Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/4390

Tam metin

(1)臺北醫學大學保健營養學系碩士班碩士論文 Mas t e r ’ sThe s i s School of Nutrition & Health Sciences Taipei Medical University. 藉由多元不飽和脂肪酸調控粒線體功能提供 Ceramide 對神經膠細胞毒性之保護作用 Functional Modulation of Mitochondria by Polyunsaturated Fatty Acids Provide Protection against Ceramide Toxicity to Glioma Cells. 研究生：陳佳妤 (Chia-Yu Chen) 指導教授：謝榮鴻博士 (Rong-Hong Hsieh Ph.D) 中華民國九十六年六月 June 2007.

(2) 摘要. 現今已有研究指出，多元不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids, PUFAs) 具有神經保護的功能性，並能延緩神經退化性疾病。亦有文獻顯示，脂肪酸可藉由影響轉錄因子調控基因表現，因此本研究旨在探討藉由 ceramide 誘導神經退化模式，並以二十碳四烯酸 (arachidonic acid； C20:4 n-6) 及二十碳五烯酸 (eicosapentaenoic acid；C20:5 n-3) 處理神經膠瘤細胞，對於粒線體生合成相關基因及其上游轉錄因子基因表現之影響，並觀察其保護作用。以 C6 神經膠瘤細胞作為研究對象，預處理或與 ceramide 同時處理二十碳四烯酸及二十碳五烯酸 24 小時，觀察細胞型態及檢測細胞存活率，並檢測粒線體功能性。以二十碳五烯酸預處理或與 50μM ceramide 同時處理 24 小時後，細胞型態及存活率與 ceramide 組相較皆明顯上升，且粒線體功能回復。在基因表現方面，觀察上游轉錄因子 PGC-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γcoactivator 1 α)、Tfam (mitochondrial transcriptional factor A) 之轉錄活性皆顯著上升，進而測定粒線體基因之 ND6 (NADH dehydrogenase subunit 6) mRNA 表現亦有明顯增加之情形。然而二十碳四烯酸預處理或與 ceramide 同時處理 24 小時後，細胞型態及存活率與 ceramide 組相較雖明顯上升，但粒線體功能並無明顯回復。在轉錄因子活性方面，觀察 Tfam 之轉錄活 I.

(3) 性明顯上升，且粒線體基因 ND6 之 mRNA 表現亦有回復之情形。由上述實驗數據推論二十碳五烯酸為經由促進 PGC-1α之表現，而二十碳四烯酸則並非完全經由 PGC-1α途徑，達到刺激粒線體生合成之效果；並發現以二十碳五烯酸處理具有預防或回復 ceramide 所造成之粒線體功能性傷害，以達到神經細胞保護作用。. 關鍵字：多元不飽和脂肪酸、神經保護. II.

(4) Abstract Mitochondrial dysfunction has been reported in the pathogenesis of neuron degeneration. Recent studies indicated that polyunsaturated fatty acids (PUFAs) have beneficial effects on various neuron functions and mitochondrial biogenesis. Besides, the effect of gene regulation by fatty acids is considered about their specific binding to nuclear receptors as transcription factors, or changed in abundance of these transcription factors indirectly. In the current study, we created a C2 ceramide-induced neurodegeneration model of C6 glioma cells line. Various concentrations of arachidonic acid (AA; n-6 C20:4) or eicosapentaenoic acid (EPA; n-3 C20:5) were treated to evaluate the effects of neuroprotection and its regulatory mechanism. The cell viabilities were decreased by ceramide treatment for 24 h. The cell viabilities of PUFAs pre-treatment 24 h followed by exposure to 50 μM ceramide were also determined. The C6 cells pre-treated with EPA showed significant resistance to ceramide cytoxicity. The cell viabilities were increased in the cohorts of EPA and AA treatment in both of PUFAs and ceramide incubated at the same time. Increased transcriptional activities of mitochondrial transcriptional factor A (Tfam) were examined by promoter activities assay from cells pre-treatment and co-treatment of EPA and AA. Furthermore, the PUFAs could induce mitochondrial mRNA expressions were observed in current study. These data represented that PUFAs could provide protective effects on cells from the attack of ceramide, and more correlation to the modulated mitochondrial function. Keyword: neuroprotection, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) III.

(5) 目錄摘要 ..................................................................................................................I Abstract............................................................................................................III 目錄 .................................................................................................................IV 表目錄 .............................................................................................................. X 圖目錄 .............................................................................................................XI 第一章序論 .....................................................................................................1 第二章文獻回顧 .............................................................................................2 第一節神經膠細胞與神經保護作用........................................................2 第二節粒線體與電子傳遞鏈....................................................................3 第三節神經退化性疾病及粒線體功能不全之相關性............................4 第四節多元不飽和脂肪酸可能達到神經保護作用之機制....................5 第五節轉錄因子調控粒線體生合成作用................................................6 第六節粒線體轉錄因子 A (Mitochondrial transcriptional factor A) .......7 第七節過氧化小體增生活化接收器 γ共同活化子-1α(Peroxisome proliferator-a c t i v a t e dr e c e p t orγc oa c t i va t or1α) .........................8 第三章研究目的 ...........................................................................................10 第四章材料與方法 ....................................................................................... 11 第一節質體構築...................................................................................... 11 (一) 建構 Tfam Pro-Luc 報導質體 ...................................................... 11 IV.

(6) (二) 建構 PGC-1αPro-Luc 報導質體 ................................................. 11 第二節勝任細胞 (competent cells) 之製備 ........................................12 第三節轉型作用 (transformation) .......................................................12 第四節質體 DNA 之萃取 .......................................................................13 第五節細胞培養....................................................................................14 (一) 細胞株 ............................................................................................14 (二) 培養條件 ........................................................................................14 第六節藥劑處理......................................................................................14 (一) 脂肪酸 ............................................................................................14 (二) Ceramide.......................................................................................15 第七節實驗組別......................................................................................15 (一) 控制組 ............................................................................................15 (二) 負控制組 ........................................................................................15 (三) 正控制組 ........................................................................................15 (四) Pre-treatment 組...............................................................................16 (五) Co-treatment 組 ...............................................................................16 第八節細胞存活率測試..........................................................................16 第九節細胞之短暫轉染 (transient transfection) ...................................17 第十節冷光酶報導基因分析..................................................................17 V.

(7) 第十一節 RNA 萃取 ................................................................................18 第十二節反轉錄作用..............................................................................19 第十三節同步定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (Real-time reverse transcriptional polymerase chain reaction, real-time RT-PCR)..19 第十四節細胞蛋白質之萃取..................................................................20 第十五節蛋白質之定量..........................................................................20 第十六節西方點墨法分析......................................................................21 第十七節流式細胞儀分析......................................................................22 第十八節統計分析..................................................................................23 第五章實驗結果 ...........................................................................................24 第一節對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響 ..........................................24 (ㄧ) Ceramide 處理對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響.....................24 (二) 多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響 ............24 (三) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響...................25 (四) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響 ...................25 第二節對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響 ......................................26 (ㄧ) Ceramide 處理對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響.................26 (二) 多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響 ........26 (三) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響...............27 (四) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞細胞存活率之影響 .......28 VI.

(8) 第三節觀察 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響..........................30 (一) 給予 ceramide 對於 C6 神經膠瘤細胞膜電位之影響 ................30 (二) 多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響.................................................................................................30 (三) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響...30 (四) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響 ...31 第四節觀察 C6 神經膠瘤細胞對粒線體相關轉錄因子基因表現之影響.............................................................................................32 (一) 投予多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子基因表現影響 ...............................................................................................32 (二) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子基因表現之影響 .......................................................................................................33 (三) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子基因表現之影響 .......................................................................................................34 第五節觀察 C6 神經膠瘤細胞對粒線體基因之影響..........................36 (一) Pre-treatment 對 C6 神經膠瘤細胞粒線體基因表現之影響 ......36 (二) Co-treatment 對 C6 神經膠瘤細胞粒線體基因表現之影響 .......37 第六章討論 ...................................................................................................39 第一節處理 ceramide 對於傷害 C6 神經膠瘤細胞之影響 ...............39 第二節給予多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞之影響........40 VII.

(9) 第三節多元不飽和脂肪酸處理對於 C6 神經膠瘤細胞達到之保護作用.............................................................................................41 (一) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞保護作用之影響...........41 (二) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞保護作用之影響 ...........42 第四節多元不飽和脂肪酸對轉錄因子及相關粒線體基因表現之影響.................................................................................................43 (一) 觀察多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞對轉錄因子之影響 ...................................................................................................43 (二) 觀察 Pre-treatment 處理多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子之影響 ...........................................................................44 (三) 觀察 Co-treatment 處理多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子之影響 ...........................................................................45 第五節綜合討論....................................................................................47 (一) Ceramide 影響 C6 神經膠瘤細胞粒線體之基因表現造成傷害之作用 ...............................................................................................47 (二)多元不飽和脂肪酸調控轉錄因子之表現以達到神經細胞之保護作用 ...............................................................................................47 第七章結論 ...................................................................................................49 第八章參考文獻 ...........................................................................................50 VIII.

(10) 第九章附錄 ...................................................................................................56. IX.

(11) 表目錄. 表 1 質體建構及 Real-time RT-PCR 分析使用之基因引子序列 .........56 表 2 西方墨點法分析使用之一級抗體..................................................57. X.

(12) 圖目錄圖 1 電子傳遞鏈 ......................................................................................58 圖 2 大鼠 Tfam 啟動子序列 ...................................................................59 圖 3 pGL3-Tfam 質體.............................................................................60 圖 4 大鼠 PGC-1α啟動子序列...............................................................61 圖 5 pGL3- PGC-1α質體 ........................................................................62 圖 6 Ceramide 處理 C6 神經膠瘤細胞株 24 小時之細胞型態 ...........63 圖 7 二十碳五烯酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時之細胞型態........64 圖 8 二十碳四烯酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時之細胞型態........65 圖 9 二十碳五烯酸預處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時後，以 ceramide 誘使神經退化後之細胞型態.............................................................66 圖 10 二十碳五烯酸處理 C6 神經膠瘤細胞，同時投與 ceramide 誘使神經退化之細胞型態 .....................................................................67 圖 11 Ceramide 處理 C6 神經膠瘤細胞株 24 小時之細胞存活率......68 圖 12 多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時之細胞存活率 .........................................................................................................69 圖 13 多元不飽和脂肪酸預處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時後，以 ceramide 誘使神經退化後之細胞存活率 .........................................70 圖 14 多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞，同時投與 ceramide XI.

(13) 誘使神經退化之細胞存活率.............................................................71 圖 15 Ceramide 處理 C6 神經膠瘤細胞株 24 小時之粒線體膜電位 ..72 圖 16 二十碳五烯酸處理 C6 神經膠瘤細胞株 24 小時之粒線體膜電位 .........................................................................................................73 圖 17 二十碳四烯酸處理 C6 神經膠瘤細胞株 24 小時之粒線體膜電位 .........................................................................................................74 圖 18 多元不飽和脂肪酸預處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時後，以 ceramide 誘使神經退化後之粒線體膜電位 .....................................75 圖 19 多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞，同時投與 ceramide 誘使神經退化之膜電位 .....................................................................76 圖 20 多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時對轉錄因子之轉錄活性影響 .................................................................................77 圖 21 多元不飽和脂肪酸預處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時對轉錄因子之轉錄活性及蛋白質表現.............................................................78 圖 22 多元不飽和脂肪酸與 ceramide 同時處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時對轉錄因子之轉錄活性及蛋白質表現.....................................79 圖 23 多元不飽和脂肪酸預處理 C6 神經膠瘤細胞對 ND6 基因表現之影響 .................................................................................................80 圖 24 多元不飽和脂肪酸預處理 C6 神經膠瘤細胞對 NDUFA9 蛋白 XII.

(14) 質表現之影響 .....................................................................................81 圖 25 多元不飽和脂肪酸與 ceramide 同時處理 C6 神經膠瘤細胞對 ND6 基因表現之影響 ........................................................................82 圖 26 多元不飽和脂肪酸與 ceramide 同時處理 C6 神經膠瘤細胞對 flavoprotein 蛋白質表現之影響 ........................................................83. XIII.

(15) 第一章序論近年來研究發現，雖然多種退化性疾病臨床症狀不盡相同，但在神經細胞生理方面均發現有粒線體功能減低或喪失的情形，並推測神經細胞中粒線體功能受損可能為神經退化疾病之致病機制 (Yazdani et al., 2006)。當粒線體功能減低或構造異常時，會進一步影響 ATP (adenosine triphosphate) 的生成及粒線體的下游功能，並於細胞內產生大量 ROS (reactive oxygen species) 最後造成神經傷害。因此藉由維持粒線體的功能，可能達到神經細胞保護作用。近年來發現大腦失調是由數種危險因子所造成，其中包括營養因子缺乏及耐受性不佳。現今已經證實體內營養缺乏會造成細胞及粒線體的傷害而導致大腦失調發生 (Virmani et al., 2005)。而多元不飽和脂肪酸除了提供身體能量及構成細胞膜外，亦有文獻證實，多元不飽和脂肪酸主要藉由生理調控，例如抗發炎及細胞膜修飾作用等，達到神經保護作用 (Virmani et al., 2005; Florent et al.,2006)。除此之外，脂肪酸可藉由一些直接或間接的路徑來調控基因表現 (Pégorier et al., 2004)。因此，本次研究旨在藉由多元不飽和脂肪酸達到基因調控及對於細胞中粒線體生合成及功能進行修飾，藉以了解多元不飽和脂肪酸可能影響神經保護之相關作用。. 1.

(16) 第二章文獻回顧. 第一節神經膠細胞與神經保護作用. 神經系統主要由神經元細胞及神經膠細胞兩種所構成。神經元細胞主要功能為產生動作電位，以作為神經傳導。而神經膠細胞主要功能在於提供神經元營養物質、支持神經元維持其構造以及調節神經傳遞物質的清除，藉由這些功能可以達到神經保護以及調節神經傳導的作用。本次實驗使用的 C6 神經膠瘤細胞為類似星狀細胞特性的細胞株。星狀細胞為大腦神經膠細胞中分佈最多的細胞，而星狀細胞經由 gap junction 與神經元進行交互作用，並支持神經元的存活。有實驗進一步指出，將神經與神經膠細胞共同培養，並以 GSH (glutathione) 製造之抑制劑誘發氧自由基大量生成，發現促使神經膠細胞功能不全並導致周邊神經細胞大量死亡，而在單獨培養神經細胞時，則未發現此現象。顯示維持神經膠細胞功能正常對神經系統具有重要性，並且推測神經膠細胞功能不全可能為神經退化性疾病的致病機制之ㄧ (Bernardo et al., 2004)。過去研究以 C6 神經膠瘤細胞誘發神經退化模式，並以 melatonin 處理可降低細胞的程式化凋亡 (apoptosis) 以及穩定神經細胞膜。因此當神. 2.

(17) 經膠細胞的存活率上升時，可能達到神經保護的作用 (Feng and Zhang, 2004)。. 第二節粒線體與電子傳遞鏈. 粒線體為真核細胞生物能量代謝調節的主要胞器，其構造分為內膜及外膜，以及膜間隙與內部基質之部分，而藉由位於內膜上電子傳遞鏈 (electorn transfer chain, ETC) 之酵素群進行氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation) 反應作為提供細胞 ATP 的來源。而電子傳遞鏈主要由五個複合體構成，分別為 NADH dehydrogenase、succinate dehydrogenase、 ubiquinon cytochrome c oxidoreductase 、 cytochrome oxidase 及 ATP synthase，並分別被稱為 Complex I 至 V (圖 1)。粒線體 DNA (mtDNA) 主要位於粒線體基質內，哺乳類細胞之 mtDNA 之大小約為 15 至 16 kb，而人類之 mtDNA 長度為 16,569 個鹼基對，其構造為ㄧ雙股螺旋環狀 DNA 分子，其上含有可轉錄 13 個電子傳遞鏈組成蛋白質之數個次單位，以及兩個 rRNA 與 22 個 tRNA 之基因。. 3.

(18) 第三節神經退化性疾病及粒線體功能不全之相關性. 粒線體的功能異常會造成 ATP 生成降低以及影響粒線體下游功能，例如調節鈣離子的恆定，並且造成 ROS 的產生。有研究指出，神經退化性疾病的致病機轉，可能因 ATP 生成下降及 ROS 產生增加，導致粒線體受到破壞釋出 cytochrome c 而誘發細胞的程式化凋亡，進而影響神經的生理活性 (Schon and Manfredi, 2002)。Yazdani 等人研究顯示，藉由外來毒性物質的刺激可誘發神經退化疾病模式，且由結果中發現藥物處理後會造成粒線體功能異常的情形，因此推測粒線體功能異常為神經退化疾病的致病機制之ㄧ。有研究顯示， MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,4tetrahydropyridin) 為抑制電子傳遞鏈上 Complex I 的毒性物質，且會造成不可逆的巴金森氏症狀，在多巴胺細胞中堆積此毒性物質時，會經由抑制 Complex I 活性而導致神經死亡的現象 (Yazdani et al., 2006)。 Ceramide 為二級訊號傳遞物質，在細胞功能上扮演許多角色，包括增生、分化以及細胞程式凋亡 (apoptosis)。過去研究指出，外生性 ceramide 會誘發神經及神經膠細胞 apoptosis，進而神經退化發生 (Brugg et al., 1996; Mangoura and Dawson, 1998; Han et al., 2002)。於 1997 年，學者發現大鼠組織中分離出的粒線體中，ceramide 會藉由抑制粒線體 complex III 的活性而導致粒線體的功能受損 (Gudz et al., 4.

(19) 1997)。亦有研究顯示，在 β細胞中，ceramide 會影響粒線體功能並促使 pro-apoptotic factor 釋出，例如 cytochome c，而造成細胞死亡 (Veluthakal et al., 2005)。. 第四節多元不飽和脂肪酸可能達到神經保護作用之機制. 體內之游離脂肪酸 (free fatty acid, FFA)，與葡萄糖皆為細胞內重要營養來源。而 FFA 中之長鏈脂肪酸 (long chain fatty acid, LCFA) 除提供能量之外，其功能尚包括細胞磷脂質合成、影響細胞膜流動性、細胞內訊息傳導、蛋白質轉錄後修飾作用 (post-translational modulation) 及調控基因轉錄 (transcriptional) 作用。而脂肪酸能作為轉錄因子 (transcription factor) 之配體 (ligand)，藉此活化轉錄作用來調控基因的表現 (Pégorier et al., 2004)。在眾多脂肪酸型式中，以 LCFA 及其醯化衍生物 (fatty acyl-CoA) 認為最具調節基因表現的功能。其中多元不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids, PUFA) 在神經保護因子作用具有正面的效果，主要藉由細胞膜的修飾作用、影響細胞膜的流動性、調節膜上蛋白質功能及抗發炎等作用來達成 (Virmani et al., 2005)。在臨床研究報告指出，飲食中攝取飽和脂肪酸 (saturated fatty acid, SFA) 會增加阿茲海默症發生的危險機率，而攝取多元不飽和脂肪酸以及 5.

(20) 單元不飽和脂肪酸 (monounsaturated fatty acid, MUFA) 則能降低危險因子，顯示多元不飽和脂肪酸攝取能預防以及對抗阿茲海默症的發生 (Morris et al., 2003)。在動物實驗發現，給予多元不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸處理初代小腦顆粒細胞後，發現多元不飽和脂肪酸具有避免神經細胞死亡之情形 (Lauritzen et al., 2000)。亦有研究顯示，以澱粉樣蛋白 (amyloid-β) 誘發神經細胞傷害的模式下，發現預先處理 n-3 多元不飽和脂肪酸之 DHA (docosahexaenoic acid) 具有預防神經細胞趨向 apoptosis 的效果 (Florent et al., 2006)。. 第五節轉錄因子調控粒線體生合成作用. 粒線體內許多蛋白質，例如電子傳遞鏈上複合體次單位構成，主要由細胞核內基因表現，部分由 mtDNA 而來。部份核內轉錄因子所調控下游基因所表現之蛋白質會被送至粒線體，以維持粒線體之功能。主要轉錄因子可被分為兩種類型，第一種為影響細胞核中呼吸傳遞鏈之基因表現，其轉錄因子包括核呼吸因子 (Nuclear respiratory factor-1, NRF-1) 及 NRF-2 及共同活化因子 (coactivator) 之過氧化小體增生活化接收器 γ共同活化子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor γcoactivator 1 α, PGC-1α)；第二種為細胞核所表現之轉錄因子轉送至粒線體中，影響粒線 6.

(21) 體 DNA 基因表現，例如粒線體轉錄因子 A (Mitochondrial transcriptional factor A, Tfam) 。藉由此兩種途徑來影響粒線體之功能性以維持細胞之存活 (Scarpulla, 1997; Scarpulla, 2002)。在觀察神經活性與轉錄因子相關性部分，有研究顯示，以 tetrodotoxin 抑制初代神經元細胞作為體外實驗模式及移除大鼠左眼使視神經退化作為體內實驗模式。發現不論在體內及體外實驗，神經活性受到抑制後， PGC-1α、NRF-1 及 NRF-2 的基因表現都有下降的情形發生 (Liang and Wong-Riley, 2006)，因此神經細胞活性與轉錄因子確實具有相關性。. 第六節粒線體轉錄因子 A (Mitochondrial transcriptional factor A). Tfam 主要由 246 個胺基酸構成，為核染色體轉錄之蛋白質。在哺乳動物，粒線體 DNA 的轉錄及複製必須依賴 Tfam 執行，粒線體 DNA 由 heavy strand 及 light strand 兩股構成一個圓形封閉的雙股 DNA，其中位於 heavy strand origin (OH) 的地方有一個 D-loop 區，Tfam 能進行辨識並結合在 DNA 上轉錄因子結合位 (transcription factor binding site)，並刺激粒線體 DNA 複製 (Gensler et al., 2001)。過去研究顯示，Tfam 的表現受到轉錄因子 NRF-1 及 NRF-2 影響， Ongwijitwat 等人在 2006 年利用 RNA interference 抑制 NRF-2 基因表現， 7.

(22) 發現 Tfam mRNA 表現顯著降低 (Ongwijitwat et al., 2006)。亦有研究證實，位於大鼠 Tfam 的 promoter 上-205/-185 為 NRF-1 之辨識位置，當大量表現 NRF-1 時，Tfam 之轉錄活性有明顯上升的情形 (Choi et al., 2002; Piantadosi and Suliman, 2006 )。. 第七節過氧化小體增生活化接收器 γ共同活化子 -1α (Peroxisome proliferator-activated receptor γcoactivator 1 α). PGC-1α為一個具有多重功能的轉錄共同活化因子 (transcriptional coactivator)，此轉錄共同活化因子於低溫時，於小鼠之棕色脂肪組織及骨骼肌中大量表現，因此被認為與適應性生熱作用相關 (Puigserver et al., 1998)。PGC-1α會顯著增加如過氧化小體增生活化接受器 γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ , PPARγ) 等核內接受器之轉錄活性，會與啟動子上轉錄因子進行結合，並活化基因的表現。PGC-1 家族主要是存在粒線體含量比較高的組織，例如：腦、心臟、棕色脂肪組織 (Goffart et al., 2003)。目前 PGC-1 家族主要包括 PGC-1α、PGC-1β與 PGC-1-related coactivator (PRC) (Finck et al., 2006)。PGC-1α主要調控的功能有適應性生熱作用、粒線體生合成、細胞呼吸作用及 β氧化作用 (β-oxidation)。. 8.

(23) PGC-1α主要由 798 個胺基酸構成，組成 domain 包括有 N 端與核內接受器結合之部分，以及具有 RNA 辨識之 C 端，並且具有數個轉錄因子的結合位置 (Puigserver et al., 2003)。 PGC-1α可透過直接與間接之路徑影響粒線體生合成作用。直接路徑為 PGC-1α可藉由影響 NRFs 之基因表現或是與其共同作用，增加核內粒線體電子傳遞鏈相關基因之表現；而間接路徑則經由誘導 Tfam 之基因表現，而達到促進 mtDNA 之複製以及粒線體之生合成作用 (Wu et al., 1999)。 PGC-1α會影響脂肪酸於細胞內相關之代謝作用。以3T3-L1脂肪細胞之實驗模式，將PGC-1α過度表現後可促進脂肪細胞中脂肪酸氧化相關基因之mRNA表現，及促進脂肪酸氧化效率 (Vega et al., 2000)。亦有相關研究顯示，脂肪酸給予會影響PGC-1α表現。Crunkhorn等人於2007年發現，於C2C12小鼠纖維母細胞給予飽和脂肪酸之棕櫚酸後，發現PGC-1α轉錄活性受到抑制並且進一步影響到下游粒線體基因表現 (Crunkhorn et al., 2007)。亦有研究顯示，在初代肝臟細胞給予單元不飽和脂肪酸之油酸會增加PGC-1αmRNA表現 (Collins et al., 2006)。人類骨骼肌中亦有相似結果，油酸及亞麻油酸均會增加PGC-1αmRNA表現及粒線體活性 (Staiger et al., 2005)，顯示脂肪酸種類不同確實會影響到PGC-1α表現。而現今尚未有研究探討神經方面，脂肪酸是否會影響PGC-1α表現之相關研究。 9.

(24) 第三章研究目的本次研究中，以 C6 神經膠瘤細胞作為研究模式，藉由 ceramide 進行神經傷害並預先或同時給予 n-3 及 n-6 多元不飽和脂肪酸，觀察對神經膠細胞的保護作用。進一步探討此神經細胞保護作用之機制，是否藉由脂肪酸誘導相關轉錄因子，而影響粒線體相關基因之轉錄及轉譯作用，以調控粒線體功能，進而達到神經保護之作用。. 10.

(25) 第四章材料與方法. 第一節質體構築. (一) 建構 Tfam Pro-Luc 報導質體利用具有冷光酶基因 (luciferase gene) 之表現質體 pGL3-basic 作為載體 DNA，先以特定限制酶進行切割後，再利用 T4 DNA 連結酶 (T4 DNA ligase) 將大鼠全長 Tfam 啟動子序列接上此載體，形成帶有大鼠全長 Tfam 啟動子所啟動之 luciferase 基因之報導質體 DNA。首先以 C6 cells genomic DNA 為模板，設計 Tfam 啟動子之引子 (表 1)，再以 PCR 放大並萃取出 DNA，接著以 Hind III 及 Xho I 分別切割 pGL3-basic 載體 DNA 及長度約 0.5 kb 大小的 Tfam 啟動子純化萃取出的 DNA，再分別純化萃取出來，最後以 T4 DNA 連結酶接合 8 小時，形成 Tfam 啟動子之 luciferase 基因之報導質體 DNA。 (二) 建構 PGC-1αPro-Luc 報導質體利用具有螢光酶基因 (luciferase gene) 之表現質體 pGL3-basic 作為載體 DNA，先以特定限制酶進行切割後，再利用 T4 DNA 連結酶 (T4 DNA ligase) 將大鼠全長啟動子序列接上此載體，形成帶有大鼠全長 PGC-1α 啟動子所啟動之 luciferase 基因之報導質體 DNA。. 11.

(26) 首先以 C6 cells genomic DNA 為模板，設計 PGC-1α啟動子之引子 (表 1)，再以 PCR 放大並萃取出 DNA，接著以 Hind III 及 Bgl II 分別切割 pGL3-basic 載體 DNA 及長度約 1.8 kb 大小的 PGC-1α啟動子純化萃取出的 DNA，再分別純化萃取出來，最後以 T4 DNA 連結酶接合 8 小時，形成 PGC-1α啟動子之 luciferase 基因之報導質體 DNA。. 第二節勝任細胞 (competent cells) 之製備. 選取一個單一菌落之 E. coli (XL-10) 置於 1 ml LB 培養液 (Luria-Bertani medium)，以 37℃/250 rpm 搖動並培養 16 小時，再加入 30 ml LB 中，繼續在 37℃/250 rpm 培養吸光值 (O.D. 550) 達到 0.6。接著在 4℃以 4000 rpm 離心 10 分鐘，去除上清液後加入 9 ml 之 50 mM CaCl2 細菌打散後，置於冰上 15 分鐘，再以 4℃的 950 g 離心 10 分鐘，去除上清液再加入 1ml 之 50 mM CaCl22 打散細菌，於冰上 1 小時後，待轉型作用備用。. 第三節轉型作用 (transformation). 取 50-100μl 勝任細胞，加入 2-10 μl之載体 DNA 混合均勻，置於冰上 30 分鐘。接著置於 42℃之乾熱機中靜置 2 分鐘，即可塗於含有特定抗 12.

(27) 生素之 LB 洋菜培養基上，於 37℃培養箱中培養 12 到 16 個小時。. 第四節質體 DNA 之萃取. 選取單一菌落於含特定抗生素之 50 ml LB 培養液中，以 37℃/250 rpm 搖動並培養 16 小時，將菌液在 4℃以 950 g 離心 10 分鐘，去除上清液，加入 1 ml Sulution I，將細胞均勻打散後靜置室溫 5 分鐘，加入 2 ml Solution II，輕微搖晃後置冰上 10 分鐘，最後加入 1.5 ml Solution III，輕微搖晃後置冰上 10 分鐘。接著在 4℃以 7000 g 離心 20 分鐘，將上清液取出，加入兩倍體積 100％酒精，放置於 -80℃冰箱靜置 15 分鐘，在 4℃ 以 7000 g 離心 20 分鐘，小心去除上清液，將 DNA 於室溫中晾乾。以 500 μl的滅菌水溶解 DNA 沉澱物，並加入 RNase A (最終濃度 100 ug/ml) 於 37℃作用 1 小時，再加入等體積之 pheonl/CHCl3，以震盪機均勻震盪後，以室溫的 7000 g 離心 20 分鐘，小心取出上層澄清體，並重複此步驟兩次。加入兩倍體積 100％酒精，置於 -80℃冰箱沉澱 15 分鐘，在 4℃以 7000 g 離心 20 分鐘，小心去除上清液後，將 DNA 於室溫中晾乾。最後以滅菌水溶解 DNA 沉澱物，即得到質體 DNA。. 13.

(28) 第五節細胞培養. (一) 細胞株本次實驗使用細胞為 C6 神經膠瘤細胞株 (C6 glioma cell) ，購自食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心， ATCC® 編號為 CCL-1 07 ™。 (二) 培養條件生長用培養基為 Du l be c c o’ s modi f i e d eagle medium (DMEM) (GibcoBRL, Inc., Japan) 和 10% fetal bovine serum (FBS) (GibcoBRL, Inc., Japan) 添加 0.04 M sodium bicarbonate 、 1% penicillin-streptomycine (GibcoBRL, Inc., Japan) 及 0.014 M HEPES，並將其 pH 值調為 7.4。在 37℃，5% CO2 之條件下培養。. 第六節藥劑處理. (一) 脂肪酸本研究使用脂肪酸為二十碳四烯酸鈉鹽 (Arachidonic acid sodium salt；C20:4 n-6) 及二十碳五烯酸鈉鹽 (Eicosapentaenoic acid sodium salt；. C20:5 n-3)，購自 Sigma (A8798, E6627; Sigma-Aldrich, St Louis, USA)，形 14.

(29) 態皆為白色之粉末狀，儲存於-20℃。以酒精作為溶劑將脂肪酸配製成濃度 10 mM，再就實驗所需脂肪酸濃度，分別不同體積加入培養基內配置而成。 (二) Ceramide 使用神經醯胺 (N-acetyl sphingosine, C2 ceramide) 培養細胞，誘導成神經退化的模式。購自 Sigma (A7191; Sigma-Aldrich, St Louis, USA)，形態為白色之粉末狀，儲存於-20℃。以酒精作為溶劑將 ceramide 配製成濃度 10 mM，將其加入培養基內以待處理時使用。. 第七節實驗組別. (一) 控制組 C6 細胞給予酒精後，進行細胞培養 24 小時。 (二) 負控制組 C6 給予 ceramide 後，進行細胞培養 24 小時。 (三) 正控制組 C6 細胞給予二十碳四烯酸及二十碳五烯酸後，進行細胞培養 24 小時。. 15.

(30) (四) Pre-treatment 組 C6 細胞給予二十碳四烯酸及二十碳五烯酸不同劑量，進行 24 小時細胞培養，再移除脂肪酸並給予 ceramide 進行細胞傷害，培養 24 小時。 (五) Co-treatment 組 C6 細胞給予二十碳四烯酸及二十碳五烯酸不同劑量，同時進行 ceramide 處理，培養 24 小時。. 第八節細胞存活率測試. 本實驗以. MTS. (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-. methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,. inner. salts;. MTS). (CellTiter96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay; Promega Corporation, Madison, USA) 試劑進行藥劑處理後細胞存活之影響。取 96 孔試盤，調整細胞濃度為 2.5×103 細胞/孔，並且各加入 200 μl 之培養基。先將細胞預培養 24 小時，之後除去培養基，處理含藥劑之培養基培養，去除培養基後，每孔各加入 100 μl PBS 清洗細胞兩次。將 PBS 移除後，每孔加入 100 μl 培養液及 20 μl MTS 試劑。將細胞於 37℃下繼續培養 2 小時後，使用 492 nm 波長測定每孔吸光值。. 16.

(31) 第九節細胞之短暫轉染 (transient transfection). 使用 6-well 孔盤，每孔皆植入等量之細胞數，預培養 24 小時後，利用 SuperFect transfection reagent (Qiagen, USA) 進行短暫轉染。將欲轉染之質體加入 100 μl 之不含血清培養基中，再加入 10 μl SuperFect transfection reagent 並輕微搖晃後，以震盪機震盪 10 秒鐘，於室溫靜置 15 分鐘後，最後加入細胞培養基中培養，在 37℃，5% CO2 之條件下培養 2 小時，將培養基去除並以 PBS 清洗細胞，處理含藥劑之培養基培養後，即可收集細胞並萃取其蛋白質以進行報導基因分析。. 第十節冷光酶報導基因分析. 將已轉染之細胞以 PBS 清洗兩次後，加入 trypsin-EDTA 300 μl 取下細胞至微量離心管中，在 4℃以 60 g 離心 5 分鐘，移除上清液，再加入 1 ml PBS 打散細胞並清洗，再以 4℃轉速 60 g 離心 5 分鐘，再 PBS 移除，重複此步驟兩次，以 Dual-LuciferaseTM reporter assay system (Promega, Madison, USA) 進行分析。將每管細胞沉澱物加入 100 μl 之 1X Passive Lysis Buffer 均勻打散，在室溫下混勻作用 20 分鐘後，以 4℃轉速 7000 g 離心 20 分鐘，收集上清液至新的微量離心管中，此為蛋白質萃取液。 17.

(32) 取 20 μl 之蛋白質萃取液於黑色不透光之 96 well 孔盤中，再加入 40 μl 之 Luciferase Assay Reagent® (LARII)，以 Victor2TM 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) 測定冷光強度，此為分析 Firefly luciferase 活性。分析完畢後，再加入 40 μl 之 Stop & Glo® Reagent，同樣置於機器中判定冷光強度，此為分析 Renilla luciferase 之活性，並以此數值作為 internal control。. 第十一節 RNA 萃取. 使用 6-well 孔盤，每孔皆植入等量之細胞數，預培養 24 小時後，以藥劑進行處理，培養於 37℃培養箱中。之後去除含有處理藥劑之培養基，加入 500 μl TRIzol reagent (Invitrogen Corpoation, California, USA)搖晃，再取到新的微量離心管中，室溫靜置 5 分鐘。加入 100 μl chloroform 搖晃約 15 秒，可看到溶易呈現渾濁的粉紅色，在 4℃下以 8500 g 離心 15 分鐘，此時溶液分成三層，小心取出上清液移至新的微量離心管中。加入等倍體積之 isopropanol，搖晃數下使其均勻，於室溫下靜置 10 分鐘，在 4℃下以 8500 g 離心 10 分鐘，將上清液去除後，加入 1 ml 75％酒精清洗沉澱物，再以 4400 g 離心 5 分鐘，此步驟重複兩次，將上清去除後，於室溫下晾乾。加入 20 μl 之 DEPC-water (diethylpyrocarbonate) 溶解 RNA。 18.

(33) 使用分光光度計 (UV1100 photometer; WPA, UK) 測定 RNA 濃度及純度。. 第十二節反轉錄作用. 取 2 μg RNA 加入 0.5 μl Oligo dT (Protech Technology, Inc., Taipei, Taiwan)，以 DEPC 水補至總體積 13.5 μl，於 70℃作用 10 分鐘後，立刻置於冰上 10 分鐘。之後加入 4 μl 2.5 mM dNTP (Protech Technology, Inc., Taipei, Taiwan)，2 μl 10X MMLV RT buffer 及 0.5 μl 10 U/ul MMLV RTase (Epicentre biotechnologies, Wisconsin, USA)，於 37℃作用ㄧ小時，再於 95℃作用 5 分鐘，接著於 4℃作用 5 分鐘停止反轉錄酶活性，保存於 -20℃ 以備用。. 第十三節同步定量反轉錄聚合酶連鎖反應 (Real-time reverse transcriptional polymerase chain reaction, real-time RT-PCR). 本實驗使用 LightCycler 2.0 System (Roche Diagnostics Ltd., Basel Switzerland) 儀器，利用 LightCycler FastStart NA Master PLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics Ltd., Basel Switzerland) 之試劑組合，監測聚合酶連鎖反應過程中基因複製之情形。 19.

(34) 取 2 μl cDNA 樣品，分別加入 0.5 μl 之 forward 及 reverse 引子 (表 1) 與 2 μl Master Mix (Roche Diagnostics Ltd., Basel Switzerland)，最後以無菌水將總體積補至 10 μl。PCR 反應條件設定：第一週期為 95℃ Denaturation 10 分鐘；第二週期以 95℃ Denaturation 10 秒，60℃ Annealing 5 秒及 72℃ Extention 10 秒為一循環，依待測基因不同而進行 40 至 50 個循環；第三週期以 95℃作用 0 秒，45℃作用 15 秒及緩慢升溫 (0.1℃/秒)至 95℃，於升溫過程中持續偵測螢光反應；第四週期設定 40℃進行冷卻。. 第十四節細胞蛋白質之萃取. 將細胞收集至微量離心管中，加入適量 RIPA lysis buffer (含 1M Tri-Cl (PH=7.5), 0.5M NaCl, 0.5M EDTA (pH=8.0), 10% SDS, 10% NP40, 10％ DOS, miniQ-H2O 以及 1％ protein inhibitors)，震盪細胞使之均勻，至於冰上 15 分鐘。之後以 4℃轉速 8500 g 離心 30 分鐘，取出上清液至新的微量離心管，即為總蛋白質萃取液，儲存於-20℃備用。. 第十五節蛋白質之定量. 首先將已知濃度 2 mg/ml BSA (bovine serum albumin) (Pierce 20.

(35) Biotechnology, Rockford, USA) 以 PBS 連續兩倍稀釋 6 次，使得標準溶液範圍介於 1- 0.031 mg/ml，以此標準溶液做出標準曲線。將分裝出來的 10 μl 蛋白質萃取液以 PBS 連續五倍稀釋 6 次。定量蛋白質系統，使用 BCA kit (Pierce Biotechnology, Rockford, USA) 所附 A 溶液與 B 溶液以 50：1 的比例混合搖晃，取 10 μl 蛋白質萃取液稀釋液加入 200 μl 的 A 加 B 混合液。之後以 55℃加熱 30 分鐘，使用 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, VERSAmax) 在波長 595 nm 下測定溶液吸光值，以推算蛋白質的正確濃度。. 第十六節西方點墨法分析. 配製 10% SDS-PAGE (Resolving gel：2.7 ml acrylamide：bis-acryamide = 29%：1%, 2.5 ml Tris-HCl (pH=8.8), 100 μl 10% SDS, 4.6 ml ddH2O, 100 μl 10% APS (ammonium persulfate), 6μlTEMED；Stacking gel：0.33 ml acrylamide：bis-acryamide = 29%：1%, 0.16 ml Tris-HCl (pH=6.8), 20 μl 10% SDS, 2.8 ml ddH2O, 20 μl 10% APS, 2μlTEMED)。取定量之蛋白質樣品加入 2X 樣品緩衝液 (sample buffer)於 97℃煮沸 3 分鐘，置於冰上急速冷卻，個別注入 10% SDS-PAGE well 中，以 60 volt 30 分鐘，之後 90 volt 3 小時條件下進行電泳，電泳完成後進行蛋白質轉漬。將 PVDF membrame 21.

(36) (polyvinyldene diflouride membrane, Amersham Pharmacia) 以 methanol 浸潤，再將 PVDF membrane 置於 SDS-PAGE gel 上，再將含有轉漬緩衝液 10% 10X electrophoresis buffer (250 mM Tris-base, 1.92 M Glycine, 1％ SDS) 與 20% 甲醇的轉印槽中以 30 volt, 12 小時，轉漬蛋白質到 PVDF membrane 上，浸泡於含 5% skim milk (Becton, Dickison and Company, Franklin Lakes, USA) 及 5% BSA 之 TBS blocking buffer (1 M Tris-HCl, 100 mM NaCl) 作用 1 小時。去除 blocking buffer，以 TBST buffer (1 M Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Tween-20) 清洗三次，再以 TBS buffer 清洗三次，每次 10 分鐘。再以第一級抗體於室溫進行雜合 2 小時 (表 2)，之後以 TBST buffer 清洗三次，再以 TBS buffer 清洗三次，每次 10 分鐘。接著以第二級抗體於室溫進行雜合 1 小時，之後以 TBST buffer 清洗三次，再以 TBS buffer 清洗三次，每次 10 分鐘。以 Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent (Santa Crutz, USA) 作用 1 分鐘之後，曝光於 X-ray film (Fuji film, Japan) 數分鐘，沖片顯影後即可觀察，利用 Image-Pro Plus 4.5 進行影像分析，分別計算密度 (density)。. 第十七節流式細胞儀分析. 以 6-well 孔盤，每 well 植入等量之細胞後，預培養 24 小時後，以藥 22.

(37) 劑進行處理，培養於 37℃培養箱中。之後去除含有處理藥劑之培養基，以 PBS 清洗後，將細胞收下並取至微量離心管中，在 4℃以 60 g 離心 5 分鐘，移除上清液，再加入 1 ml 之 PBS 打散並清洗細胞後，在 4℃以 60 g 離心 5 分鐘，再加入含有 50 uM 之 JC-1 ( 5, 5’ , 6, 6’ -Tetrachloro -1, 1’ , 3, 3’ -tetraethyl-imidacarbocyanine iodide) staining buffer，置於 37℃作用 20 分鐘後，再以 4℃以 60 g 離心 5 分鐘，去除上清液，再加入 1 ml 之 PBS 將 pellet 打散並移至康氏管 (Falcon tube)中，置於冰上並避光，利用 FACSTMCalibur system 觀察粒線體膜電位之變化，以 CellQuest software 分析實驗結果。. 第十八節統計分析. 數值以 mean ± SD 表示，SAS 軟體進行單因子變異數分析，並以 Fisher’ st teat 進行統計分析，當 p <0.05 具統計上之意義。. 23.

(38) 第五章實驗結果. 第一節對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響. (ㄧ) Ceramide 處理對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響以 50 μM 之 ceramide 處理 C6 神經膠瘤細胞，經 24 小時後觀察細胞型態之變化。由結果發現，ceramide 處理之組別，其細胞型態與控制組 (圖 6A) 相較下，發現細胞生長狀況呈現突觸較短，且細胞輪廓趨向於圓形而非控制組的紡錘狀型態，細胞內有空洞產生 (圖 6B)，顯示 C6 神經膠瘤細胞受到傷害的情形。 (二) 多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響以 25 至 2 00μM 之二十碳五烯酸及二十碳四烯酸處理 C6 神經膠瘤細胞，經 24 小時後觀察細胞型態之變化。以二十碳五烯酸處理結果發現，在 25 至 1 00μM 處理 24 小時後，其細胞形態與控制組較為相似，皆為型態完整之紡錘狀 (圖 7A, B, C, D)，以 20 0μM 處理之組別，細胞皆有明顯死亡的現象 (圖 7E)。以二十碳四烯酸處理結果部份，在 25 至 5 0μM 處理 24 小時後，細胞形態與控制組相似 (圖 8A, B, C)。以濃度 1 0 0μM 處理，細胞內有空洞 24.

(39) 的情形 (圖 8D)，且濃度 2 0 0μM 處理時，細胞亦有明顯死亡的現象 (圖 8E)。 (三) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響預先處理 25 至 2 00μM 之二十碳五烯酸處理 C6 神經膠瘤細胞，經 24 小時後觀察，再以 ceramide 處理 24 小時，進行觀察。預先給予二十碳五烯酸之結果發現，以 25 至 10 0μM 預先處理，其細胞形態與控制組較為相似，皆為完整之紡錘狀 (圖 9A, B, C, D)。以 200 μM 處理，細胞則有明顯死亡的情形 (圖 9E)。 (四) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞型態之影響細胞給予二十碳五烯酸不同劑量，同時進行 ceramide 處理，培養 24 小時，進行觀察。同時處理二十碳五烯酸之結果發現，以 25 至 50μM 二十碳五烯酸處理後，其細胞形態與控制組較為相似 (圖 10A, B, C)。以 10 0μM 二十碳五烯酸處理則發現，細胞皆有明顯的空泡產生且趨於死亡的現象 (圖 10D)，當濃度為 2 0 0μM 處理時，細胞有明顯死亡之情形 (圖 10E)。. 25.

(40) 第二節對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響. 以細胞存活率測定 ceramide 以及多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞毒性，並且觀察預先或同時處理多元不飽和脂肪酸是否能預防由 ceramide 所造成之細胞傷害。 (ㄧ) Ceramide 處理對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響以 10 至 100μM 之 ceramide 處理 C6 神經膠瘤細胞，培養 24 小時後觀察其細胞存活率。由測試結果中發現，其控制組、1 0μM、20μM、50μM、1 00μM 之吸光值數據分別為 1.06 ± 0.03、1.04 ± 0.04、0.61 ± 0.14、0.51 ± 0.13、0.08 ± 0.34 (圖 11)。進行統計分析發現，以 1 0μM 處理與控制組相較無顯著差異。但以 20 至 1 00μM 處理時，其細胞存活率皆顯著低於控制組。在處理 5 0μM 之 ceramide 時，自細胞型態可觀察到細胞傷害發生且存活率顯著降低，因此均以 5 0μM ceramide 作為神經細胞傷害之濃度。 (二) 多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響以 25 至 4 00μM 之多元不飽和脂肪酸濃度處理 C6 神經膠瘤細胞，培養 24 小時後觀察其細胞存活率。經二十碳五烯酸處理後測定，其控制組、2 5μM、5 0μM、10 0μM、 20 0μM、4 00μM 之吸光值數據分別為 1.16 ± 0.11、1.45 ± 0.13、1.61 ± 26.

(41) 0.04、1.47 ± 0.15、0.10 ± 0.05、-0.10 ± 0.01 (圖 12)。由結果顯示給予 25 μM、5 0μM、1 00μM 之二十碳五烯酸存活率顯著高於控制組，顯示濃度 25 至 100 μM 之二十碳五烯酸有助於細胞之生長。然而處理 200 至 400 μM，細胞存活率則有明顯下降的趨勢，表示高濃度之二十碳五烯酸會導致細胞死亡。經二十碳四烯酸處理後測定，其控制組、2 5μM、5 0μM、10 0μM、 20 0μM、4 00μM 之吸光值數據分別為 1.29 ± 0.11、1.32 ± 0.07、1.37 ± 0.09、1.51 ± 0.20、0.05 ± 0.01、-0.08 ± 0.07 (圖 12)。結果顯示細胞處理 25 至 1 00μM 之二十碳四烯酸，其存活率與控制組無顯著差異。而處理 200 至 40 0μM 之濃度結果與二十碳五烯酸相似，存活率皆顯著低於控制組。在相同濃度而不同脂肪酸處理下，以統計分析比較後發現，25μM、 50μM、1 0 0μM 之二十碳五烯酸組之細胞存活率顯著高於二十碳四烯酸組。 (三) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞存活率之影響先給予 25 至 2 0 0μM 之多元不飽和脂肪酸處理 C6 細胞 24 小時後，再給予 ceramide 24 小時後，分析細胞存活率。預先處理二十碳五烯酸之組別，其控制組、ceramide 組、2 5μM、50 μM、1 0 0μM、20 0μM 之吸光值數值分別為 0.63 ± 0.06、0.39 ± 0.07、0.92 27.

(42) ± 0.06、0.72 ± 0.08、0.45 ± 0.04、-0.01 ± 0.00 (圖 13)。由結果發現，ceramide 組存活率明顯低於控制組，而預先處理 25 至 50 μM 之二十碳五烯酸則顯著高於 ceramide 組，顯示預先處理低濃度之二十碳五烯酸可增加或維持細胞之存活率。預先處理 2 0 0 μM 之二十碳五烯酸則細胞顯著低於 ceramide 組。觀察預先處理二十碳四烯酸部分，其控制組、ceramide 組、2 5μM、 50μM、1 00μM、2 00μM 之吸光值數值分別為 0.92 ± 0.12、0.68 ± 0.09、 1.01 ± 0.07、0.21 ± 0.05、0.47 ± 0.04、0.07 ± 0.01 (圖 13)。由結果顯示， ceramide 組存活率顯著降低，而預處理 2 5μM 存活率顯著高於 ceramide 組且達到相當於控制組之存活率。而 50 至 2 0 0μM 之組別存活率顯著低於 ceramide 組。表示預先給予 2 5μM 之二十碳四烯酸可能達到保護作用。在相同濃度而不同脂肪酸處理，可發現給予 2 5μM、5 0μM、1 0 0μM 之二十碳五烯酸細胞存活率顯著高於二十碳四烯酸組，顯示二十碳五烯酸之保護效果較二十碳四烯酸為佳。 (四) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞細胞存活率之影響細胞給予多元不飽和脂肪酸數種濃度，同時進行 ceramide 處理，培養 24 小時，測定細胞存活率。首先觀察二十碳五烯酸組別之部分，其控制組、ceramide 組、2 5μM、 50μM、1 00μM、2 00μM 之吸光值數值分別為 0.73 ± 0.07、0.43 ± 0.08、 28.

(43) 0.66 ± 0.04、0.58 ± 0.08、0.51 ± 0.05、-0.02 ± 0.00 (圖 14)。由結果發現， ceramide 組存活率明顯下降，當給予 2 5μM 之二十碳五烯酸則顯著高於 ceramide 組且回復至控制組之存活率程度。雖然在 5 0μM 部份發現其存活率顯著低於控制組，但與 ceramide 組相較仍具有統計差異。處理二十碳四烯酸組別之組別，其控制組、ceramide 組、2 5μM、50 μM、1 0 0μM、20 0μM 之吸光值數值分別為 0.96 ± 0.05、0.43 ± 0.08、0.93 ± 0.06、0.76 ± 0.07、0.62 ± 0.09、-0.01 ± 0.00 (圖 14)。經統計分析顯示， ceramide 組存活率明顯下降，而不同濃度之二十碳四烯酸組存活率則與二十碳五烯酸組有相似結果。相同濃度而不同脂肪酸處理，發現二十碳五烯酸與二十碳四烯酸組無顯著影響。顯示以細胞存活率觀察，給予二十碳五烯酸與二十碳四烯酸並同時處理 ceramide，其保護作用兩者效果並無差異。. 29.

(44) 第三節觀察 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響. 以 JC-1 螢光染劑觀察 ceramide 以及多元不飽和脂肪酸對 C6 細胞之膜電位影響，並以膜電位的降低與否判斷粒線體之功能是否異常。 (一) 給予 ceramide 對於 C6 神經膠瘤細胞膜電位之影響觀察 ceramide 處理之結果，並以 CCCP (Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone) 做為負控制組，定量後顯示控制組、負控制組、 ceramide 組數值分別為 0.73 ± 0.05、0.03 ± 0.00、0.52 ± 0.11 (圖 15D)。發現給予 CCCP 處理後，粒線體膜電位顯著的喪失，而處理 ceramide 組亦有明顯下降，表示給予 ceramide 確實影響粒線體之功能。 (二) 多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響單獨投予多元不飽和脂肪酸，在二十碳五烯酸方面，處理 25 及 50 μM 培養 24 小時其粒線體膜電位，與控制組相較不具顯著差異 (圖 16D)，顯示投予二十碳五烯酸不影響粒線體之功能。而處理二十碳四烯酸觀察其膜電位之結果，則與二十碳五烯酸之結果相似 (圖 17D)。 (三) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響觀察預先處理二十碳五烯酸組之粒線體膜電位結果，其濃度 25 及 50 μM 與控制組相較分別為 0.96 ± 0.51、1.21 ± 0.16 倍 (圖 18)。顯示當處理二十碳五烯酸濃度 2 5μM，其膜電位與 ceramide 組相較無顯著差異，但是具有上升的趨勢；而濃度 5 0μM 其膜電位可維持與控制組相似結果。 30.

(45) 處理二十碳四烯酸粒線體膜電位之結果，其濃度 25 及 50μM 與控制組相較分別為 0.77 ± 0.08、0.82 ± 0.14 倍 (圖 18)。發現處理二十碳四烯酸濃度 25 或 50μM，其膜電位與 ceramide 組無顯著差異，但是皆有上升的趨勢。 (四) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞粒線體膜電位之影響投予 ceramide 同時處理二十碳五烯酸之粒線體膜電位結果，其濃度 25 及 5 0μM 與控制組相較分別為 0.80 ± 0.10、0.90 ± 0.28 倍 (圖 19)。由結果顯示處理二十碳五烯酸濃度 2 5μM，與控制組無顯著差異；而投予濃度 5 0μM 其膜電位與 ceramide 組無顯著差異，但具有上升的趨勢。觀察處理二十碳四烯酸之結果，其濃度 25 及 5 0μM 與控制組相較分別為 0.58 ± 0.01、0.32 ± 0.05 倍 (圖 19)。發現處理二十碳四烯酸濃度 25 μM 其膜電位與 ceramide 組無顯著差異；濃度 5 0μM 其膜電位則顯著低於 ceramide 組。. 31.

(46) 第四節觀察 C6 神經膠瘤細胞對粒線體相關轉錄因子基因表現之影響. 由以上實驗結果得知多元不飽合脂肪酸處理可降低粒線體膜電位的喪失，因此進一步探討多元不飽和脂肪酸是否會影響上游調控粒線體之轉錄因子 Tfam 及 PGC-1α啟動子之轉錄活性及基因表現之影響。 (一) 投予多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子基因表現影響觀察處理多元不飽和脂肪酸 24 小時，並以轉染 pGL3-basic 做為負控制組。藉由報導基因分析，負控制組之 luciferase 活性為控制組之 0.01 ± 0.35 倍。首先觀察 PGC-1α啟動子活性結果，在二十碳五烯酸組之 luciferase 活性部分發現 2 5μM、5 0μM、1 0 0μM 分別為控制組 1.56 ± 0.20、1.60 ± 0.21、1.83 ± 0.21 倍 (圖 20A)，顯示給予二十碳五烯酸處理其 PGC-1α啟動子活性皆顯著高於控制組。在二十碳四烯酸組之部分亦發現 2 5μM、 50μM、1 00μM 分別為控制組 1.75 ± 0.20、1.69 ± 0.21、1.62 ± 0.21 倍 (圖 20A)，其結果與二十碳五烯酸組相似。在 Tfam 啟動子活性結果方面，投予二十碳五烯酸之 luciferase 活性， 25μM、5 0μM、1 00μM 則分別為控制組 2.19 ± 0.37、1.88 ± 0.19、1.72 ± 0.22 倍 (圖 20B)，其 Tfam 啟動子活性皆顯著高於控制組。在二十碳四烯酸組之結果方面，顯示 2 5μM、5 0μM、1 0 0μM 其 luciferase 活性相較於控制組分別為 1.84 ± 0.16、2.11 ± 0.06、1.06 ± 0.08 32.

(47) 倍 (圖 20B)，由結果得知 2 5μM、5 0μM 組別顯著高於控制組，而 1 0 0μM 則無顯著差異。 (二) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子基因表現之影響將細胞轉染 PGC-1α之報導質體，再預先處理多元不飽和脂肪酸，之後進行 ceramide 傷害。結果顯示 ceramide 組與控制組相較為 1.15 ± 0.20 倍，且無顯著差異 (圖 21A)，顯示處理 ceramide 不影響 PGC-1α啟動子之活性。而預處理二十碳五烯酸之組別，在預先處理 2 5μM 與控制組相較為 1.32 ± 0.11 倍，與控制組相較無顯著差異。而預先處理 5 0μM、100 μM 為控制組之 1.58 ± 0.20、2.52 ± 0.18 倍 (圖 21A)，表示其 PGC-1α轉錄活性顯著高於控制組。接著觀察二十碳四烯酸組之結果，發現預先處理 25μM、50μM 為控制組之 1.11 ± 0.09、1.49 ± 0.05 倍 (圖 21A)，與控制組皆無顯著差異。而預先處理 1 0 0μM 為控制組之 1.82 ± 0.20，且 PGC-1α轉錄活性顯著高於控制組。利用細胞轉染 Tfam 啟動子之報導質體，再預先處理多元不飽和脂肪酸 24 小時。由結果發現，ceramide 組與控制組相較為 0.53 ± 0.28 倍，但無顯著差異 (圖 21B)，顯示 ceramide 之傷害不影響 Tfam 啟動子之活性。而預先處理二十碳五烯酸之組別，顯示預先處理 2 5μM、50μM 時， luciferase 活性為控制組之 8.58 ± 0.24、11.03 ± 0.46 倍 (圖 21B)，則顯示其 Tfam 之轉錄活性明顯高於控制組。在二十碳四烯酸組之結果顯示，預 33.

(48) 先處理 2 5μM、5 0μM、10 0μM 之 luciferase 活性與控制組相較分別為 2.60 ± 0.19、2.92 ± 0.45、2.74 ± 0.40 倍 (圖 21B)，且 Tfam 啟動子活性皆顯著高於控制組。在 Tfam 蛋白質表現結果部分，結果顯示 ceramide 組與控制組相較為 1.03 ± 0.59 倍 (圖 21C)，且無顯著差異。觀察預處理二十碳五烯酸組發現，預先處理 5 0μM 其蛋白質表現量為控制組之 3.63 ± 0.36 倍。而濃度 25μM 與 10 0μM 之二十碳五烯酸 (圖 21C)，與控制組相較雖無顯著差異但具有上升的趨勢。另外再二十碳四烯酸組之結果，預處理濃度 2 5μM 與 50μM 其蛋白質表現為控制組之 1.72 ± 0.54、1.90 ± 0.29 倍，與控制組相較雖無顯著差異但亦有上升的情形。然而給予 1 0 0μM 之二十碳四烯酸與控制組無顯著差異 (圖 21C)。 (三) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子基因表現之影響觀察 PGC-1α蛋白質表現之結果，發現 ceramide 組與控制組相較為 0.79 ± 0.34 倍 (圖 22A)。而同時投予二十碳五烯酸組之結果，顯示處理 25μM、50μM、1 0 0μM 蛋白質表現分別為控制組之 5.86 ± 1.18、6.06 ± 1.33、5.65 ± 0.96 倍 (圖 22A)。另外二十碳四烯酸組之結果，發現處理 25μM、5 0μM、1 00μM 蛋白質表現分別為控制組之 2.03 ± 1.35、1.09 ±0.97、1.46 ± 1.17 倍 (圖 22A)。接著觀察 Tfam 啟動子之報導質體部分，首先觀察二十碳五烯酸組之 34.

(49) 結果，發現處理 2 5μM、5 0μM、1 00μM l u c i f e r a s e活性為控制組之 4.58 ± 0.04、3.76 ± 0.09、1.85 ± 0.37 倍 (圖 22B)，表示二十碳五烯酸之介入其 Tfam 之轉錄活性顯著高於控制組。在二十碳四烯酸組之結果，投予 25 μM、50μM 其 luciferase 活性顯著增加為控制組之 3.98 ± 0.14、2.73 ± 0.25 倍 (圖 22B)。顯示其 Tfam 之轉錄活性較高於控制組之情形。而 100 μM 之二十碳四烯酸處理後，與控制組相較無顯著差異 (圖 22B)。. 35.

(50) 第五節觀察 C6 神經膠瘤細胞對粒線體基因之影響. 由於先前研究顯示，Tfam 為調控粒線體 DNA 之重要轉錄因子 (Gensler et al., 2001)，而 PGC-1α亦會調控細胞核中所表現之粒線體蛋白質表現。由上述實驗結果得知投予多元不飽和脂肪酸其 Tfam 及 PGC-1α 之轉錄活性皆受到活化，因此進一步觀察細胞核中粒線體蛋白質及粒線體 DNA 之基因表現情形。 (一) Pre-treatment 對 C6 神經膠瘤細胞粒線體基因表現之影響 ND6 (NADH dehydrogenase subunit 6) 之基因序列位於粒線體 DNA 上，因此藉由 ND6 之因表現顯示其粒線體 DNA 之基因表現情形。在 ND6 mRNA 表現，預先處理二十碳四烯酸之結果部份，投予 25 μM、5 0μM 濃度下，其基因表現與控制組相較分別為 7.74 ± 0.39、5.53 ± 0.36 倍 (圖 23)，且顯著高於 ceramide 組。但濃度 100 μM 之 ND6 表現則為控制組 1.85 ± 0.34 倍 (圖 23)，與 ceramide 組相較則無顯著差異。預先處理二十碳四烯酸之基因表現部分，以 25 μM、50μM、100 μM 之濃度處理，其 ND6 mRNA 表現量相較於控制組分別為 3.21 ± 0.31、0.60 ± 0.08、0.47 ± 0.01 倍 (圖 23)，各組表現並無統計上之差異。觀察細胞核所表現之 complex I 之 NDUFA9 (NADH αsubconplex, 9) 粒線體蛋白質表現，在 ceramide 組蛋白質表現為控制組之 0.69 ± 0.16 倍 (圖 24)，且表現量有降低但無統計差異。預處理二十碳五烯酸組之結果， 36.

(51) 發現濃度 25 及 50 μM 時，其蛋白質表現與控制組相較分別為 1.88 ± 0.86、 1.69 ± 0.39 倍 (圖 24)，雖然與 ceramide 組相較無顯著差異，但具有上升之趨勢。當濃度 1 0 0μM時，其蛋白質表現則為控制組之 2.23 ± 0.82 倍 (圖 24)，且有顯著增加之情形。預處理二十碳四烯酸組之部份，觀察到濃度 25μM、50μM 及 10 0μM，其蛋白質表現與控制組相較分別為 1.33 ± 0.76、1.40 ± 0.53、1.31 ± 0.53 倍 (圖 24)，與 ceramide 組相較皆無顯著差異。 (二) Co-treatment 對 C6 神經膠瘤細胞粒線體基因表現之影響將脂肪酸與 ceramide 同時處理觀察 ND6 mRNA 表現，觀察二十碳五烯酸之結果部份，以濃度 2 5μM、50μM 處理，發現 ND6 mRNA 表現量相較於控制組分別為 1.60 ± 0.04、0.83 ± 0.11 倍 (圖 24)，且與 ceramide 組相較有明顯增加 ND6 mRNA 表現。但濃度 100 μM 之 ND6 表現為控制組 0.78 ± 0.20 倍 (圖 24)，雖然與 ceramide 組相較無顯著差異，但具有上升的趨勢。處理二十碳四烯酸之基因表現部分，以 2 5μM、50 μM 之濃度處理，其 ND6 mRNA 表現量分別為控制組 1.10 ± 0.08、1.11 ± 0.03 倍 (圖 25)，且顯著高於 ceramide 組。但處理二十碳四烯酸濃度 100 μM 為控制組 0.34 ± 0.10 倍 (圖 25)，與 ceramide 組相較則無顯著差異。在細胞核所表現之 complex II 之 flavoprotein (succinate-ubiquinone 37.

(52) oxidoreductase) 粒線體蛋白質表現，在 ceramide 組蛋白質表現為控制組之 1.03 ± 0.38 倍 (圖 26)。同時處理二十碳五烯酸組之結果，發現濃度 25 μM、5 0μM、1 0 0μM 時，其蛋白質表現與控制組相較分別為 1.30 ± 0.38、 1.96 ± 0.84、2.24 ± 1.06 倍 (圖 26)。同時介入 AA 組之部份，觀察到濃度 25μM、5 0μM 及 1 00μM，其蛋白質表現與控制組相較分別為 1.77 ± 0.79、1.21 ± 0.72、1.26 ± 0.88 倍 (圖 26)。. 38.

(53) 第六章討論第一節處理 ceramide 對於傷害 C6 神經膠瘤細胞之影響觀察 C6 神經膠瘤細胞經由 5 0μM ceramide 處理 24 小時後其型態有明顯變化，與控制組相較可發現細胞突觸有較短的情形 (圖 6)；其細胞存活率以及粒線體膜電位與控制組相較，皆有下降之情形 (圖 11, 15D)，顯示投予濃度 5 0μM 之 ceramide，細胞明顯受到傷害且會造成粒線體功能受損。先前有學者探討 ceramide 會誘發粒線體功能異常之影響，同樣投予 50μM 濃度處理 24 小時，結果發現給予 ceramide 會造成膜電位明顯下降，且 cytochrome c 自粒線體釋出至細胞質中堆積，並進一步造成細胞之程式化凋亡 (Veluthakal et al., 2005)。亦有研究利用神經分化之 PC12 細胞，以 2 5μM c e r a mi de處理後，利用光學顯微鏡觀察到其細胞之突觸有消失且細胞有變圓型且皺縮的情形，而此研究與本次實驗有相似性的結果 (France-Lanord et al., 1997)。. 39.

(54) 第二節給予多元不飽和脂肪酸對於 C6 神經膠瘤細胞之影響. 觀察給予多元不飽和脂肪酸 24 小時之細胞型態，發現處理 25 至 100 μM 二十碳五烯酸 24 小時後，其細胞形態與控制組較為相似，且細胞存活率有明顯上升，顯示 25 至 1 0 0μM 之 n-3 脂肪酸可明顯增加細胞生長速率 (圖 12)。在二十碳四烯酸之部分，當投予 25 至 5 0μM，其細胞型態與控制組相似，而存活率顯著高於控制組；然而投予 1 0 0μM 其神經膠瘤細胞出現多數空泡，但存活率與控制組無顯著差異。當投予二十碳五烯酸及二十碳四烯酸 20 0μM 以上，其細胞型態明顯死亡以及細胞存活率皆顯著下降 (圖 12)，推測過高濃度的脂肪酸可能會造成細胞之毒性。過去亦有研究顯示，n-3 脂肪酸對於細胞存活率之影響，在大鼠初代皮質神經細胞投予二十二碳六烯酸 (docosahexaenoic acid, DHA)，結果發現給予 25至5 0μM 二十二碳六烯酸，會刺激細胞之生長速率；但若給予較高濃度如2 0 0μM時，其細胞存活率亦有明顯下降之情形 (Cao et al., 2005 )，並且有研究顯示由於多元不飽和脂肪酸具有較高比例的雙鍵，因此高濃度之脂肪酸容易造成脂質過氧化發生，進而造成細胞傷害 (Kubo et al., 1997)。. 40.

(55) 第三節多元不飽和脂肪酸處理對於 C6 神經膠瘤細胞達到之保護作用. (一) Pre-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞保護作用之影響觀察預處理多元不飽和脂肪酸對於 ceramide 神經細胞傷害之影響，在給予二十碳五烯酸組之結果，可發現給予濃度 25 至 5 0μM 其細胞型態與控制組相似 (圖 9)；在細胞存活率部分，亦可發現度濃度 25 至 5 0μM 可維持至控制組之程度 (圖 13)。在粒線體膜電位結果發現濃度 2 5μM 有上升趨勢，當處理濃度 5 0μM 其膜電位則與控制組相似 (圖 18)，顯示預處理較低濃度二十碳五烯酸可保護神經細胞以避免 ceramide 之傷害，並可維持其粒線體之功能性。在處理二十碳四烯酸組之結果，觀察濃度 2 5μM 其細胞存活率可維持至控制組之程度 (圖 13)，且粒線體膜電位部分亦可發現與 ceramide 組相較有上升之趨勢 (圖 18)。然而處理濃度 5 0μM 之二十碳四烯酸，雖然膜電位有上升之趨勢 (圖 18)，然而細胞存活率顯著下降 (圖 13)。顯示僅在預處理二十碳四烯酸濃度 2 5μM 時，可保護神經細胞以避免 ceramide 之傷害。過去研究亦顯示，利用 Wistar 大鼠餵食二十二碳六烯酸，並培養視網膜初代神經細胞並以濃度 1 0μM 之 ceramide 造成神經細胞傷害，亦發現餵食二十二碳六烯酸大鼠其視神經細胞之程式化凋亡細胞數目顯著低於 ceramide 組，並且粒線體膜電位有回復的情形，而此研究發現與本次 41.

(56) 實驗有相似性的結果 (German et al., 2006)。 (二) Co-treatment 組對於 C6 神經膠瘤細胞保護作用之影響觀察多元不飽和脂肪酸與 ceramide 同時處理對神經細胞傷害之影響，在處理二十碳五烯酸組之結果，發現與 ceramide 同時處理 25 至 50μM 二十碳五烯酸 24 小時後，其細胞形態與控制組較為相似 (圖 10)；在存活率部分亦可發現投予 2 5μM 與控制組相較則無顯著差異，而 5 0μM 存活率雖未回復至控制組之程度，但亦有上升之趨勢 (圖 14)。在粒線體膜電位部份發現，不論是 25 或 5 0μM 之二十碳五烯酸，其粒線體膜電位皆顯著高於 ceramide 組且與控制組無顯著差異 (圖 19)。在處理二十碳四烯酸組之結果，發現雖然同時處理 25 至 5 0μM 二十碳四烯酸其存活率與 ceramide 組相較皆有上升之情形 (圖 14)，但粒線體膜電位皆沒有回復之情形 (圖 19)。結果顯示與 ceramide 同時處理多元不飽和脂肪酸，投予二十碳五烯酸可使存活率上升且維持粒線體功能性以達到神經保護作用，但在二十碳四烯酸僅能增加其存活率但無法維持粒線體功能性。. 42.

(57) 第四節多元不飽和脂肪酸對轉錄因子及相關粒線體基因表現之影響. (一) 觀察多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞對轉錄因子之影響以多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時，發現處理二十碳五烯酸及二十碳四烯酸 25 至 10 0μM 皆會增加 PGC-1 α之轉錄活性，且二十碳四烯酸與二十碳五烯酸之間並無顯著差異 (圖 20A)。先前研究顯示，PGC-1α之基因表現可能經由兩個途徑增加，其ㄧ為 p38 MAPK (mitogen-activated protein kinase) 途徑，其二為 PKA (protein kinase A) 途徑 (Puigserver et al., 2003)。前者主要經由外界因子刺激，如慢性發炎、營養素等，於產生細胞激素後進一步影響 p38 MAPK 後對 PGC-1α蛋白質進行磷酸化作用，幫助其蛋白質之活化及穩定 (Puigserver et al., 2001; 2003)。亦有學者以初代肝臟細胞處理油酸或亞麻油酸，發現會增加 p38 MAPK 之磷酸化作用，且油酸之組別 PGC-1 α基因表現有顯著增加之情形 (Collins et al, 2006)。而本次研究結果顯示，處理 EPA 及 AA 亦會增加神經細胞中 PGC-1α之轉錄活性，但是否是經由影響 p38 MAPK 來影響 PGC-1α基因，則需要進一步的研究。以多元不飽和脂肪酸處理 C6 神經膠瘤細胞 24 小時，發現投予二十碳五烯酸 25 至 1 0 0μM皆會增加 Tfam 之轉錄活性；然而投予 25 至 5 0μM 二十碳四烯酸亦會明顯增加 Tfam 之轉錄活性； 1 00μM 則與控制組無顯 43.

(58) 著差異 (圖 20B)。 Tfam 為粒線體 DNA 重要的轉錄因子，過去研究顯示，將大鼠 Tfam 報導載體與 NRF-1 大量表現載體同時轉染至大鼠 L6 myoblast 細胞中，發現 Tfam 轉錄活性顯著上升 (Choi et al., 2002)。由於 NRF-1 活化 Tfam 啟動子之轉錄因子，然而 NRF-1 需要 PGC-1α作為轉錄共同活化因子來結合至 Tfam 啟動子上活化位置；亦有學者指出，轉染 PGC-1α大量表現載體至纖維母細胞，發現 Tfam 蛋白質表現量有顯著增加之情形，並且促使粒線體生合成增加 (Liang et al., 2007)。本次研究顯示，推測多元不飽和脂肪酸處理亦可能藉由增加 PGC-1α轉錄活性，而進一步影響 Tfam 之轉錄活性。 (二) 觀察 Pre-treatment 處理多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子之影響本次研究發現，預先處理二十碳五烯酸濃度 50 與 1 00 μM 對於 PGC-1α轉錄活性顯著高於控制組 (圖 21A)，且同時發現下游核轉錄之 NDUFA9 蛋白質表現，在濃度 25 及 50μM 與控制組相較有上升趨勢，而 10 0μM 之蛋白質表現顯著上升 (圖 24)。在預處理二十碳四烯酸組之結果，則發現 1 0 0μM 對於 PGC-1α轉錄活性顯著高於控制組 (圖 21A)，觀察下游核轉錄之 NDUFA9 蛋白質表現，則發現 25μM、50μM、1 0 0μM 與控制組相較皆無顯著差異 (圖 24)。 44.

(59) 在先前研究指出，PGC-1 α會藉由影響 NRF-1 及 NRF-2 來調控並影響下游核轉錄之粒線體蛋白質表現 (Evans and Scarpulla, 1990)。因此本次研究顯示，多元不飽和脂肪酸可能藉由影響 PGC-1α轉錄活性，並進一步影響核轉錄之粒線體蛋白質之表現。接著觀察預處理多元不飽和脂肪酸影響 Tfam 基因表現，在二十碳五烯酸組之結果，發現處理濃度 25 及 5 0μM 其轉錄活性有顯著高於控制組之情形，在蛋白質表現部分亦可看到相似的結果 (圖 21B, C)。同時發現粒線體 DNA 之 ND6 (NADH dehydrogenase subunit 6) mRNA 表現，在濃度 25 及 5 0μM 顯著高於控制組 (圖 23)。然而在二十碳四烯酸組之結果，雖然處理濃度 2 5 μM、5 0μM、1 0 0μM 其轉錄活性有顯著高於控制組 (圖 21B, C)，但在 ND6 mRNA 表現與控制組相較皆無顯著影響 (圖 23)。 Tfam 為調控粒線體 DNA 複製及轉錄之轉錄因子，且 Tfam 蛋白質對於維持粒線體 DNA 之套數具有重要性 (Larsson et al., 1998)，而本次實驗結果顯示，預處理濃度 25 及 50μM 之二十碳五烯酸對於 Tfam 之基因表現及下游粒線體上基因 ND6 之表現亦有明顯的影響。 (三) 觀察 Co-treatment 處理多元不飽和脂肪酸對 C6 神經膠瘤細胞轉錄因子之影響本次實驗結果發現，給予二十碳五烯酸濃度 25、50 及 1 00 μM 對於 PGC-1α蛋白質表現有上升之趨勢，但無進行統計分析 (圖 22A)。而在核 45.