Ankara Üniv Vet Fak Derg 42: 85-90. 1995
AN~ARA
~EçİLERİNİN
pEJ.?İFER KAN T VE B
LENF
O
SIT LERININ ALFA NAFTIL ASETAT ESTERAZ VE
YÜZEY İMMUNGLOBULİN
BOYAMA YÖNTEMİ İLE
BELİRLENMESİ
Nevin KurtdedelHikmet Altunayı
Reşat Nuri Aştıl
Cevdet Akdeniz3 Use of alpha-naphlyl acetale eslerase and surfase immunoglobulin staining
lo idenlify Tand 8 lymphocyles in Angora goal".
Summary: The purpose of this study was to determine the percentage of the peripheral blood T lymphocytes and the localization of ANAE enzyme at the elec-tron microscopic level in various ages of Angora goaıs by using alpha-naphtyl ace-tate esterase procedure and to establish the percentage of the B lymphocytes by using Slg stainingo
Blood samples were obtained from 10 Angora goats on the day of birth and subsequently on days 7,14,21,28 and 60 days postnatally andfrom twenty adult Angora goats.
The percentage of the ANAE and Slg positive lymphocytes in various ages of Angora goats were59,3-63,9% and 35,2-41,0% respectively. The percentage of the ANAE negative and S/g positive lymphocytes were similiar each other.
lt has been demonstrated that monocytes, platelets, neutrophils and eosinophil granulocytes showed a diffuse granuler positivity.
In the electron microscopic examination, ANAE positive reaction were see n in lizozomal granules found in lymphocytes, monocytes, platelets, neutrophils and eo-sinophil granulocytes.
Özel: Bu çalışma, ANAE enzim boyaması ile değişik yaşlardaki Ankara
keçi-lerinin perifer kan T lenfasit oranlarının saptanması, enzimin ince yapı düzeyindeki lokalizasyonunun tesbiti ve S/g boyaması ile B lenfasit oranının belirlenmesi ama-cıyla yapıldı.
Çalışmada, 20 adet erişkin, 10 adet yeni doğmuş Ankara keçisinden alınan kan örnekleri materyalolarak kullanıldı. Yeni doğmuş hayvanlardan doğdukları gün, 7, 14,21,28. ve 60. günlerde perifer kan örnekleri alındı.
Değişik yaş gruplarında ANAE pozitif lenfosit oranının %59.3-63.9; Slg pozitif lenfosit oranının ise %35.2-41.0 arasında değiştiği saptandı. ANAE negatif lenfosit oranının, SIg pozitif lenfosit oranına yakın olduğu gözlendi.
Monosit, kan pulcukları, eozinofil ve nötrofil granulosit/erin diffuz granüler pozitif reaksiyon gösterdikleri tesbit edildi.
Elektron mikroskop u ile yapılan inceleme/erde, ANAE enzim boyamasına karşı pozitif reaksiyona lenfosil, monosit, kan pulcukları, eozinofil ve nötrofil
granulosil-lerde bulunan lizozomal granüllerin içinde rastlandı.
i Dr.. A.Ü. Veteriner Fakültesi, lIistoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı. Ankara.
2 Prof. Dr., A.Ü. Veteriner Fakültesi. Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Ankara.
3 Vet. Hek., Lalahan Hayvancılık Araştırma Enstitüsü. Ankara.
Giriş
Perifcr kan lenfasitleri, immunolojik özel-liklerine göre T ve B lenfasitleri olarak sınıflan-dınlır (l, 6). Bu lenfasit tipleri, sağlıklı bir can-lının peri fer kanında belirli oranlarda bulunurken, bazı proliferatif hastalıklarda bu
86 NEvIN KURTDEDE.REŞAT NURt AŞll-HtKMET AL TUNA Y.CEVDET AKDENİZ
oranlarda önemli sapmalar şekillenmektedir (1. 6. 9. 16). İmmun yetmezlik hastalıklannın teşhisi. lenfositik lösemilerde orijinin ortaya çıkanlabilmesi. kanser olgulannda seluler im-munitede meydana gelen de~işikliklerin sapta-nabilmesi için perifer kan T ve B 1enfosit oranı-nın belirlenmesi gerekir (6).
Lenfosit tiplerinin ayırdedilmesi amacıyla kullanılmakta olan yöntemler hem oldukça pa-halı. hem uzun zaman almakta ve pekço~u da doku kesitlerine uygulanamamaktadır. Bu ne-denle. gerek frotilerde ve gerekse doku kesitle-rinde uygulanabilecek pratik bir yöntemin geliştirilmesi amacıyla çeşitli araştırmalar (2. 8, 9, 11) yapılmıştır. Son yıllarda, nonspesifik es-terazıardan olan alfa naftil esatat esterazın (ANAE) T lenfositlerinde bulundu~u, B lenfo-sitlerinde ise bulunmadı~ı çeşitli araştıncılar (2. 8, 11. 19. 26) tarafından bildirilmiştir. ANAE pozitif reaksiyonun T hücrelerinde 1-2 adet 10-kalize granül şeklinde gözlendi~i. B lenfositle-rini n ANAE boyamasına karşı negatif reaksi-yon verdi~i araştıncılar (2. 8. 9. 1
ı.
18) tarafından ileri sürülmüştür. ANAE boyama metodu ile perifer kan T lenfosit oranı insanda %60 (19), sı~rda %64.2 (26), kanatlıda %60 (15) olarak bulunmuştur.ANAE enziminin lizozomal enzim olduğu çeşitli araştıncılar (8. 18. 27) tarafından ileri sü-rülmüştür. Bozdech ve Bainton (4) elektron mikroskobu ile yapılan çalışmalannda alfa naf- . til butirat esteraz (ANBE) aktivitesinin, mono-sit ve lenfomono-sitlerin lizozomlan içinde olduğunu göstermişlerdir.
Yüzey immunglobulin (surface Ig-SIg) bo-yama metodu ile perifer kan B lenfosit oranı in-sanda %26-40 (8). sığırda %32 (16), kanatlıda % 17 (15) olarak bulunmuştur.
Bu çalışmada, ANAE enzimi ve yüzey im-munglobulinlerinin demonstrasyonuyla. Ankara keçilerinin perifer kan T ve B lenfosit oranlan-nın belirlenmesi ve ANAE enziminin ince yapı düzeyindeki yerleşiminin saptanması amaçlan-dı.
Materyal ve Metot
Çalışmada, değişik yaşlardaki 30 sa~lıklı Ankara keçisinden alınan heparinize kan örnek-leri materyal olarak kullanıldı. Bu hayvanlardan 20'si erişkin. lO'u ise yeni do~uş olanlardan seçildi. Yeni do~muş hayvanlardan doğduklan gün, 7. 14.21,28. ve 60. günlerde perifer kan örnekleri alındı.
Alınan kan örneklerinden, alfa naftil asetat esteraz enzimi (ANAE) demonstrasyonu için frotller hazırlanarak havada kurutuldu ve
ANAE enzim boyaması (18) uygulanarak. bun-lar ışık mikroskopta incelendiler.
İnce yapıya yönelik araştırmalar için. her hayvandan alınan heparinize kan örneklerinin yansı. lenfosit izolasyonu yapıldıktan sonra Karnovsky (10) yöntemine göre glutaraldehid paraformaldehid tesbit sıvısı ile tesbit edildi.
1200 dev/dak.'da 10 dakika santrifüje edildikten sonra çökelti üzerine 50°C'de erimiş %2'lik agar'dan 1-2 damla damlatılarak tüp içeri~i te-miz bir lam üzerine döküldü. Agar donduktan sonra küçük parçacıklar halinde kesilerek % 1Ilik ozmik asitte iki saat süreyle .tesbit edildi. Parçalar Araldit MIde bloklandı. Ince kesitler Reynold's (23) yöntemiyle boyanarak CarI Ze-iss EM 9S-2 model mikroskopta incelendi.
Heparinize kan örneklerinin diğer yansı ise elektron mikroskopta alfa naftil asetat esteraz enzimini demonstre etmek (27) için. kullanıldı. Lenfosit izolasyonundan sonra glutaraldehid-aseton ile tesbit yapıldı ve süspansiyon içinde alfa naftil asetat esteraz enzim boyaması 45 dakika süreyle uygulandı; yukanda anlatılan tekniğe göre elektron mikroskop'a hazırlandı. Ancak. bu örneklere ozmik asit tesbiti uygulan-madığı gibi, ince kesitlere kurşun sitrat boya-ması da yapılmadı.
B lenfositlerdeki yüzey immunglobulinle-rinin (SIg) demonstrasyonu B lenfosit kiti (Sig-ma diagnostic kit) kullanılarak yapıldı.
ANAE ve SIg boyama metodlanyla hazır-lanan her preperattaki 3 değişik alanda yüzer-den üçyüz lenfosit sayılarak pozitif lenfosit oranlan saptandı.
Bulgular
Işık mikroskobu ile yapılan incelemelerde. ANAE enzim. boyamasına karşı pozitif lenfosit-lerin büyük çoğunluğunda sayılan 1-2 arasında değişen spesifik kırmızı granüller gözlendi (Şe-kil 1 ok). Nötrofil granulositlerde granuler pozi-tiviteye rastlandı (Şekil 2 oklar). Eozinofil gra-nulosit ve monositlerde kuvvetli. diffuz granuler pozitivite tesbit edildi.
SIg boyaması uygulanan preperatlarda. B lenfositlerde SIgIlerinin hücre membranında ho-mojen dağılım gösterdikleri (ŞekiL. 3 ok) ya da hücrenin bir kutpunda toplandıklan gözlendi (Şekil 4 ok).
ANAE ve SIg boyaması sonuçlan tablo 1 ve 21de verilmiştir.
Değişik yaş gruplannda ANAE pozitif len-fosit oranın %59.3-63.9. ANAE negatif lenlen-fosit oranının %36.4-40.7 arasında; SIg pozitiflenfo-sit oranının %35.2-41.0. SIg negatif lenfosit oranının ise %59.0-64.8 arasında de~işti~i sap-tandı. Aynı yaş gruplan, ANAE ve SIg
boya-ANKARA KEçtLERlNlN PERIFER KAN T VE B LENFOSITLERI
ŞekiII: Erişkin Ankara keçisinde ANAE boyaması. Ok: T lenfositinde ANAE pozitif granül. ANAE.x990. Figure ı:ANAE staining in adult Angora goal. Arrow: ANAE positive granule in T Iymphoeyte. ANAE.x 990.
Şekil 2: Erişkin Ankara keçisinde ANAE boyaması. Oklar: nötrofil granulositte ANAE pozitif granuller.
ANAE.x i250.
Figure 2: ANAE staining in adult Angora goal. Arrows: ANAE positive granules in neutrophil granuloeyte.
ANAE.x 1250.
87
Şekil 4: Erişkin Ankara keçisinde SIg boyaması. Ok: yüzey immunglobulinlerinin B lenfositin bir kulpunda
toplanması. SIg.x870.
Figure 4: SIg staining in adult Angora goal. Arrow: loealization of surfaee immunoglobulins at one pole of the
B Iymphoeyte. SIg.x870.
masına karşı kendi aralannda karşılaşnnldtkla-nnda ANAE negatif lenfosit oranının, SIg pozi-tif lenfosit oranına çok yakın olduğu dikkati çekti. Bu bulgulara göre ANAE pozitif lenfosit oranının genç hayvanlarda biraz daha yüksek ve SIg pozitif lenfosit oranının ise düşük oldu-ğu, yaşın ilerlemesi ile birlikte ANAE pozitif lenfosit oranında bir düşmenin ve SIg pozitif lenfosit oranın da ise bir yükselmenin şekillen-diği saptandı (Tablo 1 ve 2).
Tablo i: Ankara Keçilerinin Perifer Kan Lenfositlerinde ANAE Boyaması
Tahle i: ANAE Staining in Peripheral Blood Iymphoeytes in Angora Goats
Hayvanın Hayvan Lenfosit (%)
Yaşı Sayısı ANAE+
ANAE--- ANAE- ---36.4 O-I gün 10 63.6 7 gün LO 62.9 37.1 14 gün LO 63.3 36.7 --- .'-- --i 21 gün LO 60.9 , 39.1 28 gün 10 60.7 39.3 60 gün 10 61.8 38.2 - - --20 59.3 ! 40.7 1-3 yaş
Tablo 2: Ankara Keçilerinin Perifer Kan Lenfositlerinde Slg Boyaması
Table 2: Slg Staining in Peripheral Rlood Lymphoeytes in Angora Goats
Lenfosit (%)
Şekil 3: Erişkin Ankara keçisinde Slg boyaması. Ok: yüzey immınıglobulinlerinin B lenfosit membranında
diffuz dağılımı. Slg.x960.
Figure 3: Slg staining in adult Angora goal. Arrow: diffuse distribution or surfaee immunoglohu\ins in R
Iymphoeyıc mcmhrane. Slg.x960. Hayvanın Yaşı SIg+ 35.2 36:4 41.0 39.0 Slg-64.8 63.6 _.__..._- .__. 59.0 61.0
88 NEviN KURTDEDE-REŞAT NURI AŞTI-HlKMET AL ll.JNA Y-CEVDET AKDENIZ
Elektron mikroskobu ile yapılan inceleme-lerde, ANAE enzim boyamasına karşı lenfosit (Şekil 5 L), monosit (Şekil 6 M), kan pulcuklan (Şekil 5,8 t), nötrofil (Şekil 7 N) ve eozinofil (Şekil 8 E) granulositlerde bulunan lizozomal granülllerin pozitif reaksiyon verdi~i saptandı. Reaksiyonun, lizozomal granüllerin içinde dif-füz olarak yerleşti~i dikkati çekti (Şekil 5, 6, 7, 8oklar).
Tartışma ve Sonuç
Perifer kan T lenfositlerini belirlemek için çeşitli araştıncılar (5,8,9, 12, 18) tarafından
li-",:;"
ii
..
li". ....: , .L- "., r' .,~.
_.
~(..
~ -"'..•.-.••
Şekil 5: Elektron mikroskopta ANAE boyaması. Oklar: lenfosit ye kan pulcuklarında ANAE pozitif granüller,
L:lenfosit, t: kan pulcuğu. ANAE. x 6185. Figure 5: ANAE staining in Electron microscope. Arrows:
ANAE pasiliye granules in Iymhocyte and platelet, L: Iymhocyte, t: platelet. ANAE. x 6185.
Şekil 6: Elektron mikroskopta ANAE boyaması. Oklar: monosİue ANAE pozitif granüller, M: monosiı.
ANAE.x 12375.
Figure 6: ANAE staİning in Electron microscopc. Arrows: ANAE positiye granuJes in monocyte,
M: Monocyte. ANAE.x 12375.
Şekil 7: Elektron mikroskopta ANAE boyaması. Oklar: nötrofil granulosiue ANAE pozitif grantiller, N:nötrofil.
ANAE. x 10 125.
Figure 7: ANAE staining in Electron microscope. Arrows: ANAE positiye granules in neutrophil
granulocyte, N:neutrophil. ANAE. x 10 125.
Şekil 8: Elektron mikroskopta ANAE boyaması. Oklar: eozinofil granulosit ye kan pulcuğunda ANAE pozitif
granülIer, E: eozinofil granulosit, t:kan pulcuğu. ANAE.x9215.
Figure 8: ANA E staining in Electron microscopc. Arrows: ANAE posiliye granules in eosinophil granulocyte and platelets, E: eosinophil granu1ocyte,
t:plateleı. ANAE.x 9215.
zozomal enzimlerden yararlanılmıştır. Son za-manlarda, nonspesifik estcrazlardan olan alfa naftil asetat esteraz'ın T lenfositlerinde bulunup B lenfositlerinde bulunmadığı birçok araştıncı (8, 11, 14, 19) tarafından bildirilmiştir.
Higgy ve ark. (8) T ve B lenfositleri ilc NuH hücrelerinden zenginleştirilmiş hücre süs-pansiyonlan üzerinde yaptıklan bir çalışmada, ANBE enzimini demonstre ederek 10kalize gra-nüler p<)Zitiviıenin T lenfositleri için spesifik pozitif reaksiyon oJduğunu tesbit etmişlerdir. Kajikawa ve ark. (9), sığırlarda yaptıklan
Ça1IŞ-Al'\KARA KEçlLERt\1N PERIFER KAN T VE R LENFOSITLERI
mada, ANAE uygulamasıyla perifer kan T len-fositlerinde granüler, monositlerde ise diffuz re-aksiyonun görüldüğünü bildirmişlerdir. Ramos ve ark. (22) domuzlarda ANAE enzim boyama-sında perifer kan T lenfositlerinde granüler, mo-nosit ve eozinofil granulositlerde ise diffuz re-aksiyonun görüldüğünden bahsetmektedirler. Knowles ve Susan (12), Kulenkampff ve ark. (14) ile Milller ve ark (19) insan pcrifer kan T lenfositleri üzerinde yaptıklan çalışmalarda, ANAE enzimi boyamasıyla T lenfositlerinin si-toplazmasında genelde tek bir kırmızı granül, monositlerde diffuz şekilde pozitif reaksiyonun görüldüğünü. nötrofil granulositlerin ise negatif reaksiyon verdiğini bildirmişlerdir. Osbaldiston ve ark. (2L) farklı türler üzerinde yaptıklan ANAE çalışmasında, rat, kobay, koyun ve keçi-lerin nötrofil granulositlerinde pozitif reaksiyo-na rastladıklannı, kedi ve domuzlarda ise bunu gözlemediklerini. aynca köpek ve tavşanlarda eozinofil granulositlerde ANAE'ye karşı pozitif reaksiyonu gözledikleri halde kobay, kedi, ko-yun, keçi ve insanlarda bu durumu göremedik-lerini bildirmektedirier.
Ankara keçilerinin perifer kan T lenfositle-ri üzelenfositle-rinde yapılan bu çalışmada ANAE boya-masıyla erişkin hayvanlann lenfasitlerinin ço-ğunda genelde bir, bazen daha fazla sayıda kırmızı granül şeklinde reaksiyon gözlendi. Monosit ve eozinofil granulositlerde kimi araş-tıncılann (12, 18, 22) bildirdikleri gibi diffuz reaksiyon gözlendi, nötrofil'lerde de pozitif re-aksiyon tesbit edildi. Nötrofil granulositlerdcn elde edilen bulgular, Osbaldiston ve ark. (21)'nın bulgulanna uyum sağlamakıa, Knowles ve Susan (12), Müller ve ark. (19)'nın bulguları-na ise uymamaktadır. Aynca kan pulcuklarında da ANAE boyamasına karşı elektron mikroskop ile yapılan incelemelerde poziti f reaksiyon be-lirlendi. Çalışmadaki bu bulgu diğer araştırıcı-lar tarafından bildirilmemiştir.
İnsanlarda yapılan çalışmalarda, ANAE pozitif perifer kan T lenfosit oranını Mül\er ve ark. (19) %85, Knowles ve ark. (11) %70, Ku-lenkampff ve ark. (14) %68 olarak bildirmişler-dir. Bu oran tavuklarda %60 olarak bulunmuş-tur (15). Sığırlann perifer kanındaki B ve T lenfasit oranlarının belirlendiği çalışmalarda farklı sonuçlar elde edilmiştir. Thurmond ve ark. (24) sığırlarda T lenfasit oranının %37-50, B lenfasit oranının ise %27-33 arasında değişti-ğini bildirmişlerdir. Yapılan başka bir çalışma-da (20) ise T lenfasit oranı %64.4, B lenfosit oranı da %25.4 olarak tespit edilmiştir. Yang (25) T lenfasit oranını %79.2, B lenfasit oranını da %26.9 olarak bildirmiştir. Yukandaki araştı-rıcılann (20, 24, 25) yaptıklan çalışmalarda farklı yaşlardaki sığırların perifcr kanlanndaki
89
T lenfasit oranlan hakkında bilgi verilmemekte-dir. Çalışmada, değişik yaş gruplarında ANAE pozitif lenfosit oranı %59.3-63.6, SIg pozitif lenfasit oranı ise %35.2-41.0 arası bulunmuş: tur. Ayrıca aynı yaş gruplarındaki SIg pozitif lenfasit oranının, ANAE negatif lenfasit oranı-na çok yakın olduğu dikkati çekmiştir. Erişkin hayvanlarda tesbit edilen T ve B lenfosit oranı insan ve sığırlarda bildirilene yakındır. Bugüne kadar yapılan çalışmalar erişkin insan ve hay-vanlarda olduğu için gençlerdeki T lenfosit ora-nının erişkinlere göre yüksek, B lenfosit oranı-nın ise düşük oluşunu tartışacak literatür bulunamamıştır. Miyasaka ve ark. (17) koyun fötusunda gebeliğin 54. gününde timositlerin %90'dan fazlasının T lenfasit olduğunu, Bianc-hi ve ark. (3) domuzlarda T lenfasitlerin do-ğumdan önce tam geliştiğini bildirmişlerdir. İn-san ve fareler üzerinde yapılan çalışmalarda yaşlanmayla birlikte perifer kandaki T lenfosit sayılarının azaldığı, bu azalmalann timusun in-volusyonuyla ilgili olabileceği ileri sürülmüştür (6). Kroesc ve ark. (I 3) ratlann dalağında ilk sentrum germinativum'lann doğumdan sonraki 3-4. haftada geliştiğine dikkati çekmişlerdir. Genç hayvanlardaki ANAE pozitif lenfosit ora-nının erişkiniere göre yüksek, B lenfasit oranı-nın ise düşük oluşunun, ilk bir aylık dönemde selüler immunitenin, humural immuniteye göre daha iyi gelişmiş olmasından ileri geldiği kanı-sına van ldı.
Grossi ve ark. (7) ANAE aktivitesinin pri-mer lizozomlarda gözlendiğini, Bozdech ve Ba-inton (4) ANBE aktivitesinin monosit ve lenfo-sitierde granül\erin içinde, Zicca ve ark. (27) ise ANAE aktivitesinin lizozomların membranında bulunduğunu bildirmişlerdir. Elektron mikros-kop ile yapılan incelemelerde ANAE ile boya-mada pozitif reaksiyonu lenfasit, monosit, kan pulcuklan, eozinolil ve nötrofil granulositlerde-ki lizozomların içerisinde tesbit edildiğinden, Zicca ve ark. (27)'nin lizozomların membranın-da bulunduğu görüşüne katılmamaktayız.
Bu çalışmadan elde edilen bulgulara daya-narak Ankara keçilerinde ANA E demostrasyo-nu ile perifer kandaki T lenfasitlerin spesifik olarak belirlenebileceği ve ANAE enziminin T lenfositlerdeki lizozomlann içinde bulunduğu sonucuna vanldı.
Kaynaklar
ı. Barret, T ..!.(I9HO).lIas,c immun%gy and iıs m£dica/
app/ICQIIOfI. The CV. Mosby Company. London. pp. 4H-65.
2. Bassu, (;., endtn, 1'1.(;., Semenzatn, G., Pczzutn. • A. and Zancsı'n, 1.. (19HO).CylOchemiCQ/ sıudy oj Ihy.
90 NEYIN KURTDEDE-REŞAT NURI AŞTI-HIKMET ALTUNA Y -CEYDET AKDENİZ
3. Bianchl, A.T J., Zwart, RJ., Jeurissen, S.H.M. and Moonen.Leuseiı, H.W.M. (1992). DevelopmenI of ıhe B and T cell comparlm.enls in porcine Lymphoid organs from birıh lo adulı life: an immUllomsıological approach.
Yet. Immun. Immunopath. 33:201-221.
4. Bozdech, MJ. and Bainton, D.F. (1981).
Idenıiftca-ıion of alfa naphtyl bulyraıe eslerase as apıasma membrane ecloenzyme of monoeyles and as a discrele inlracellular m£mbrane bounded orgaNıile in Iymphocyıes. J.Exp. Med. 153:182.195.
5. Edwin, P.T., Sondra, G.B., Marshall, E.K. and Dorathy, B.F. (1981). UllraslrwcllUallocalizaıion ofacid phosphaıase in rosel/ed T and B Iymphocyıes of normal hu-man blood. Am. J. Path ol. 102: 72.83.
6. Fudenberg, H., Stltes, D., Caldwell, J. and Wells, V. (1978). Basic clinical immuııology. Lang Medical Publi-caıion. Califomia. pp. 78.95.
7. Grossi, C. E., Webb, S.R., Zicca, A., Lydyard, P.M., Moretla, L., Mingari, M.C. and Cooper, M.D. (1978). Morphological and hislochemical analysis of Iwo human T-cell subpopulaıions bearing recepıors for IgM
orIgG. J.Exp. Med. 147:1405.1417.
8. HIggy, K.E., Bums, G.F. and Hayhoe, F.G.
(1977). Discrimination of B. Tand Nulllympocyıes byesıe-rase cyıochemisıry. Scand. J. Haemaıol. 18:437-448. 9. Kajlkawa, D.W.M., Koyama, H., Yushikawa, T.
and Tsubaki, S. (1983). Use of alpha-naphyıhyl acetale eslerase slaining ıo Uknlify T Iymphoeyıes iıı cal/le. Am. J.
Yet. Res. 44:1549.1552.
10. Karnowsky, MJ. (1965). A formadehyd-glutaraldehyd
[ıxoıive of high osmolaliıy for use in eleclron microscopy. J. Cell. Biol. 27:137-138.
11. Knowles, D.M., Hofman, T., Ferrarini, M. and Kunkel, H.G. (1978). The tiLmonsıraıiolı of acid alpha naphyıhyl acelate eslerase acliviıy in humaıı Iymphocyıes usefulııess as a T-cell marur. Cellular Immunol. 35: i i 2- 123.
12. Knowles, D.M. and Susan, H. (1978). Tissıu
localizo-ıioıı ofT-lymphocyıes by ıhe hisıochemical demonslraıioıı of acid alfa-naphtyl acelale eslerase. Lab. Invest. 39:70-76.
13. Kroese, F.G.M., Wubbena, A.S., Kuijpers, K.C. and Nieuwenhuis, P. (1987). The oıılogeııy of germina!
ceıılre formiııg capacity of ııeonatal ral spleeıı. Immunology.
(fJ:597 -602.
14. Kulenkamp", J., Janossy, G. and Greaves, M.F.
(1977). Acid eslerase in human Iymphoid cells and leulcaemic blasts: a marlcu for T Iymphocyles. British J. Haemaıol. 36:231-240.
15. Maiti, N.K., Salni, S.s. and Sharma, S.N. (1990).
Hislochemical sıudies 011cmcun peripheral blood
Iymphocy-les. Yet. Resch. Comminieation. 14:207-210.
16. Mlelke, H. und Fürll, B. (1989). Die zel/en tiLr peri.
phereıı Eulerlymphe UlI/er berüclcsichtigU1lg der B- UIId T-Iymphozyıeıı im vergleich zu deli zel/eli tiLs periphereıı Blules UIId tiLr Mi/ch bei gesUlldelı sowie masıitis.UIId leulcaselc-raııuıı Kühen. Mh. Yet. Med. 44:629.632.
17. Miyasaka, M., Heron, 1., Dudler, L., Cah1ןı, R.N.P., Forni, L., Knaak, T. and Tmka, Z. (1983) .
. Sıud~s 011 Ihe dijferenliıılioıı of T Iymphocyıes iıı sheep. I.
Recognaıioıı of a sheep T Iymphocyıe dijfereııliıılion anıigeıı by a moııoclonal anıibody T-BO. ImmUllOlogy. 49:545.553.
18. Mueller, J., Brundel, Re, G., Buerkl, H., Keller, H. and Gottier, H. (1975). Nonspesiftc acid esleras ac-livily: a criterioıı for dijfereııliıılion of T and B Iymphocyıes in mouse Iymph lıodı!S. Eur. J. Immunol. 5:270-274.
19. Müller, J., Keller, H.U., Hagmann, J.D., Cornio. ley, R. J., Ruchti, C. and Cottier, H. (1981).
Noııspe-cific eslerase in humaıı Iymhoeyıes. Inı. Arehs. Allergy app1. ımrnun. 64:410-421.
20. Nakanlshi, H, Koyama, H., Kajikawa, O. and Sal. to, H. (1983). Ideııliftcalioıı of boviııe T and B Iymphocyıes in IIOrmal peripheral blood. Iymph nodı!s and spleeıı. Jpn. J.
Vet. Sei. 41 :97-107.
21. Osbaldlston, BVSe., SuJJlvan, RJ. and Fox, A.
(1978). Cyıochemical demonslraıioıı of eslerases in per-ipheral blood leulcacyıes. Am. J. Vet. Res. 39:683-685.
22. Ramos, J.A., Ramis, J.A., Mareo, A., Domingo, M., Rabanal, R. and Ferrer, L. (1992). Hislochemical
and immunohislochemical sıudy of ıhe mweosallymphoid sys-ıem in swine. Am. J. Yet. Res. 53:1418-1426.
,
23. Reynolds, E.s. (1963). The use of lead citrate at mgh pH
as aıı eleclroııopaqıu slain in eleclroıı microscof'Y. J. Cell. Biol. 17:208.212.
24. Thurmond, M.C., Canter, R.L., Picanso, J.P. and Stralka, K. (1990). Upper IIOrmal prediclioıılimits of Iym-phoeyıe coUll/s for cal/le 1101 irıfecıed with boviNı leuJcemia
virus. Am. J. Yet. Res. 51 :466-470.
25. Yang, T. (1981). Idenlijicalioıı of bovine T and B Iympho-eyle sub populations by immUllOjluorescence surface marur analyses. Am.J.Veı. Res. 42:755-757.
26. Yang, T J., Patricia, J.A. and Williams, L.F.
(1979). Acid alpha naphtyl acelale eslerase preseııce of ac. liviJyiııbovine and humaıı T and B Iymphoeyıes. Immunolo-gy. 38:85-92.
27. Zicca, A., Leprinl, A., Cad on i, A., Franel, T.A., Ferrarini, M. and Carlo, E.G. (1981). UltraslrwcllUaI
localizatioıı of alpha-naphtyl acid eslerase in human Tm Iymphocyıes. Am. 1. Pathoı. 105:40-46.
