit etmişlerdir.Kırık iyileşmesinde olumlu etkileri birçok çalışma ile gösterilsede, ESWT’nin, kırık iyileşmesindeki faydaları tartışmalıdır. Emboli gibi ölümcül komplikasyonlar yaratabilecek riskli bir uygulamadır.
Elektrik akımı tedavisi: Kemiğin, kollajen liflerden kaynaklanan piezoelektrik özelliği bulunmaktadır. Kırığın konkav kısmı, negatif elektrik yükü ile yüklü olup, kallus dokusu ilk olarak burada oluşur. Konveks kısmı, negatif yüklü olup, bu tarafta osteoliz olmaktadır. Elektrik stimülasyonu, kemik matriksinde proteoglikan sentezini, matrikste kalsifikasyonu ve osteoblast sentezini stimüle eder ve hızlandırır. Bu amaçla alçak ve orta frekanslı akımlar kullanılmaktadır. Günümüzde yüksek yoğunlukta elektrik stimülasyonu, kasları güçlendirmek için tercih edilirken, düşük yoğunlukta elektrik stimülasyonu, analjezi sağlar ve kırık iyileşmesinde Amerikan Yiyecek ve İlaç Düzenleme Kuruluonayı almıştır. Alçak frekanslı akımlar kırık sonrası gelişen ağrıyı kontrol etmede kullanılır ve aneljezik ihtiyacını azaltır. Rehabilitasyon sürecinde ağrıyı azaltıp, hastanın hareket potansiyelini arttırarak, egzersizlerini daha rahat yapmasını sağlar (60).
Düşük yoğunlukta ultrason uygulaması (DYKU) : Ultrason, akustik dalgalar halinde dokuların içine iletilen, yüksek frekansta ses dalgasıdır. Tıpta tanı ve tedavi amacıyla kullanılmaktadır. US enerjisinin piezoelektriksel ve fiziksel etkileri, dokularda hücresel düzeyde yanıt ortaya çıkarır. Eklem, kemik ve eklem kapsülüne etkir. Son yıllarda ultrason'un kemik iyileşmesindeki etkileri araştırmalara sıkça konu olmaktadır. Birçok klinik çalışmada ultrason uygulamasının kırık iyileşmesini olumlu yönde etkilediği gösterilmiştir (61). Yapılan bir çalışmada, Grade 1 kapalı ve açık kırıklarda, 1 MHz, 30 mW/cm2 pulse US uygulanmış ve kırık iyileşmesini hızlandırdığı gösterilmiştir (62). Kırık iyileşmesinde düşük dozda US, günümüzde uygulanmaktadır. Nontermal etkisi ile protein sentezini ve yara iyileşmesini arttırdığı düşünülmektedir. Erdoğan ve ark. (63) tavşanlarda oluşturdukları mandibula kırığında,1,5 megahertz frekansında, 200 mikro saniye aralıklı kesikli tipte, 30 miliwatt/cm, 20 seans, 20 dakika/gün, DYKU uygulamış ve biyomekanik, histolojik, histomorfometrik ve radyodansitometrik bulgular ile DYKU’nun kırık iyileşmesi üzerine olumlu etkilerini göstermişlerdir.
16
Düşük enerjide lazer uygulaması: Avrupa ve Asya’da 1960’lardan beri ağrı kontrolünde bazı nöropatik, enflamatuar ve yumuşak doku hastalıklarında kullanılmıştır. Laboratuar çalışmalarında, kollajen üretimini ve DNA sentezini arttırdığı gösterilse de, insan çalışmaları sınırlıdır. Kemik iyileşmesi üzerine etkisi son yıllarda araştırma konusu olmuştur. Bu amaç için genelde Helyum-Neon (He-Ne) lazerler kullanılmaktadır. Kırık iyileşmesinde kullanılan dozlar, 0,03 ile 4 joule arasındadır. Trelles ve Mayayo (64) kırık bölgesine düşük enerjide lazer uygulamışlar ve kontrol grubuna göre, lazer uygulanan grupta damarlanma ve kallus oluşumunun daha hızlı olduğunu saptamışlardır.
LİNEER POLARİZE POLİKROMATİK IŞIK UYGULAMASI
Lazer benzeri bir ışın olan LPPI, son yıllarda tıp alanında popülaritesi artan bir uygulama olup, geçmişteki araştırmalarda kırık iyileşmesine etkisine dair net bilgilere rastlanmamaktadır.
İsviçreli bilim adamları, 1980li yıllarda düşük güçlü lazer sistemlerinin etkinliğine sahip yeni bir ışınla çalışmalar yapmışlardır. UV ışınlarını içermeyen, düşük enerjili, koherent olmayan, polikromatik özellikteki bu ışınlara LPPI denilmektedir (65). LPPI tedavisi ilk olarak, 1981 yılında kronik ve inatçı yaralarla, dermal ülserler üzerinde denenmiş ve başarılı sonuçlar bildirilmiştir.
Lineer Polarize Polikromatik Işığın Özellikleri
Lineer polarize polikromatik ışık, 380-4000 nm dalga boyunda, UV içermeyen, sarı renkte bir ışık demetidir. Isı oluşturmaksızın etkisini gösteririr. 10-40 mm derine penetre olabilir. Elektromanyetik spektrumu radyasyon içermez (66). LPPI’nın genel özellikleri (Tablo 1) :
1- Lineer polarizasyon: Işık dalgaları birbirleriyle paralel olarak tek yönde ve aynı düzlemde ilerler (tek düzlemde titreşme). Brewster aynaları denilen ayna düzlemleri ile optik filtreler yardımıyla elde edilir. %95 polarizasyon derecesine sahiptir. Bu özelliği ile hücrelerde biostimülasyon yaratır.
2- Polikromatizm: LPPI, görünen ışınların spektrumu ile (400-780 nm) bir miktar infraruj radyasyonundan oluşmuştur (780-3400 nm). LPPI’nın elektromanyetik spektrumu radyasyon içermez. Bu ışınların amplitüdleri ve ortamda yol alışları senkronize değildir.
3- Koherensizlik (Incoherency): Renklere ait ışınlar düzen içinde olmakla beraber dalgaların fazları uyumsuzdur.
17
4- Düşük enerji: LPPI, bu özelliği ile organizmada pozitif yönde çeşitli biostimülan etkilere neden olur (65,67).
Tablo 1. Lineer polarize polikromatik ışığın özellikleri (6)
Çalışmalar Işığında Lineer Polarize Polikromatik Işık Uygulamasının Bilinen Etkileri
Hücre zarı aktivitesini, fagositoz yetisini, lenfatik sistem aktivitesini, DNA ve RNA yapımını arttırır. Sitokinler üzerinden, antienflamatuar ve proenflamatuar etki gösterir. LPPI tedavilerinin, biyostimülasyon özelliği bulunduğu, doku iyileşmesinin tüm fazlarına etkili olduğu, enfeksiyonu engellediği, aneljezik etkisi olduğu, immün sistemi aktive ettiği, neovaskülarizasyon sağlayarak kan dolaşımını düzenlediği, lenf akımını arttırdığı ve metabolizmayı düzenlediği bilimsel olarak kanıtlanmıştır. Oymak ve Özdemir (68), Evre 2 ve 3 bası yarası olan hastalara, LPPI tedavisi uygulamışlar, geniş yaralarda daha kısa sürede iyileşme sağladığını tespit etmişlerdir. Ünalan ve ark. (69) tavşanlarda aşil tendonunda kesi oluşturmuş ve yara kapandıktan sonra bölgeye 400-2000 nm'lik bioptron ile, günde 2 seans, 15 gün süreyle tedavi uygulamışlar, 2. haftanın sonunda kontrol ve bioptron grupları arasında yapılan histopatolojik karşılaştırmada, bioptron gurubunda yeni bağ dokusu gelişimi, yeni damarlanma, granulasyon dokusu ve fibrozis gelişimini anlamlı olarak fazla bulmuşlardır. Dökmeci ve ark. (70) ratlarda adjuvan artrit oluşturarak ratları 4 tedavi grubuna ayırmışlardır. 1. grup kontrol grubunu oluştururken, 2. grup diklofenak (1mg/kg), 3. grup bioptron (480-2000nm, 3dak/gün) ve 4. grup ise diklofenak+bioptron tedavisine alınmıştır. Bioptron ve diklofenak tedavisinin birlikte uygulandığı grupta ödemin daha fazla azaldığı belirtilmiştir. Çetinkaya Öneş ve ark.(71) diz osteoartiti tanısı almış 20 hastaya LPPI ve US, 20 hastaya sadece US uygulamışlar, LPPI ve US alan grupta %80 iyileşme bulurken, sadece US alan
Günlük tedavi süresi 3-6 dakika
Dalga boyu 500-2500 nm
Polarizasyon derecesi %95’ten fazla 10cm uzaklıkta ışık
yoğunluğu
40 w/mm2
Dakikada ışık enerjisi 1,3 joule/cm2
Deri penetrasyonu 1-2cm
18
grupta %55 iyileşme tespit etmişlerdir. Özdemir ve ark. (6)LPPI tedavisinin fizik tedavi ve diğer tıp alanlarında etkinliğini değerlendirdiği derlemelerinde, dokuya uygulan LPPI’nin, biostimülan süreci başlattığını ve vücudun rejenerasyon sürecini doğal yollarla desteklediğini belirtmişlerdir.
Lineer Polarize Polikromatik Işık Uygulamasının Endikasyonları
İyileşmesi gecikmiş yaralar, epitel bozuklukları, venöz ülserler, varisler, bası yaraları, fistüller, diabete bağlı gangren, yanıklar, deri transplantasyonu öncesi hazırlık, sinüzit, kırık iyileşmesi, akne romatolojik ve ortopedik hastalıklardan her türlü strainler, kas spazmları (miyofibrozis, fibrozitis, akut tortikollis), tenosinovitler, psöriatik artrit, humeroskapular sendromlar, spor travmalarında kullanılabilmektedir(72,73).
Lineer Polarize Polikromatik Işığın Kontrendikasyonları
Lineer Polarize Polikromatik Işığın bilinen herhangi bir yan etkisi yoktur. Akut dönemdeki cerrahi yaralarda, yağ dokusunda kurumaya yol açarak nekroz oluşturulabileceği bildirilmiştir. Kalp pili olan hastalarda kullanımı önerilmez (69,72).
Güvenli, kolay uygulanabilir bir tedavi yöntemi olmasına rağmen, pratikte enerji dozunun ayarlanması ve uygulama süresinin belirlenmesi konularında ortak bir protokol geliştirilememiştir(6).
MANYETİK ALAN TEDAVİSİ
Nesne ve canlıların etrafındaki görünmez akışa ‘manyetik alan’ denilir. İlk olarak, eski Yunanlılar, MÖ 800’lü yıllarda manyetik demir parçacıklarının çekim özelliğini farketmişlerdir. 16. yüzyılda İsviçreli hekim Paracelcius’un, mıknatısın yara iyileşmesi üzerine olumlu etkilerini bildirmesi ile manyetik alan bilimsel araştırma konusu haline gelmiştir(74). 18. yüzyılda Franz Mesmer, nesne ve canlıların içinde görünmez bir akışı ilk olarak belirtmiştir. Buna magnetizma adını vermiştir. Mesmer’e göre akışın bozulması hastalıkların ortaya çıkmasına neden olmaktadır(75).
Manyetik alan tedavisi, uzayda manyetik alan olmadığı ve vücudun buna gereksinimi olduğu için, öncelikle astronatlar üzerinde kullanılmıştır. Daha sonra insanlar üzerinde yapılan klinik deneyler sonucu, tıpta rutin kullanıma girmeye başlamış ve bunun için düzenekler oluşturulmuştur. Sonraki dönemlerde, Avrupa ülkelerinde farklı dalga boylarında kullanılan MAT sistemleri geliştirilmiştir. Günümüzde her endikasyon için farklı frekans ve güç uygulamaları belirlenmiştir.
19
Pulse manyetik alan cihazı; enerji girişi, kapasitör, açma-kapama düğmesi ve bobin stimülatörden oluşmaktadır. Uygulanacak vücut bölgesine göre değişik şekilde elektrotlar geliştirilmiştir. İçerisinden elektrik akımı geçen düzeneklerde, iletken etrafında manyetik alan oluşur. İletken düz ise etrafında kuvvet çizgileri dairesel olarak, bobin şeklinde ise bobinin iki ucundaki son halkalara dikey yönde dizilir. MAT’de çoğu zaman selonoid sistemi tercih edilmektedir. Solenoidler, bir telin heliks biçiminde sıkıca sarılmasıyla elde edilen akım makaralarıdır. Manyetik alanın şiddeti, solenoidin çapına veya uzunluğuna bağlı değildir. Metre başına düşen sarım sayısı manyetik alanın kuvvetini etkiler (74). Selonoidin içinde güçlü, dışında zayıf manyetik alan oluşur, solenoidin içerisindeki bu manyetik alan her iki ucu arasında homojen olarak yayılır (76). Dokudaki akımın akışı bobinden akan akımın zıt yönündedir. Bu akımın amplitüdü bobin kenarlarının hemen altında yoğun bir şekilde bulunur. Statik manyetik alan nöral dokuda depolarizasyona yol açmadığı için pulse veya değişken süreli olması gerekmektedir (76,77).
Elektromanyetik enerji hızı, ışık hızı kadar olup, ‘Gauss veya Tesla’ birimleri ile değerlendirilir. MAT’de kullanılan cihaz güçleri, 500-3000 Gauss arasındadır. Polarite, devinen manyetik enerji sirkülasyonunun yönüdür. Güney kutup, saat istikametinde olup, dolaşımı arttırır. Kuzey kutup ise, saat istikameti tersinde olup, oksijenizasyonu arttırır. Frekans, tekrar hızını verir. Frekans artınca, ısı etkisi artar ve manyetik alan etkisi baskılanır. Bu yüzden 100 Hz altında frekanslar, cihazlarda tercih edilmektedir(78).
Manyetik Alan Çeşitleri
Statik manyetik alanlar, düşük frekanslı sinüs dalga elektromanyetik alanlar, pulse elektromanyetik alanlar, pulse radyofrekans alanlar, transkranial manyetik stimülasyon, milimetrik dalgalar olmak üzere 6 çeşit manyetik alan bulunmaktadır.
Manyetik Alanın Organizma Üzerine Etkileri
Geçmişte yapılmış bazı çalışmalar ışığında bilinen etkileri şunlardır:
1. Yer kabuğunun, doğal bir manyetizması olup, bu manyetizmanın hücre zarından madde alış-verişinin sağlanması için gereklidir. Bu sayede atık maddeler ve toksinler uzaklaştırılır, besin maddeleri, oksijen ve mineraller hücre içerisine alınır.
2. Pulse alçak frekanslı manyetik alan uygulaması ile nükleusta ökromatin artar heterokromatin azalır.
3. Adenohipofiz stimüle olur, morfolojik değişimler oluşur. 4. Adrenal bezlerde, hücresel aktivite artar.
20
5. Testislerde histolojik değişimler olur.
6. Otonom sinir sisteminin etkilenmesine bağlı olarak vazodilatasyon oluşur.
7. Antienflamatuar, analjezik, antiödematöz etkileri vardır. Kırık ve yara iyileşmesini hızlandırır.
8. Pulse manyetik alan uygulaması ile viral hastalıklara karşı direnç artar. 9. Solunum volumünü arttırır, astım bronşialenin gidişatına iyi yönde etki eder.
10. Bazı şiddet ve frekanlarda puls manyetik alan uygulaması sonucunda farelerde sedasyon gelişir(75,78).
Manyetik Alan Tedavisinin Endikasyonları
Lokomotor sistem hastalıkları: Tedavide kullanılabilecek hastalıklar arasında, doku lezyonları sonucu oluşan bursit, tendinit, epikondilit, fasiit, kas zedelenmeleri, dejeneratif veya enflamatuar romatizmal hastalıkların akut, subakut ve kronik dönemleri, burkulma, ezilme, zorlanma gibi sporcu tipi yumuşak doku yaralanmaları, güç kaynayan kırıklar, endoprotezlerin gevşemesi, femur başı aseptik nekrozu, akut ve kronik kas spazmları, spinal ve paraspinal fonksiyonel rahatsızlıklar, ankilozan spondilit, osteoporoz, osteoartroz, akut veya kronik osteomyelit, spondiloz, spondiloartrit ve ligament yırtıkları bulunmaktadır (75,78,79).
Pulse elektromanyetik alan, kapiller damar oluşumunu ve endotel hücre proliferasyonunu arttırıp, IGF ve TGF-β salınımlarını uyarmakta, kırık iyileşmesinin tüm fazlarında rol alıp, kırık iyileşmesini hızlandırmaktadır (80). Lizozom, ribozom, mitokondrial stimülasyon yaptığı ve enzimatik aktiviteyi arttırdığı saptanmıştır. Metabolik artıkların dokudan uzaklaştırılmasına yardımcı olurken, parsiyel oksijen basıncını arttırır.
İlk dönemlerde yalnızca gecikmiş kırık iyileşmesi için Gıda ve İlaç Yönetimi onayı almıştır. Uzun kemiklerinde kaynamama görülen, 29 hasta üzerinde yapılan çalışmada, hastalara darbeli elektromanyetik alan tedavisi, osteogenezisi sağlamak amacı ile uygulanmış, kırık iyileşmesinde başarı oranı %82,5 olarak tespit edilmiştir (81). Fibula kemiğinde fraktür oluşturulan 72 tavşanın kulanıldığı çalışmada, bir gruba PGE2, bir gruba pulse elektromanyetik alan tedavisi (PEMAT) uygulanmış, 2 gruptada kemik iyileşmesinde kontrol grubuna göre daha iyi sonuçlar alınmıştır. PGE2 alan grupta, iyileşmenin doza bağlı olduğu tespit edilmiştir. PGE2 ve PEMAT’ın kırık kaynaması gecikmesinde kullanımı önerilmiştir (82). Aaron ve ark. (83) hayvan osteotomi deneylerinde, kesikli elektromanyetik alan tedavisinin, plasebo kontrole göre başarılı olduğunu ve MAT alan hastalarda, başarının %80-90 oranında daha fazla olduğunu yayınladıkları derlemelerinde bildirmişlerdir.
21
Nörolojik hastalıklar: Tedavide kullanılabilecek hastalıklar arasında, kas ve yumuşak doku kaynaklı baş ve boyun ağrıları, tinnutus, nevraljiler, ağrılı-enflamatuar-periferal sinir sistemi hastalıkları, migren ağrıları, refleks bölgesel ağrı sendromu, brakial pleksus yaralanmaları, optik sinir atrofisi ve miyopati bulunmaktadır(77,78).
Dermatolojik ve periferik vasküler hastalıklar: Bası yaraları, gecikmiş yara iyileşmesi, intermittant kladikasyo, ateroskleroz, benign damar hastalıkları, arteryal ve venöz dolaşım bozukluğu, ödem, psöriazis vulgaris ve allerjik dermatit tedavisinde kullanılabilmektedir (77,78).
Manyetik Alan Tedavisinin Kontrendikasyonları
Manyetik alan tedavisinin bilinen bir riski gösterilememiştir. Referans noktası olarak FDA, 4T den daha düşük statik manyetik alanları anlamlı riski olmayan grup olarak sınıflandırmıştır. 8 T’lık alan gücüne bir saat maruz kalmak elektrokardiografide geçici değişiklere neden olmuş, fakat kan basıncı, kalp, solunum sayısı, kardiak output, vücut sıcaklığı ve bilişsel alanda değişime yol açmamıştır (84). Yapılan araştırmalar sonucunda, MAT’ın, etkin, ucuz, ciddi yan etkileri olmayan, güvenli bir tedavi yöntemi olduğu saptanmıştır (85). MAT alan hastada implante aygıt (insülin pompası gibi), akut ateş, kanayıcı hastalık, hipertiroidi, malignite, gebelik, nöbet hikayesi olmamasına dikkat edilmesi önerilir (86). Hipotansiyon ve hipertansiyonlu hastalarda, ani kan basıncı değişimine neden olarak vertigo ve senkop oluşabilir. Bu durum 30 dakika içinde düzelir ve 5 uygulama sonrasında uyum sağlanması beklenir (74).
22
GEREÇ VE YÖNTEMLER
Araştırmamız, Trakya Üniversitesi Tıbbi Bilimler Deneysel Araştırma ve Uygulama Merkezinde üretilmiş, kiloları ortalama 250-300 gram arasında değişen, dişi, erişkin, Wistor albino cinsi, 22 adet rat üzerinde gerçekleştirildi. Çalışmamızda sırasıyla; giyotin cihazı ile kapalı kırık oluşturma işlemi, kırığın radyolojik olarak ispatı, ratlara PEMAT ve LPPI tedaviler uygulaması, tedavi seansları bitiminde, kırığın digital mamografi cihazı ile iyileşme izlemi için görüntülenmesi, kırık bölgesinden KMY ölçümü yapılması, sakrifikasyon ve alınan dokuların histolojik incelemeleri şeklinde gerçekleştirildi.
Bu çalışmanın hayvanların canlı kaldığı dönemlerini içeren kısmı, Trakya Üniversitesi Hayvan Deneyleri Laboratuarında gerçekleştirilmiştir. Elde edilen örneklerin digital mamografi çekimleri; Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Radyoloji Anabilim Dalı’nda, Kemik yoğunluğu ölçümü; Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Nükleer Tıp Anabilim Dalı’nda yapılmıştır. Kırık kemik alanından alınan örneklerin, dekalsifiye edilmeksizin histolojik kesit hazırlama ve histomorfometrik inceleme kısmı Çukurova Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi’nde, PEMAT’si alan grubun, beyin ve iç organlardan alınan örneklerin histolojik incelemesi ise Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji Anabilim Dalı’nda yapılmıştır.
Çalışmamızın Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu onayı (Ek 1) ve Radyasyon Güvenliği Komite onayı alınmıştır (Ek 2). Ayrıca araştırmamız, Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Projeleri Birimi tarafından 2009-117 No’lu proje olarak desteklenmiştir (Ek 3).
Çalışmamızda, iskeletsel gelişimlerini tamamlamış dişi ratlar kullanıldı. Çalışma süresince kilo kaybeden, genel sağlıkları bozulan ratların, çalışmadan çıkartılması planlandı. Tüm hayvanlara, aynı yöntemle kırık oluşturma işlemi, kırık sonrası bakım uygulandı. 8 rat PEMAT, 8 rat LPPI tedavisi, 6 rat kontrol olmak üzere toplam 3 grup oluşturuldu. Rat sayıları
23
çalışma öncesi power analiz yapılarak belirlendi.
Kapalı kırık oluşturmak için giyotin cihazı, diz üstü sirküler alçı uygulaması için alçı malzemesi ve makas, genel anestezi için Ketamin hidraklorür flakon (Ketalar®, Pfizer, İstanbul) ve Xlazine hidraklorür (Rompun®, Bayer, İstanbul) hazırlandı.
Ratların barınması için kafes, kafesin ön kısmına monte edilmiş hayvanın kolayca ulaşabileceği su ve yiyecek haznesi, kırık sonrası analjezi sağlamak için parasetomol (5mg/kg dozunda), PEMAT ve LPPI uygulamaları için hareket kısıtlamasını sağlayacak plastik tedaviye alma kapları, PEMAT ve LPPI cihazı kullanıldı.
Radyolojik görüntü elde etmek amacıyla digital mamografi cihazı (Lorad Selenia Full Fild), KMY ölçüm cihazı (holagic qdr 4500) ve çekim esnasında anestezi sağlamak için ketamin hidraklorür (Ketalar®, Pfizer, İstanbul) ve Xlazine hidraklorür (Rompun®, Bayer, İstanbul) kullanıldı.
Sakrifikasyon sonrası dokuların ayrıştırlması aşamasında kullanılmak üzere genel anestezi için, Ketamin hidraklorür (Ketalar®, Pfizer, İstanbul) ve Xlazine hidraklorür (Rompun®, Bayer, İstanbul), tüm dokular ve gruplar için ayrı hazırlanmış ve ismlendirilmiş, %10 formalin içeren steril kaplar, steril makas ve bistüri temin edildi.
Kapalı kırık oluşturma ve alçılama işlemi öncesinde hayvanlara, 5 mg/kg Ketamin hidraklorür ve 3 mg/kg Xlazine hidraklorür kas içine uygulanarak genel anestezi sağlandı. Rat tibiası iki ucunda gerili halde giyotin cihazına ortalanarak yerleştirildi. Tüm hayvanlara çalışma öncesinde 3 rat üzerinde yapılan, ön çalışmada belirlenmiş olan sabit yük uygulandı ve kapalı kırık oluşturuldu. Ratlar anestezi altında iken, tüm ratların, digital mamografi cihazı ile radyolojik görüntülenmeleri yapılarak, tibia kırıkları kanıtlandı (Şekil 4).
)
Şekil 4. Kırığın radyolojik görüntüsü
Kırık ekstremite ayak parmaklarından proksimale doğru alçı pamuğu sarıldı ve traksiyon uygulanarak, diz üstü sirküler alçı uygulandı. Ratların ayak parmakları, dolaşımı
24
değerlendirebilmek amacı ile açıkta bırakıldı (Şekil 5).
Şekil 5. Ratlara diz üstü sirküler alçı uygulama işlemi ve distal ekstremitelerin dolaşım takibi için açıkta bırakılması
Ratlar, kırık işlemi sonrasında gruplara göre kafeslere yerleştirildi. Ağrı kontrolü amacı ile işlemin hemen sonrasında, parasetamol sularının içine karıştırılarak, 5 mg/kg dozunda verildi. Ratlar, ilk günden itibaren normal diyetleriyle beslendi. Sakrifiye edildikleri güne kadar tüm hayvanların aldıkları yiyecek ve su miktarı takip edilerek haftalık kilo ölçümleri yapıldı.
Çalışmamızda, PEMAT uygulaması için, BTL-09 model (BTL, Benesov, Czech Republic, AC input 230 v/50-60 Hz, 2x Fuse T6.3A, input power: 600VA) manyetik alan cihazı kullanıldı. 1. gruba, PEMAT, 15 gün boyunca, günde 1 defa olmak üzere, 30 dakika süresince, 15 mT dozunda, her gün aynı saate, aralıksız olarak, toplam 15 seans uygulandı. (Şekil 6,7).
Şekil 6. Pulse elektromanyetik alan tedavisi güç kaynağı ve selonoidleri
2. gruba, LPPI uygulaması, 10 cm uzaklıktan, kırık bölgesinin distal ve proksimalindeki açık cilt üzerine, 6 dakika, 1,3 j/cm2 dozunda, toplam 15 seans olarak
25
uygulandı (Şekil 8).
Şekil 7. Pulse elektromanyetik alan tedavisi uygulama düzeneği
Şekil 8. Ratlara lineer polarize polikromatik ışık uygulanması
Pulse elektromanyetik alan ve LPPI uygulamaları sırasında, havyanların hareketlerini kısıtlayan plastik kaplar kullanıldı. Uygulama sırasında hayvanlara sedatif ajan verilmedi. Tüm uygulama boyunca bir gözlemci uygulamanın yapıldığı odada bulundu ve işlemin kesintisiz şekilde ilerlemesini sağladı.
Pulse elektromanyetik alan ve LPPI uygulamalarının 15. seansı sonunda, tüm ratlara genel anestezi uygulandı. Digital mamografi sensorü üzerine şeffaf strech film yerleştirildi. Ratlar prone pozisyonda, kırık tibia bölgesi sensora temas edecek şekilde yerleştirildi (Şekil 9). Çekilen görüntüler, aynı radyoloji uzmanı tarafından, gruplar bilinmeden, kademeli skorlama sistemine göre sayısal olarak puanlandırıldı(79) (Tablo 2).
26
Şekil 9. Digital mamografi cihazı ile radyolojik görüntüleme Tablo 2. Radyolojik skorlama (79)
0 puan İyileşme yok 1 puan Kallus formasyonu
2 puan Belirgin kallus oluşumu, köprüleşme yok 3 puan Kemiksel kaynama
Digital mamografi çekimi sonrası, kırık bölgesinden, KMY ölçümü (R1) yapıldı ve gruplar bilinmeden, aynı Nükleer Tıp uzmanı tarafından analiz edildi (Şekil 10,11).
Şekil 10. Kırık alanının, kemik mineral yoğunluğu ölçümünde ratların pozisyonlanması
27
Şekil 11. Kırık alanının kemik mineral yoğunluğu ölçüm cihazı ile görüntülenmesi
Her üç gruptaki kırık tibia kemikleri, kesit hazırlama amaçlı %10 formalin ile fikse edildi. Fikse edilen örnekler artan konsantrasyondaki (%70-%99) etanol alkol çözeltisinde, vakumlu kaplarda, 12 gün boyunca dehidrate edildi. Sonrasında, örnekler içersine karanlık ortamda sıvı metilmetakrilat infiltrasyonu uygulandı. Bir gün süren akril infiltrasyonundan sonra örnekler plastik kalıplar içerisine yerleştirilip akrilik rezin içine gömüldü. Akril polimerizasyonu, 6 saat süresince polimerizasyon ünitesinde yapıldı. Örnekler, presli yapıştırma ünitesi ile plastik lamlara yapıştırıldıktan sonra, testereli kesme ünitesinden 200 µm kalınlığında kesitler elde edildi. Bundan sonra örnekler 50 µm kalınlığına kadar inceltilip parlatıldı. Elde edilen kesitler %10 luk H202 ile yıkandı ve Toulidin Blue ile boyandı. Kırık
hatlarından Olympus BX50 mikroskobuna bağlı dijital fotoğraf makinesi ile 4X büyütmede dijital görüntü alınıp, kişisel bilgisayara aktarılıp, TAS bilgisayar yazılımı ile histomorfometrik ölçüm yapıldı. Öncelikle kesitlerde seviyeleme yapılıp binary (her piksel için olası en fazla iki değere sahip olan) görüntüleri elde edildi. Bundan sonra program içerisinde mevcut özellik kullanılarak görüntü kemikleştirildi (skeletonizing). Böylece görüntüde trabeküler yapılar ortaya çıkartıldı. Kırık bölgesinden kesit alındı. Sağlam kemik kenarları ölçüme dahil edilmedi. Parfitt ve ark. tarafından 1987 yılında tarif edilen ve Amerikan Kemik ve Mineral Araştırma Birliğince kabul edilen histomorfometrik birimlendirme sistemi kullanıldı (80) (Tablo 3).
28
Tablo 3. Histomorfometrik değerlendirme parametreleri
PARAMETRE BİRİM AÇIKLAMA
Kemik Volümü %
Mineralize olmuş ve olmamış kemik dokusu hacminin seçili alandaki toplam doku
hacmine oranı
Kemik Yüzeyi mm/mm2
Mineralize olmuş ve olmamış kemik dokusu yüzey alanının seçili alandaki toplam doku hacmine oranı
Trabeküler Kalınlık Mikromtere (mcm) Kanselöz kemik trabeküllerin üç boyutta kalınlığı Node sayısı Adet Üç ya da daha fazla piksel çizgisinin birbirleri ile eklem yaptıkları alanların sayısı Terminus sayısı Adet Piksel çizgilerinin sonlandıkları nokta sayısı Node/Terminus oranı sayısal oran Node sayısının uç noktaları sayısına olan
oranı.
Kemik Alanı mm Seçili alanda mineralize olan veya olmayan
kemik alanı
Kemik Çevresi mm Kemik yüzeyinin iki boyutta çevresi
Trabeküler Genişlik mcm Trabeküllerin iki boyutta genişliği Trabekül Sayısı adet Seçili alandaki trabekül sayısı
Trabeküler ayrıklık mcm Kemik hacmi içerisindeki trabeküller kalınlık miktarı çıkartıldıktan sonra kalan alan
Genişlik mm Seçilen alanın genişliği
Yükseklik mm Seçilen alanın yüksekliği
İç organ ve beyin dokularından histolojik kesit hazırlama ve inceleme aşamasında, ışık mikroskobik incelemeler için beyin, karaciğer, akciğer ve böbrek dokuları, Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Işık Mikroskopi Laboratuarı’nda işlemlendirildi. Bu amaçla beyin dokuları formaldehit; karaciğer, akciğer ve böbrek dokuları dokuları da Bouin fiksatöründe 4 gün fikse edildikten sonra yıkama işlemine geçildi. Dokular 2 gün %70’lik alkolde yıkanarak, dehidratasyon işlemine geçildi. Dokular artan alkol serilerinde (%70, 90, 96, 100) 1’er saat tutuldu. Dehidratasyon aşamasından sonra saydamlaştırma basamağı için dokular 3 seri 15’er dakika toluol ile muamele edildi. Gömme işleminden önce dokular yumuşak parafinde 1 gece tutuldu. Bir sonraki gün tüm dokular yumuşak parafinden alınarak 1 saat sıvı sert parafinde tutularak, bloklandı. Bu bloklardan Leica RM-2245 silindirli mikrotom kullanılarak 6 μm (mikrometre) kalınlığındaki kesitler alındı. Beyin, karaciğer, akciğer ve böbrek dokularının genel özelliklerini ortaya koyabilmek amacıyla alınan kesitler Hematoksilen-Eozin (HE) ile boyandı.
İmmünohistokimyasal inceleme için, beyin dokusundan 6 μm kalınlığında kesitler alındı ve deparafinizasyon işlemini takiben kesitler suya indirildi. Suya indirilen kesitler
29
antijen retrival içinde mikrodalga fırında 20 dakika kaynatıldı. Oda ısısında 20 dakika soğumaya bırakıldıktan sonra kesitler PBS ile yıkandı. Bu aşamadan sonra hidrojen peroksidaz aktivitesinin giderilmesi için metanolde (Riedel-de Häen 24229) hazırlanan %3’lük hidrojen peroksit (H2O2) ile 20 dakika muamele edildi. Distile su içinde çalkalanarak,
kesitler Fosfat Buffer Solusyonu (PBS; pH 7,6) ile yıkandı. Özgül olmayan antikor bağlanmalarını bloklamak üzere kesitlere %1 preimmün rabbit serum (Ultra V Block, LabVision, TA-015-UB) uygulandı. Daha sonra kesitler nemli chamber içinde 1/100 oranında sulandırılmış primer antikor ile 1 saat süre ile inkübe edildi. Kullanılan antikor, tavşan poliklonal anti-kaspaz-3 (Cat. # RB-1197-P, Neomarkers, USA) idi. Kesitler 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 20 dakika sekonder antikor solüsyonunda (Biotinylated Goat Anti-Mouse, LabVision, TM-015-BN) tutuldu. 3 kez PBS’de yıkanan kesitlere 20 dakika streptavidin peroksidaz solüsyonu (Streptavidin Peroxidase, LabVision, TS-015-HR) uygulandı. Kesitler 3 kez PBS ile yıkama sonrasında immunohistokimyasal reaksiyonun görünürlüğünü saptamak amacıyla diamino benzidin ile 5 dakika boyandı. Kesitler distile su ile yıkandıktan sonra 5 dakika Mayer hematoksilen uygulanarak zıt boyama yapıldı. Akarsuda 5 dakika yıkanan kesitler kapatma solüsyonu (Mounting Medium, LabVision, TA-060-UG) konarak lamel ile kapatıldı ve ışık mikroskobunda değerlendirmeye alındı.
Tunel boyama öncesi parafin bloklardan lam üzerine alınan 6 μm’lik kesitler 1 gece 37°C’lik etüvde tutulduktan sonra toluolde 3x5 dakika bekletilerek parafinden iyice arındırılarak azalan alkol serilerinden (%100, %95, %70) 3’er dakika geçirilip distile suya indirildi. 5 dakika distile suda tutulan kesitlere daha sonra antijen iyileştirme amacıyla 15 dakika oda ısısında proteinaz K (20 μg/ml, Chemicon, 21627) uygulandı. Distile su ile yıkanan kesitler endojen peroksidazı bloklamak için metanolde hazırlanan %3’lük H2O2’de 5
dakika bekletildi. Distile su ve PBS ile çalkalandıktan sonra lam üzerinde kesitlerin etrafı hidrofobik kalem (Zymed, 00-8899) ile çizilerek havuz oluşturuldu ve kesitlere 5 dakika oda ısısında dengeleme tamponu uygulandı. Daha sonra kesitler 37 °C’de terminal deoksinükleotidil transferaz enziminde 1 saat bekletildikten sonra durdurma/yıkama tamponuyla 15 saniye çalkalandı ve oda ısısında 10 dakika bekletildi. 3 kez PBS’de yıkanan kesitlere antidigoksigenin konjügatı uygulandı ve oda ısısında 30 dakika tutuldu. Kesitlere 3 kez PBS ile yıkama sonrasında 10 dakika diamino benzidin kromojen solüsyonu (LabioVisn, TA-002-HAC) uygulaması yapıldı. Kesitler distile su ile yıkandıktan sonra 10 dakika Methyl green uygulanarak zıt boyama yapıldı. Distile sudan hızla geçirilen kesitler %100 N-Butanolden de hızla geçirildi. Dehidrate edilen kesitler 3x2 dakika toluolde tutulduktan sonra kapatma solüsyonu konarak lamel ile kapatıldı ve ışık mikroskobunda değerlendirmeye alındı.
30
Işık mikroskobunda (Olympus CX31-Japan) incelenerek, bulguların fotoğrafları çekildi. Sakrifikasyondan hemen sonra kalpten alınan kan örneklerinden, PTH, osteokalsin, Ca, P ve hemogram tetkikleri yapıldı. Pıhtılaşan ve yetersiz olan örneklerden ölçümlerin bir kısmı yapılamadı.
Verilerin istatistiksel analizi Statistica 7.0 (Lisans no: AXF003C775430FAN2) paket programı kullanılarak yapıldı. Gruplar (PEMAT, LPPI, Kontrol) arasında, KMY ölçümleri, direkt grafi ölçümleri, histomorfometrik skorların ve kan değerleri sonuçlarının karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis Test kullanıldı, anlamlı farklılık saptandığında farklılığın hangi gruplar arasında olduğunu belirlemede, Bonferroni çoklu karşılaştırma testi kullanıldı. p<0,05 değeri istatistiksel anlamlılık sınırı olarak kabul edildi.
31
BULGULAR
Çalışma süresince, PEMAT alan deney grubundan 1 ratta, tedavinin 7. gününde, 2 gün süresince hareketlerde azalma ve iştahsızlık görülürken, 2. günün sonunda rat normal haline döndü. Çalışmadaki tüm ratlar, uygulamaları iyi bir şekilde tolere etti ve sakrifiye edildikleri güne kadar önemli miktarda kilo kaybeden rat olmadı.
Çalışma sırasında uygulanan diz üstü sirküler alçı, ratlar tarafından kemirilerek açıldı. Çözüm olarak genel anestezi altında, 2 günde bir diz üstü sirküler alçıları yenilendi.
Alçı uygulamaları sonrası her gün açıkta bırakılan distal ekstremite kısımlarından dolaşım takibi yapıldı. Ayağında, şişlik, kızarıklık veya morarma, ödem izlenen ratların eski alçıları çıkarıldı ve alçıları yenilendi. Ratların dolaşımları bu şekilde rahatlatılırken, LPPI tedavisi uygulanan grupta, dolaşımın düzene girip, ödemin ve renk değişiminin düzelmesi, PEMAT ve kontrol grubuna göre daha kısa sürede gerçekleşti. LPPI uygulamasının, yara iyileşmesini hızlandırdırdığı klinik olarak izlendi.
Kemik mineral yoğunluğu ölçümleri sonucunda, kırık alanlarındaki ortalama KMY’yi gösteren R1 değerlerinde 3 grup arasında istatiksel olarak anlamlı fark bulunmadı (p=0,741) ancak PEMAT grubundaki R1 değeri ortalaması, LPPI ve kontrol grubundan daha yüksekti. LPPI grubunda ise R1 değeri, kontrol grubundan daha düşük olarak saptandı. Gruplardan elde edilen KMY değerleri Tablo 4’te, gruplar arası minumum, maksimum ve ortalama KMY değerleri karşılaştırılması Tablo 5’te, gruplar arasındaki KMY değerlerinin karşılaştırılmasına ait grafik Şekil 12’de verilmiştir.
32
Tablo 4. Gruplara göre kırık alanındaki kemik mineral yoğunluğu ölçüm (R1) değerleri Denek
numarası PEMAT (g/cm2) LPPI (g/cm2) Kontrol (g/cm2)
1 0,235 0,278 0,185 2 0,196 0,220 0,212 3 0,184 0,164 0,191 4 0,205 0,157 0,191 5 0,177 0,174 0,225 6 0,220 0,202 0,244 7 0,258 0,221 8 0,232 0,213
PEMAT: Pulse elektromanyetik alan tedavisi; LPPI: Lineer polarize polikromatik ışık.
Tablo 5. Gruplar arasındaki kemik mineral yoğunluğu değerleri ortalamasının karşılaştırılması
PEMAT LPPI Kontrol p*
Kemik mineral yoğunluğu 0,213±0,028 0,213 (0,18-0,26) 0,203±0,04 0,207 (0,16-0,28) 0,208±0,24 0,20 (0,20-0,24) 0 0,741
Ortalama±SS; Medyan (min-mak); *:Kruskal Wallis test; PEMAT: Pulse elektromanyetik alan tedavisi; LPPI: Lineer polarize polikromatik ışık
PEMAT: Pulse elektromanyetik alan tedavisi; LPPI: Lineer polarize polikromatik ışık.
Şekil 12. Gruplar arası kemik mineral yoğunluğu ölçümünün karşılaştırılması Digital mamografi cihazı ile çekilen grafiler, radyolojik skorlama sistemi ile sayısal olarak puanlandırıldı (79). Değerlendirme, bir radyoloji uzmanı tarafından, gruplar bilinmeden yapıldı. 3 grup arasında istatiksel olarak anlamlı fark bulunmazken (p=0,47), PEMAT grubundaki skor, LPPI ve kontrol grubundan daha yüksek bulundu. LPPI grubundaki skor, kontrol grubuyla aynı olarak değerlendirildi. Tüm gruplara ait radyolojik skorlar, Tablo 6’da, gruplar arası radyolojik skorlama değerlerinin karşılaştırılması Tablo 7’de, radyolojik
33
skorlara ait grafik Şekil 13’te verilmiştir. PEMAT grubundan bir rata ait digital mamografi örneği Şekil 14’te, LPPI grubundan bir rata ait digital mamografi örneği Şekil 15’da, kontrol grubundan bir rata ait digital mamografi örneği Şekil 16’da bulunmaktadır.
Tablo 6. Gruplara göre radyolojik skorlama değerleri Denek
numarası PEMAT LPPI Kontrol
1 1 1 1 2 1 2 1 3 3 0 2 4 2 2 0 5 0 0 1 6 1 0 1 7 2 1 8 2 2
PEMAT: Pulse elektromanyetik alan tedavisi; LPPI: Lineer polarize polikromatik ışık.
Tablo 7. Gruplar arası radyolojik skorlama değerlerinin karşılaştırılması.
PEMAT LPPI Kontrol p*
Radyolojik skor 1,5±0,9 1,5 (0-3) 1±0,9 1 (0-2) 1±0,6 1 (0-2) 0,46
Ortalama±SS; Medyan (min-mak); *: Kruskal Wallis test; PEMAT: Pulse elektromanyetik alan tedavisi; LPPI: Lineer polarize polikromatik ışık
PEMAT: Pulse elektromanyetik alan tedavisi; LPPI: Lineer polarize polikromatik ışık.
Şekil 13. Gruplar arası radyolojik skorlamanın karşılaştırılması
