T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
RESVERATROLÜN
İN VİTRO
HİDROJEN PEROKSİT İLE
İNDÜKLENEN İNSAN KORONER ARTER
ENDOTEL HÜCRE HASARINA OLASI
ETKİSİNİN İNCELENMESİ
OYA SAYIN
TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
T.C.
DOKUZ EYLÜL ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
RESVERATROLÜN
İN VİTRO
HİDROJEN PEROKSİT İLE
İNDÜKLENEN İNSAN KORONER ARTER
ENDOTEL HÜCRE HASARINA OLASI
ETKİSİNİN İNCELENMESİ
TIBBİ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
DOKTORA TEZİ
OYA SAYIN
DanıĢman Öğretim Üyesi: Prof. Dr. Gül GÜNER AKDOĞAN
(Bu araĢtırma DEÜ Bilimsel AraĢtırma Projeleri ġube Müdürlüğü tarafından
2006.KBSAG047 sayı ile desteklenmiĢtir.)
İÇİNDEKİLER
Tablo Listesi ... v
ġekil Listesi ... vii
Kısaltmalar ... x
Türkçe Özet ... xii
Ġngilizce Özet ... xiv
BİRİNCİ BÖLÜM 1.GĠRĠġ VE AMAÇ ... 1
İKİNCİ BÖLÜM 2. GENEL BĠLGĠLER ... 3
2.1. REAKTĠF OKSĠJEN ÜRÜNLERĠ ... 3
2.2. HĠDROJEN PEROKSĠTĠN METABOLĠZMASI ... 3
2.3. HĠDROJEN PEROKSĠTĠN SĠNYAL MEKANĠZMALARI ... 5
2.4. HĠDROJEN PEROKSĠT VE ENDOTEL... 5
2.5. OKSĠDATĠF STRES VE KARDĠYOVASKÜLER HASTALIKLAR ... 7
2.6. ANTĠOKSĠDANLAR ... 10
2.6.1. HÜCRE ĠÇĠ ANTĠOKSĠDAN SĠSTEMLER ... 10
2.6.1.1. Glutatyon ... 10
2.6.1.2. γ-Glutamil Sistein Sentetaz ... 15
2.6.1.3. Glutatyon Peroksidaz ... 16
2.6.1.4. Glutatyon Redüktaz ... 20
2.6.2. HÜCRE DIġI ANTĠOKSĠDAN ... 21
2.6.2.1 Resveratrol ... 21
2.6.2.1.1. Yapısal Özellikleri... 21
2.6.2.1.2. Kaynakları... 22
2.6.2.1.3. Biyosentezi ... 22
2.6.2.1.4. Diyetle Alınan Resveratrolün Emilimi ... 23
2.6.2.1.5. Diyetteki Resveratrolün Dokulara Transportu ... 25
2.6.2.1.6. Diyetle Alınan Resveratrolün Atılımı ... 27
2.6.2.1.7. Resveratrolün Sinyal Ġleti Yolları ... 28
2.6.2.1.8.1. Vazorelaksasyon ... 31
2.6.2.1.8.2. Anti-enflamatuvar etkileri ... 32
2.6.2.1.8.3. ROS yakalayıcısı olarak resveratrol ... 32
2.6.2.1.8.4. Anti-apoptotik etki ... 33
ÜÇÜNCÜ BÖLÜM 3. GEREÇ VE YÖNTEM ... 34
3.1. ÇALIġMANIN PLANI VE DENEY GRUPLARI ... 34
3.2. GEREÇ ... 35
3.3. YÖNTEM ... 35
3.3.1. Hücrelerin Çözülmesi ... 35
3.3.2. Hücre Sayımı ve Tripan Mavisi Canlılık Testi ... 36
3.3.3. Hücrelerin pasajlanması ... 37
3.4. DENEYSEL ÇALIġMALAR ... 38
3.4.1. SĠTOTOKSĠSĠTENĠN LAKTAT DEHĠDROGENAZ ĠLE DEĞERLENDĠRĠLMESĠ... 39
3.4.1.1. Resveratrolün HCAE hücrelerinde in vitro etkisi ... 41
3.4.1.2. Hücrelerde H2O2 Ġle Optimum Hasar Modeli OluĢturma ... 42
3.4.1.3. Resveratrolün H2O2 Uygulanan Endotel Hücrelerinde Olası Koruyucu Etkisinin Değerlendirilmesi ... 44
3.4.2. REAKTĠF OKSĠJEN ÜRÜNLERĠNĠN ANALĠZĠ ... 45
3.4.2.1. H2O2 Hasarında Reaktif Oksijen Ürünleri OluĢumunun Değerlendirilmesi... 45
3.4.2.2. Resveratrolün Reaktif Oksijen Ürünleri OluĢumuna Etkisinin Değerlendirilmesi ... 46
3.4.3. ĠNDĠRGENMĠġ VE YÜKSELTGENMĠġ GLUTATYON DÜZEYLERĠNĠN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFĠSĠ (HPLC) ĠLE DEĞERLENDĠRĠLMESĠ... 47
3.4.3.1. Glutatyon Ölçümü Ġçin Örneklerin Hazırlanması ... 47
3.4.3.2. Glutatyon Düzeyinin HPLC Ġle Değerlendirilmesi ... 49
3.4.3.2.1. ĠndirgenmiĢ Glutatyon Ölçümü Ġçin Örneklerinin
Hazırlanması... 50
3.4.3.2.2. Total Glutatyon Ölçümü Ġçin Örneklerinin Hazırlanması ... 50
3.4.3.2.3. HPLC Kolonuna Enjeksiyon ... 51
3.4.3.2.4. YükseltgenmiĢ Glutatyon ... 51
3.4.4. γ-GLUTAMĠL SĠSTEĠN SENTETAZ, GLUTATYON PEROKSĠDAZ-1 VE GLUTATYON REDÜKTAZ ENZĠMLERĠNĠN EKSPRESYONLARININ WESTERN BLOT YÖNTEMĠ ĠLE ANALĠZĠ ... 52
3.4.4.1. Hücre lizatı hazırlanması ... 53
3.4.4.2. Protein Ölçümü ... 54
3.4.4.3. Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) Jelinin Hazırlanması ... 55
3.4.4.4. Örnek Hazırlanması ... 57
. 3.4.4.5. Jelin Yüklenmesi ... 57
3.4.4.6. Elektroforetik Yürütme ... 57
3.4.4.7. Proteinlerin Membrana Transferi ... 58
3.4.4.8. Bloklama... 58
3.4.4.9. Primer Antikor Ġle Ġnkübasyon ... 58
3.4.5.0. Sekonder antikor ile inkübasyon... 59
3.4.5.1. Görüntüleme ... 59 3.4.5.2. Dansitometrik analiz ... 59 3.5. Ġstatistiksel Analiz ... 60 DÖRDÜNCÜ BÖLÜM 4. BULGULAR ... 61 4.1. SĠTOTOKSĠSĠTE ANALĠZLERĠ ... 61
4.1.1. Resveratrolün HCAE Hücrelerine in vitro Etkisi ... 61
4.1.1.1. Resveratrolün HCAE Hücrelerine Etkisinin Mikroskobik Olarak Değerlendirilmesi ... 63
4.1.2. H2O2 Hasar Modelinin OluĢturulması ... 64
4.1.2.1. H2O2 Hasar Modeline ĠliĢkin Mikroskobik Görüntüler ... 67
4.1.3. Resveratrolün H2O2 ĠleOluĢturulan Hasara Etkisi ... 69
4.1.3.1. Resveratrolün H2O2 Hasarına Etkilerinin Mikroskobik Olarak Gözlenmesi ... 70
4.2. ROS ANALĠZLERĠ ... 71
4.2.1. H2O2 Hasar Modelinde ROS OluĢumunun Değerlendirilmesine ĠliĢkin Bulgular ... 71
4.2.2. Resveratrolün H2O2 Hasar Modelinde ROS OluĢumuna Etkisinin Değerlendirilmesi ... 72
4.3. ĠNDĠRGENMĠġ VE YÜKSELTGENMĠġ GLUTATYON ANALĠZĠ ... 74
4.3.1. Kontrol ve Deney Gruplarındaki Protein Düzeyleri ... 74
4.3.2. Kontrol ve Deney Gruplarındaki Glutatyon Düzeyleri... 75
4.4. γ-GLUTAMĠL SĠSTEĠN SENTETAZ, GLUTATYON PEROKSĠDAZ-1 VE GLUTATYON REDÜKTAZ ENZĠMLERĠNĠN EKSPRESYONLARININ WESTERN BLOT ĠLE ANALĠZĠ ... 79
4.4.1. Kontrol ve Deney Gruplarında Protein Ekspresyonlarının Western Blot Ġle Gösterilmesi ... 79
BEŞİNCİ BÖLÜM
5. TARTIġMA ... 83ALTINCI BÖLÜM
6.
SONUÇ ve ÖNERĠLER ... 101YEDİNCİ BÖLÜM
7. KAYNAKLAR ... 103EK 1. Etik Kurul Onayı ... 111
EK 2. ÖzgeçmiĢ ... 113
EK 3. YayımlanmıĢ Makale ... 118
TABLO LİSTESİ
Tablo 1. Hücre lizatı hazırlamada kullanılan lizis tamponu içeriği Tablo 2. SDS–PAGE yönteminde ayırıcı jelin (%10) hazırlanması Tablo 3. SDS–PAGE yönteminde paketleyici jelin (%4) hazırlanması
Tablo 4. Resveratrolün HCAE hücrelerine in vitro etkisinin LDH ile değerlendirildiği deneyde ortalama net absorbans bulguları
Tablo 5. Resveratrolün HCAE hücrelerine in vitro etkisinin LDH ile değerlendirildiği deneyde % sitotoksite bulguları
Tablo 6. Resveratrolün 10,50 ve 100 M konsantrasyonlarının 1,12 ve 24 saat inkübasyon sürelerinde kontrole göre “p” değerleri
Tablo 7. H2O2 hasar modelinde sitotoksisitenin LDH ile değerlendirildiği deneyde ortalama
net absorbans bulguları
Tablo 8. H2O2 hasar modelinde sitotoksisitenin LDH ile değerlendirildiği deneyde %
sitotoksite bulguları
Tablo 9. H2O2’in değiĢik konsantrasyonlarının sitotoksisite üzerine etkilerinin kontrole göre
tüm zaman noktalarındaki istatistiksel sonuçları
Tablo 10. 10, 50 ve 100 M resveratrolün 1, 12 ve 24 saat preinkübasyonunda sitotoksisitenin LDH ile değerlendirildiği deneyde ortalama
net absorbans bulguları
Tablo 11. 10, 50 ve 100 M resveratrolün 1, 12 ve 24 saat preinkübasyonunda sitotoksisitenin LDH ile değerlendirildiği deneyde % sitotoksite bulguları Tablo 12. 10, 50 ve 100 M konsantrasyonlarında resveratrolün sitotoksisite üzerine
etkilerinin 1,12 ve 24 saat inkübasyon süreleri açısından istatistiksel sonuçları Tablo 13. HCAE hücrelerinde farklı H2O2 konsantrasyonlarında ve sürelerinde ROS
oluĢumu
Tablo 14. HCAE hücrelerinde H2O2’in farklı konsantrasyonlarında ve sürelerinde yapılan
deneyin kontrol grubuna göre karĢılaĢtırılmasının istatistiksel sonuçları Tablo 15. HCAE hücrelerinde resveratrolün farklı konsantrasyonlarında ROS oluĢumu Tablo 16. HCAE hücrelerinde resveratrolün farklı konsantrasyonlarında yapılan deneyin tüm
zaman noktalarında H2O2 grubuna göre yapılan karĢılaĢtırılmasının istatistiksel
Tablo 17. Kontrol grubu ve deney gruplarında hücre lizatı ortalama protein düzeyleri Tablo 18. Kontrol grubu ve deney gruplarında indirgenmiĢ glutatyon (GSH) bulguları Tablo 19. Kontrol grubu ve deney gruplarında yükseltgenmiĢ glutatyon (GGSG) bulguları Tablo 20. Kontrol grubu ve deney gruplarında indirgenmiĢ glutatyon düzeyi açısından
istatistiksel sonuçlar
Tablo 21. Kontrol grubu ve deney gruplarında yükseltgenmiĢ glutatyon düzeyi açısından istatistiksel sonuçlar
Tablo 22. Kontrol grubu ve deney gruplarında γ- Glutamil Sistein Sentetaz’ın dansitometrik bulgularının istatistiksel sonuçları
Tablo 23. Kontrol grubu ve deney gruplarında Glutatyon Peroksidaz-1 dansitometrik bulgularının istatistiksel sonuçları
Tablo 24. Kontrol grubu ve deney gruplarında Glutatyon Redüktaz’ın dansitometrik bulgularının istatistiksel sonuçları
ŞEKİL LİSTESİ
ġekil 1. H2O2’in metabolizması
ġekil 2. Kardiyovasküler hastalıklardaki oksidatif stres ve endotel fonksiyon kaybı ġekil 3. ĠndirgenmiĢ glutatyon’un yapısı
ġekil 4. Glutatyon’un sentezi
ġekil 5. Glutatyon’un hücre içi dağılımı ġekil 6. Glutatyon’un katabolizması
ġekil 7. Glutatyon’un redoks ve konjugasyon reaksiyonları
ġekil 8. γ-GCS enziminde düsülfid bağı oluĢumu ve indirgenmesini gösteren bir model ġekil 9. Glutatyon Peroksidaz-1’in moleküler mekanizmaları ve iĢlevleri
ġekil 10. NADPH’dan GSH ve Glutatyon redüktaz aracılığı ile elektron transferi ġekil 11. Resveratrol ve konjuge formlarının yapısal formülleri
ġekil 12. Resveratrolün biyosentezi
ġekil 13. Trans-resveratrolün ve trans-piseidin emilimi
ġekil 14. Resveratrolün plazmadan hücre içi hedeflere olası yolları ġekil 15. Resveratrolün metabolizması
ġekil 16. Resveratrolün moleküler hedefleri ġekil 17. Resveratrolün kardiyoprotektif etkileri
ġekil 18. ÇalıĢmamızda oluĢturduğumuz deney gruplarımız ġekil 19. Hücre sayımında kullanılan Thoma lamı
ġekil 20. Pasaja hazır HCAE P4 hücrelerinin faz-kontrast mikroskobik görüntüsü ġekil 21. LDH yönteminin enzimatik denklemi
ġekil 22. AkıĢ çizelgesi: Resveratrolün hücre canlılığına in vitro etkisinin değerlendirilmesi
ġekil 23. AkıĢ çizelgesi: Hidrojen peroksit hasar modelinin in vitro uygulaması
ġekil 24. AkıĢ çizelgesi: Resveratrolün, H2O2 hasarlı HCAE hücrelerine in vitro etkisinin
değerlendirilmesi
ġekil 25. AkıĢ çizelgesi: H2O2 hasar modelinde ROS ölçümü
ġekil 26. AkıĢ çizelgesi: Resveratrolün in vitro H2O2 hasarına etkisinin değerlendirilmesi
ġekil 27. AkıĢ çizelgesi: DeğiĢik deney gruplarında glutatyon ölçümleri öncesinde hücre lizatı hazırlanması ve derivatizasyon iĢlemleri
ġekil 29. AkıĢ çizelgesi: DeğiĢik koĢullardaki hücrelerden Western-blot için lizat hazırlanması
ġekil 30. Proteinlerin SDS’e bağlanması sonucu denatürasyonu
ġekil 31. Protein ekspresyonlarının Western blot yöntemi ile incelenmesi basamakları ġekil 32. HCAE hücrelerinde 10, 50 ve 100 M resveratrolün 1, 12 ve 24 saat inkübasyonları ile elde edilen % sitotoksisite değerlerinin grafikle gösterimi ġekil 33. 10, 50 ve 100 M resveratrol ile 24 saat inkübe edilen HCAE hücrelerin faz-kontrast mikroskobik görüntüleri
ġekil 34. HCAE hücrelerinde 100, 250, 500, 750 ve 1000 M H2O2 ve 1, 3 ve 6 saat
inkübasyonu ile elde edilen % sitotoksisite değerlerinin grafikle gösterimi ġekil 35. Hasar modeli oluĢturma deneyinde: Kontrol grubu ve 100, 250, 500, 750 ve 1000 M H2O2 ile 1 saat inkübasyona bırakılan HCAE hücrelerinin
faz-kontrast mikroskobik görüntüleri
ġekil 36. 10, 50 ve 100 M resveratrolün 1, 12 ve 24 saat preinkübasyonunda elde edilen % sitotoksite değerlerinin grafikle gösterimi
ġekil 37: Resveratrolün koruyuculuk deneyinde, 10, 50 ve 100 M RSV ile
preinkübasyona bırakıldıktan sonra 1 saat 750 M H2O2 ile inkübe edilen HCAE
hücrelerinin faz-kontrast mikroskobik görüntüleri
ġekil 38. HCAE hücrelerinde farklı koĢullarda ROS oluĢumuna etkisinin grafiksel gösterimi ġekil 39. HCAE hücrelerinde resveratrolün farklı konsantrasyonlarının ROS oluĢumuna etkisinin grafiksel gösterimi
ġekil 40. BSA standart kalibrasyon eğrisi
ġekil 41. HCAE hücrelerinde Kontrol grubu ve deney gruplarında indirgenmiĢ glutatyon düzeylerinin grafiksel gösterimi
ġekil 42. HCAE hücrelerinde kontrol grubu ve deney gruplarında yükseltgenmiĢ glutatyon düzeylerinin grafiksel gösterimi
ġekil 43. Kontrol grubu ve deney gruplarında yükseltgenmiĢ glutatyon (GSSG) ve
indirgenmiĢ glutatyon (GSH) bulgularının karĢılaĢtırılmalı olarak grafiksel gösterimi ġekil 44. Kontrol grubu ve deney gruplarında aktin ekspresyonunun Western blot
bulguları
ġekil 45. Kontrol grubu ve deney gruplarında γ- Glutamil Sistein Sentetaz ekspresyonunun Western blot bulguları
ġekil 46. Kontrol grubu ve deney gruplarında γ- Glutamil Sistein Sentetaz Western blot spotlarının dansitometrik analizi
ġekil 47. Kontrol grubu ve deney gruplarında Glutatyon Peroksidaz-1 ekspresyonunun Western blot bulguları
ġekil 48. Kontrol grubu ve deney gruplarında Glutatyon Peroksidaz Western blot spotlarının dansitometrik analizi
ġekil 49. Kontrol grubu ve deney gruplarında Glutatyon Redüktaz ekspresyonunun Western blot bulguları
ġekil 50. Kontrol grubu ve deney gruplarında Glutatyon Redüktaz Western blot spotlarının dansitometrik analizi
KISALTMALAR
ROS : Reaktif Oksijen Ürünleri H2O2 : Hidrojen Peroksit O2•− : Süperoksit Anyonu OH• : Hidroksil Radikali
NO• : Nitrik Oksit TG6Y
GSH : ĠndirgenmiĢ Glutatyon GSSG : YükseltgenmiĢ Glutatyon GPx : Glutatyon Peroksidaz
RSV : Resveratrol
γ-GCS : γ-Glutamil Sistein Sentetaz GCL : Glutamat Sistein Ligaz LPH : Laktaz Florizin Hidrolaz CBG : Sitozolik-ß-Glukozidaz
SGLT1 : Sodyuma Bağlı Glukoz Transporter 1 UGT : UDP-Glukuronoziltransferaz
MAPK : Mitojen Aktive Protein Kinaz PI3K : Fosfotidilinozitol-3- Kinaz
PKB : Protein Kinaz B
VCAM : Vasküler Adezyon Molekül-1 ICAM-1 : Hücre Ġçi Adezyon Molekülü-1
oxLDL : Okside LDL
NFκB : Nükleer Faktör Kappa B
VEGF : Vasküler Endoteyal Büyüme Faktörü MCP-1 : Monosit Kemoatraktant Protein-1 cGMP : Guanozin 3’,5’–Monofosfat AP-1 : Aktivatör Protein-1
JNK : Jun N-terminal Kinaz
ERK : Extracellular signal-regulated kinase TNF-α : Tümör Nekroz Edici Faktör-α eNOS : Endotelyal Nitrik Oksit Sentaz iNOS : Ġndüklenebilir Nitrik Oksit Sentaz
DTT : Ditiyotreitol
APS : Amonyum persülfat
TEMED : Tetrametiletilendiamin
HPLC : Yüksek performanslı sıvı kromatografisi
LDH : Laktat dehidrogenaz
HPF : Hidroksifenil floresin fluoresans HCAEC : Ġnsan koroner arter endotel hücresi INT : Ġodotetrazolium klorid
ÖZET
RESVERATROLÜN İN VİTRO HİDROJEN PEROKSİT İLE İNDÜKLENEN İNSAN KORONER ARTER ENDOTEL HÜCRE HASARINA OLASI ETKİSİNİN İNCELENMESİ
Oya Sayın
Dokuz Eylül Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü 35340 Balçova-İzmir
oya.sayin@deu.edu.tr
Giriş: Oksidatif stres, reaktif oksijen ürünlerinin oluĢumu ve yıkılımı arasındaki bir dengesizlik
olarak tanımlanmaktadır. Vasküler ve enflamatuvar hücrelerden kaynaklanan hidrojen peroksit, oksidatif stresi indükleyerek endotelde fonksiyon kaybına neden olmaktadır. Bu da koroner arter hastalığı, kalp yetmezliği, hipertansiyon, periferal arter hastalığı ve diyabet gibi hastalıklarda önemlidir. Enzimatik antioksidan savunma kaynakları süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz ve katalazı kapsamaktadır. Enzimatik olmayan antioksidanlar askorbik asit, α-tokoferol, glutatyon, karotenoidler, flavonoidler, stilbenler ve diğerleridir. Resveratrol; stilbenlerin alt grubu olup, üzüm ve kırmızı Ģarapta bulunan polifenolik bir bileĢiktir. Antienflamatuvar, antioksidan, antikanser, sitoprotektif ve kardioprotektif etkilere sahiptir.
Amaç: Literatürde resveratrolün hidrojen peroksit hasarı ile indüklenen endotel hücresi
üzerine in vitro etkisinin araĢtırıldığı bir çalıĢmaya rastlanmamıĢtır. Bu çalıĢmanın amacı, resveratrolün in vitro insan koroner arter endotel hücresini hidrojen peroksit hasarına karĢı koruyucu etki gösterip göstermediğini araĢtırmaktır. Bu amaçla hücre sitotoksisitesi, reaktif oksijen ürünleri oluĢumu, γ-glutamil sistein sentetaz, glutatyon redüktaz ve glutatyon peroksidaz enzimlerinin protein ekspresyonları ve glutatyon düzeyi incelenmiĢtir.
Gereç ve Yöntem: Bu çalıĢmada; in vitro insan koroner endotel hücrelerinde resveratrolün değiĢik konsantrasyonları ve preinkübasyon sürelerinde hidrojen peroksit’in indüklediği hücre sitotoksisitesi üzerine etkileri araĢtırıldı. Resveratrolün hücre hasarındaki etkisi hücre sitotoksisite değerlendirme testi olan laktat dehidrogenaz ile incelendi. Hasar modelinde resveratrolün değiĢik konsantrasyonlarının çeĢitli preinkübasyon sürelerinde ve zaman dilimlerinde reaktif oksijen ürünleri oluĢumuna etkisi oksidan duyarlı bir fluoresans prob olan hidroksifenil floresin kullanılarak değerlendirildi. Resveratrolün antioksidan etkileri γ-glutamil
sistein sentetaz, glutatyon redüktaz ve glutatyon peroksidaz enzimlerinin protein ekspresyonları Western blot yöntemi ile değerlendirildi. Ġn vitro insan koroner endotel hücrelerinde resveratrolün glutatyon düzeyine etkisi de yüksek performanslı sıvı kromatografisinde değerlendirilmiĢtir.
Bulgular: Resveratrolün 10 ve 50 M konsantrasyonlarının 1, 12 ve 24 saat preinkübasyon
sürelerinde 1 saat, 750 M hidrojen peroksit’in oluĢturduğu sitotoksisiteyi istatistiksel olarak anlamlı azalttığı saptanmıĢtır (p<0.05). 10, 50 ve 100 M resveratrol ile 24 saat preinkübasyon süresinde resveratrolün 15., 60. dakika ve 6. saat zaman noktalarında reaktif oksijen ürünleri oluĢumunu da anlamlı olarak azalttığı saptanmıĢtır (p<0.05). Resveratrol, indirgenmiĢ glutatyon düzeyiniı anlamlı olarak arttırmaktadır (p<0.05). Yine resveratrol oksidatif hasarda görülen, γ-glutamil sistein sentetaz, glutatyon peroksidaz-1 ve glutatyon redüktaz enzimlerinin protein ekspresyonlarını anlamlı olarak arttırmaktadır (p<0.05).
Sonuç: Tüm bulgular birbirlerini destekleyici özellikte olup, araĢtırma koĢullarında
resveratrolün çeĢitli yönlerden insan koroner arter endotel hücre hasarına koruyucu etki gösterdiğine iĢaret etmektedir. Bu araĢtırmanın sonuçlarının kardiyovasküler hastalıklarda oluĢan oksidatif stresin geri döndürülmesinde kullanılabilecek yeni terapötik yaklaĢımlara ıĢık tutabileceği düĢünülmektedir.
ABSTRACT
THE INVESTIGATION OF THE POSSIBLE EFFECTS OF RESVERATROL ON HUMAN CORONARY ARTERY ENDOTHELIAL CELL DAMAGE INDUCED BY
IN VITRO HYDROGEN PEROXIDE
Oya Sayın
Dokuz Eylül University Health Sciences Institute 35340 Balçova-İzmir
oya.sayin@deu.edu.tr
Introduction: Oxidative stress is defined as an imbalance between the production and
destruction of reactive oxygen species. Hydrogen peroxide resulting from vascular and inflammatory cells causes endothelial dysfunction by inducing oxidative stress, which is of importance in coronary artery disease, cardiac failure, hypertension, peripheral artery disease and diabetes. Defense sources of enzymatic antioxidant include superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione catalase. Non-enzymatic antioxidants are ascorbic acid, α-tocopherol, glutathione, carotenoids, flavonoids, stilbenes and others. Resveratrol, a subclass of stilbenes family, is a polyphenolic compound found in grapes and red wine. It has anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-apoptotic, cytoprotective, anti-cancer and cardio-protective effects.
Aim: No research conducted on in vitro effects of resveratrol on endothelial cells induced by hydrogen peroxide damage have been found in the literature. The purpose of this study is to investigate whether resveratrol can protect in vitro human endothelial cells against hydrogen peroxide damage. Therefore, cell cytotoxicity, production of reactive oxygen species, expressions of γ-glutamylcysteine synthetase, glutathione reductase and glutathione peroxidase enzymes and glutathione levels were investigated.
Materials and methods: In this study, various concentrations of resveratrol found in in vitro human coronary endothelial cells and the effects of resveratrol on cell cytotoxicity induced by hydrogen peroxide during pre-incubation periods were investigated. The effect of resveratrol on cell damage was investigated with the lactate dehydrogenase test, a test used for the evaluation of cell cytotoxicity. The effects of various concentrations of resveratrol on the production of reactive oxygen species during various pre-incubation periods and time slices were evaluated by using hydroxyphenyl fluorescein, an oxidant-sensitive fluorescent probe. Anti-oxidant effects of resveratrol, protein expressions of γ-glutamylcysteine synthetase, glutathione peroxidase and glutathione reductase enzymes were evaluated with the Western blot method. The effects of resveratrol on the glutathione level in vitro human coronary endothelial cells were evaluated with high performance liquid chromatography.
Results: It was determined that 10 and 50 M concentrations of resveratrol statistically
significantly decreased the cytotoxicity induced by 750 M hydrogen peroxide during 1, 12 and 24-hour pre-icubation periods for one hour (p<0.05). It was also determined that 10, 50 and 100 M concentrations of resveratrol statistically significantly decreased the production of reactive oxygen species at 15th and 60th minutes and 6th hour during the 24-hour
pre-icubation periods (p<0.05). Resveratrol statistically significantly increases the reduced glutathione levels (p<0.05). Resveratrol increases the protein expressions of γ-glutamylcysteine synthetase, glutathione peroxidase-1 and glutathione reductase enzymes (p<0.05).
Conclusion: All the data support each other and suggest that resveratrol has a protective
effect on the human coronary artery endothelial cell damage. It is thought that the findings obtained in this study can light the way to the new therapeutic approaches to be used for the reversal of oxidative stress which develops in cardiovascular diseases.
B R NC BÖLÜM
1. G R VE AMAÇKan damar duvar ile kan ak aras nda yer alan endotel, bas nç ve germe kuvveti gibi mekanik uyar lara; vazoaktif maddeler gibi hormonal uyar lara duyarl d r ve yan t olarak vazomotor i levi düzenleyen, enflamatuvar olaylar tetikleyen ve homeostaz etkileyen çe itli etmenlerin sal nmas n sa lamaktad r (1). Fizyolojik ko ullar alt nda, damar duvar nda reaktif oksijen türlerinin olu umu ve elimine edilmesi bir denge halindedir. Oksidan enzimlerin aktivitesindeki artma ve/veya antioksidan enzimlerin aktivitesindeki azalma oksidatif strese neden olmaktad r (2). Oksidatif stres; hidrojen peroksit ve süperoksit gibi endojen reaktif oksijen türlerinde art ile karakterizedir. Dü ük düzeyde hidrojen peroksit, fizyolojik hücresel olaylar düzenlemekte, enflamatuvar durumda izlenen yüksek düzeyde hidrojen peroksit ise genellikle endotelde i lev kayb na ve/veya sitotoksisiteye neden olmaktad r. Bu ko ullarda hidrojen peroksit metabolik yollar ve intrasellüler sinyal kaskad n düzenleyerek dolayl rol oynamaktad r. Oksidatif stres; kardiyovasküler hastal klar, kanser, nörolojik hastal klar, diyabet ve ya lanma gibi hastal klar n patogenezinde önemli bir rol oynamaktad r. Oksidatif stres ile ilgili savunma mekanizmalar ; bu mekanizmalar n engellenmesi, onar m , fiziksel savunma ve antioksidan savunmay kapsamaktad r. Enzimatik antioksidan savunma süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz ve katalaz kapsamaktad r. Enzimatik olmayan antioksidanlar askorbik asit, --tokoferol, glutatyon, karotenoidler, flavonoidler, stilbenler ve di erleridir. Normal ko ullar alt nda bu antioksidanlar n hücre içi düzeyi ve etkinlikleri aras nda bir denge söz konusudur. Bu denge, organizman n canl l ve sa l aç s ndan gereklidir.
Resveratrol, stilbenlerin alt grubu olup, üzüm ve k rm z arapta bulunan polifenolik bir bile iktir. Antienflamatuvar, antioksidan, sitoprotektif, antikanser ve kardioprotektif etkileri bulundu u bildirilmi tir (3,4). Fransa’da k rm z arap tüketimi ile kardiovasküler hastal k s kl aras nda ters orant saptanm t r (Frans z paradoksu)(5).
Literatür incelendi inde resveratrolün in vitro protektif etkilerinin mekanizmalar na yönelik çal malar rat kardiyomyosit hücrelerinde (6), rat aort düz kas hücrelerinde (7) ve s r aort endotel hücrelerinde (8) de i ik hasar modellerinde gerçekle tirilmi tir. :nsan koroner arter endotel hücrelerinde in vitro oksidatif hasar modeli kullan larak resveratrolün glutatyon ve döngüsünde görev alan glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz ve ;-glutamil sistein sentetaz enzimlerinin protein ekspresyonlar na etkisini ara t ran bir çal ma bulunmamaktad r.
Bu ara t rman n temel amac , hidrojen peroksit ile in vitro ortamda insan koroner arter endotel hücresinde olu turulan hasarda resveratrolün olas koruyucu etkisinin de erlendirilmesidir. Önce sitotoksisite ve ROS ölçümü ile incelenmesi amaçland . Sitotoksisite bulgular ile ROS bulgular n n birbirlerini destekleyip desteklemediklerinin
de erlendirilmesi planland . Ayr ca ara t rman n di er bir yönü glutatyon ve
metabolizmas nda yer alan enzimlerin ekspresyonlar n n de erlendirilmesidir. Glutatyon metabolizmas nda görev alan enzimler olarak ;-glutamil sistein sentetaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktaz n incelenmesi hedeflenmi tir. Ayr ca, indirgenmi ve yükseltgenmi glutatyon dengesinin ara t r lmas amac yla total glutatyon ve indirgenmi glutatyon parametrelerinin çal lmas uygun bulunmu tur. Glutatyon bulgular ile ROS bulgular n n birbirlerini destekleyip desteklemedi inin gözlenmesi hedeflenmi tir.
Antioksidan etkileri çe itli dokularda gösterilmi resveratrolün koroner arter endotel hasar n önlemede de olumlu etkileri olabilece i dü ünülmektedir. Ara t rman n hipotezi, “in vitro insan koroner arter endotel hücrelerinde olu turulan hasar modelinde resveratrol hücre sitotoksisitesini ve ROS düzeyini azaltarak ve glutatyon ve glutatyon metabolizmas nda ilgili enzimlerin ekspresyonunu artt rarak oksidatif strese kar korumaktad r” eklinde formüle edilmi tir. Bu ara t rmadan elde edilece i dü ünülen verilerin oksidatif stres durumunda endoteli koruyacak tedavi stratejilerinin geli tirilmesine k tutaca öngörülmektedir. Koroner arter endotel hasar n önlemede olumlu etkilerinin saptanmas durumunda özellikle yüksek riskli hastalarda resveratrol kullan m n n söz konusu olabilece i dü ünülmektedir.
K NC BÖLÜM
2. GENEL B LG LER2.1. REAKT F OKS JEN TÜRLER
Serbest radikaller atomik ya da moleküler orbitallerinde bir ya da daha fazla e le memi elektronlar içeren molekül parçaç klar ya da moleküller olarak tan mlanmaktad r. Bu e le memi elektron/ elektronlar serbest radikallerin reaktivite derecesini belirlemektedir. Reaktif oksijen türleri (“reactive oxygen species” - ROS) ailesi moleküler oksijenin indirgenmesinden kaynaklanan fazlaca biyoaktif, k sa ömürlü molekülleri içerir (9). Yayg n olan reaktif oksijen türlerinden baz lar hidrojen peroksit (H2O2), süperoksit anyonu (O2•F) ve
hidroksil (OH•) radikalidir. Reaktif oksijen türleri yüksek konsantrasyonda bulundu unda
hücresel proteinlere ve lipidlere zarar verebilir ve DNA’da eklentiler olu turarak karsinojenik aktiviteyi ba latabilir. Oksijenden kaynaklanan radikaller (reaktif oksijen türleri) canl sistemlerde en önemli radikal türleridir. Moleküler oksijen (dioksijen) özel bir elektronik konfigürasyona sahiptir ve kendisi bir radikaldir. Dioksijene bir elektron eklenmesiyle süperoksit anyon radikali olu ur. Süperoksit anyonu metabolik i lemler arac l ile ya da fiziksel radyasyon ile olu ur ve “primer ROS” olarak adland r l r. Primer ROS daha sonra direkt ya da enzimler/ metal ile katalize edilen reaksiyonlarla di er moleküllerle etkile ime geçer ve “sekonder ROS” moleküllerini olu turur (10).
2.2. H DROJEN PEROKS T N METABOL ZMASI
Memeli hücrelerinde ROS’un enzimatik kaynaklar ; mitokondrial elektron transport zinciri, ara idonik asiti metabolize eden lipooksijenaz ve siklooksijenaz enzimleri, sitokrom P450, ksantin oksidaz, NADPH oksidazlar, e le memi nitrik oksit sentaz, peroksidazlar ve di er hemoproteinlerdir (Jekil 1). Bu sistemler özellikle süperoksit (O2•F) olu turmak üzere
moleküler oksijenin bir elektron al p indirgenmesini katalize ederler. O2•F, h zla nitrik oksit’i
(NO•) inaktive ederek peroksinitrit olu turur. Normal ko ullar alt nda süperoksit molekülü
spontan olarak ya da süperoksit dismutaz enzimi ile H2O2’e dönü mektedir. NO• kayb
H2O2’nin olu umunda art a yol açmaktad r. Ksantin oksidaz ve glukoz oksidaz gibi enzimler
oksijene direkt iki elektron vererek H2O2 olu turmaktad r. H2O2’in e le memi elektronu
O2•F radikali ve H2O2, Fe gibi a r metallerle fazlaca reaktif olan hidroksil radikalini (OH•)
olu turmak üzere Fenton reaksiyonuna kat lmas d r. Myeloperoksidaz ve katalaza ba land nda H2O2, nitrik oksit radikalini (NO•) nitrojen dioksit anyonuna okside eden bile ik
I’i olu turur. Bu s rada nitrojen dioksit anyonu (NO2-), nitrojen dioksit radikaline (NO2•)
dönü mektedir. Nitrojen dioksit radikali nitrotirozinlerin olu umu gibi nitratlay c olaylara kat lmaktad r (11). Memeli hücrelerinde glutatyon peroksidaz H2O2’in dü ük
konsantrasyonlar n n katalaz ise H2O2’in yüksek konsantrasyonlar n n eliminasyonunda önem
ta maktad r. Glutatyon peroksidaz n enzimatik etkisi, indirgenmi glutatyonun (GSH) glutatyon redüktaz ile NADPH kullan larak yenilenmesine ba ml d r. NADPH, pentoz fosfat yolu ile olu makta ve h z s n rlay c enzim glukoz-6-fosfat dehidrogenaz ile kontrol edilmektedir (12).
2.3. H DROJEN PEROKS T N S NYAL MEKAN ZMALARI
Memeli hücrelerinde submikromolar konsantrasyonunda bulunan H2O2’in fonksiyonu
konusunda bilinenler azd r. Memeli hücre kültüründe tirozin kinaz, mitojen aktive protein kinaz (MAP kinaz), epidermal büyüme faktörü reseptörü, potasyum kanallar ve aktivatör protein-1 (AP-1) ve nükleer faktör kappa B (NFLB) gibi transkripsiyon faktörleri H2O2 ile
aktive olmaktad r (10). H2O2; endotel hücre büyümesi ve apoptozun düzenlenmesinde
arac l k eden sinyal yollar na kat lmaktad r. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) gibi mitojenik uyaranlar süperoksidi ve sonras nda da hidrojen peroksidi olu turmak üzere NADPH oksidazlar aktive eder. H2O2; büyüme sinyalleri ile ilgili olan p38 MAPK, ERK1/2
(Extracellular signal-regulated kinase) ve transkripsiyonel faktörlerin aktivasyonuna arac l k etmektedir. Daha yüksek konsantrasyonlarda H2O2, Fas ve Jun N-terminal kinaz (JNK)
yollar n aktive ederek apoptoza neden olmaktad r. H2O2, aktin iskeleti ve bariyer
fonksiyonlar n da düzenlemektedir. Trombin gibi hücre d uyaranlara kar olu an hücre içi H2O2 fosfolipaz D ya da kalsiyum kalmodulin ba l protein kinaz II’ye ba l ERK1/2
aktivasyonunu indükleme yetene indedir. Daha ileri sinyal yolu tropomiyozini-1’i aktive ederek aktin iskeletinin ve bariyer fonksiyonunun düzenlenmesinde görev almaktad r. Protein kinaz C (PKC), protein kinaz A (PKA) ve kalsiyum gibi çe itli kinazlar H2O2’in indükledi i
endotel bariyerinin fonksiyon kayb nda da yer almaktad r. H2O2, eNOS ekspresyonu ve
endotele ba l vazorelaksasyonada arac l k etmektedir. Fizyolojik ko ullarda damarlarda H2O2; endoteliyal nitrik oksit sentaz (eNOS)’ PI3K/AKT (Fosfotidil inozitol-3-kinaz/ aktive
serin treonin kinaz) sinyal yolu ile aktive etmekte bu da nitrik oksite ba l relaksasyona neden olmaktad r. H2O2, endotelde enflamatuvar yan t n düzenlenmesinde de rol
oynamaktad r. H2O2; tümör nekroz edici faktör-- (TNF--), hipoksi gibi hücre d uyaranlara
cevap olarak NFLB gibi transkripsiyon faktörünü aktive ederek hücre içi adezyon molekülü-1 (ICAM), vasküler adezyon molekül-1 (VCAM), MCP-1 (monosit kemoatraktant protein-1) gibi enflamatuvar proteinlerin endotelde indüksiyonuna arac l k etmektedir (11).
2.4. H DROJEN PEROKS T VE ENDOTEL
Kan ve vasküler düz kas hücreleri aras nda yer alan endotel hücreleri birçok vazoaktif maddelerin sal nmas nda, trombosit agregasyonunda, vasküler yap n n kontrolünde görev almaktad r. Fizyolojik artlar alt nda endotelden sal nan maddelerin ba l ca etkileri vazodilatasyon, antiproliferatif ve antiagregan olmalar d r. Bu etkileri dokuda kan ak n n düzenlenmesi, kan bas nc ndaki yüksekli in s n rland r lmas n sa lamaktad r (13). Endotel’in kan damarlar içindeki pozisyonu kan ve vasküler düz kas hücreleri aras nda bir bariyer görevi üstlenmesini sa lamaktad r. Bu nedenle endotel’in fonksiyonel bütünlü ü vasküler s z nt ve ateroskleroz olu umunun önlenmesinde önemlidir (14,15).
Endotel hücreleri O2•, H2O2, OH•, nitrik oksit ve peroksinitrit radikalleri kapsayan reaktif
oksijen türleri olu turmaktad r. O2• ve H2O2 gibi reaktif oksijen türlerinin endotel
fonksiyonunda önemli etkileri vard r. Hem fizyolojik olarak düzenlenmesinde hem de hastal klar n patofizyolojisinde yer al rlar (16).
Ba ka bir faktör yoksa, hidrojen peroksit memeli hücrelerine mitojenik etkilidir. Çe itli hücre kültürlerinde dü ük konsantrasyonda H2O2 proliferasyonu ya da hücre ya am n
uyarmaktad r. Dü ük konsantrasyondaki H2O2endotel hücrelerinde proliferasyona ilave olarak
hem migrasyonu hem de tüp olu umunu uyarmaktad r (17). Dü ük konsantrasyonlarda (nano-mikromolar) çe itli sinyal yollar n aktive etmenin yan s ra yüksek konsantrasyonda olu tu unda, H2O2’in a r metallerle reaksiyonu sonucu olu an hidroksil radikali, proteinleri,
lipidleri okside etmekte, DNA ipliklerinde k r klara neden olmaktad r (11). Plazmada H2O2hem
proteinleri, sülfidril gruplar ve askorbat ile reaksiyona girdi inden dolay dü ük düzeyde tutulmaktad r. H2O2hücre membranlar ndandifüze olabilen stabil bir reaktif oksijen türüdür.
Bu yüzden endotel hücreleri subendotel bo lukta intimal düz kas hücreleri ve enflamatuvar hücrelerinden olu an H2O2’e daha fazla maruz kal rlar. H2O2’nin vasküler hücre hasar n
indükleme mekanizmas tamamen anla lamam t r. H2O2 e le memi elektron
içermemektedir ve bundan dolay birçok ROS’dan daha az reaktiftir. Böylece, direkt oksidatif hasar n d nda ba ka bir mekanizma vasküler hücrelerde H2O2’in sitotoksik etkilerine katk da
bulunmaktad r. Jöyle ki, enflamatuvar bir durumda olu an H2O2’in yüksek konsantrasyonlar
myeloperoksidaz ile daha reaktif moleküller olan hipokloröz ve nitrozilleyici ürünleri olu tururlar. Bu oksidanlar çe itli antioksidan sistemlerle ortamdan uzakla t r rlar. Ancak bunlar hücrelerin antioksidan kapasitelerini a t klar zaman hücrelere zarar vererek çe itli hastal klara yol açarlar (18).
2.5. OKS DAT F STRES VE KARD YOVASKÜLER HASTALIKLAR
“Oksidatif stres”, prooksidanlar n antioksidan kapasitesini a arak reaktif oksijen türleri olu umunda art ile sonuçlanan, denge durumunun de i mesi olarak tan mlanmaktad r (19). Fizyolojik artlar alt nda endotelden sal nan maddelerin ba l ca etkileri vazodilatasyon, antiproliferasyon ve antiagregasyondur. Homeostaz durumunda endotel dokuda kan ak n n düzenlenmesi, damar tonusu ve kan bas nc ndaki yüksekli in s n rland r lmas sa lanmaktad r (4). Endotel tabakan n kan damarlar içindeki yerle imi kan ve vasküler düz kas hücreleri aras nda bir bariyer görevi üstlenmesini sa lamaktad r. Bu nedenle endotelin i levsel bütünlü ü vasküler s z nt ve ateroskleroz olu umunun önlenmesinde önemlidir (20). ROS damar duvar nda; endotel hücrelerinin büyümesi, damar duvar n n yeniden düzenlenmesinde ve endotel i levlerine ikinci mesajc olarak kat larak fizyolojik bir rol oynamaktad r (19). Endotelde damar homeostaz n n sürdürülmesi birçok faktörle olmaktad r. Endotel damar tonusunu vazokonstrüktürler (Anjiyotensin II, tromboksan A2 ve endotelin-1 gibi) ve vazodilatörler (Nitrik oksit: NO, prostasiklin, prostaglandin E2 gibi) olu turarak dengelemektedir (20). Vasküler homeostazisin sürdürülmesinde NO önemli rol oynamaktad r. Serbestçe difüze olabilen bir molekül olan NO’in; p ht olu umunu önlemesi, düz kas hücre proliferasyonunu suprese etmesi, vazodilatasyona neden olmas ve vasküler duvara lökosit yap mas n azaltmas gibi görevleri bulunmaktad r. Tüm bu olaylar aterosklerozun ba lamas ve ilerlemesinde yer alan süreçlerdir ve NO’in anti-aterosklerotik ajan oldu u dü ünülmektedir. Endotel NO biyobulunabilirli inin azalmas endotel fonksiyon kayb n n yayg n bir nedenidir. Oksidatif stres endotel fonksiyon kayb n n geli mesinde direkt ve indirekt rol oynamaktad r. Endotel fonksiyon kayb nda direkt mekanizma, endotel kaynakl NO’nun süperoksit taraf ndan inaktive edilmesi ve peroksinitrit olu mas d r. NO; guanil siklaz aktive eder ve damar düz kaslar nda cGMP (guanozin 3’,5’–monofosfat) olu umunu artt rarak relaksasyona neden olmaktad r. Peroksinitrit guanil siklaz için daha zay f agonisttir ve vasküler homeostaziste önemli olan prostasiklin sentaz n nitrasyonuna ve böylece enzimin inaktivasyonuna neden olur. Prostasiklin vasküler relaksasyona neden oldu undan, prostasiklin kayb artm oksidatif stres durumunda endotelin fonksiyon kayb na katk da bulunacakt r. Ayr ca peroksinitrit potent bir oksidand r, tetrahidrobiyopterini ya da eNOS’un çinko tiyolat ile bir araya gelmesini okside eder ki bu durum eNOS’un e le memesi olarak tan mlanan, eNOS’un NO yerine süperoksit radikali olu turmas ile sonuçlan r. Böylece artan süperoksit; sadece endotel kaynakl NO’i inaktive etmez; ayn zamanda peroksinitrit olu umu
kayb na katk da bulunmaktad r. ROS ürünleri art indirekt mekanizma ile vasküler homeostazi etkilemektedir: oksidatif stres dü ük dansiteli lipoproteinleri (LDL) okside ederek aterosklerozu ilerletmektedir. LDL’nin oksidasyonu sonucunda endotel hücre toksisitesi, endotele lökosit adezyonu ve sub endotel bo lu a lökositlerin migrasyonu olu maktad r. Tüm bu olaylar endotel fonksiyon kayb sürecinde yer almaktad r. Okside LDL, NO’i de inaktive etmektedir bu nedenle ROS olu umunun vasküler homeostaziste ve aterosklerozda çok say da etkileri bulunmaktad r (21,22). Endotelde fonksiyon kayb olmas , vazodilatasyonun azalmas yönünde giden çe itli olaylar ile karakterizedir. Vasküler sistemde reaktif oksijen türlerinin art ; endotele ba l dilatasyonu azalt r, arter lümeninin daralmas sonras nda periferal direncin ve kan bas nc artmas na neden olan hipertansiyonla birliktedir. Endotel fonksiyonunun bozulmas ile antitrombik faktörlerin kayb protrombik faktörlerin art , enflamasyon, vazodilatasyon kayb ve düz kas hücre proliferasyonu meydana gelmektedir (20). Oksidatif stres; koroner arter hastal , kalp yetmezli i, hipertansiyon, periferal arter hastal ve diyabet gibi hastal klar kapsayan kardiyovasküler hastal klar n patogenezinde önemli rol oynamaktad r (2). Sonuçta endotel fonksiyon kayb ; hem ateroskleroz hem de vasküler hastal klar n ilk belirtisidir. Endotel fonksiyonlar n n iyile tirilmesi ya da artt r lmas aterosklerozun geli imini önleyecek, bu da kardiyovasküler hastal klar n azalmas ile sonuçlanacakt r ( ekil 2) (21).
•Ksantin Oksidaz •NADPH Oksidaz •Di-er kaynaklar
Nitrik Oksit’in biyoyararlan3m3 Endotel fonksiyon kayb3
Trombosit Agregasyonu
Vazodilatasyonun Kayb3 nflamasyon
Düz Kas hücre Proliferasyonu O2•< Oksidatif Stres H2O2 NO• ROS •E=le=memi= eNOS
•Ksantin Oksidaz •NADPH Oksidaz •Di-er kaynaklar
Nitrik Oksit’in biyoyararlan3m3 Endotel fonksiyon kayb3
Trombosit Agregasyonu
Vazodilatasyonun Kayb3 nflamasyon
Düz Kas hücre Proliferasyonu O2•< Oksidatif Stres H2O2 NO• ROS •E=le=memi= eNOS
2.6. ANT OKS DANLAR
2.6.1. HÜCRE Ç ANT OKS DAN S STEMLER 2.6.1.1. Glutatyon
Glutatyon hücresel antioksidan savunmada görev alan glutamik asit, sistein ve glisinden olu an protein olmayan bir tiyol (sülfidril) bile i idir (23). Hücre içi glutatyon büyük ço unlu u (> % 98) sitozol ve çekirdekte indirgenmi form (GSH) olmak üzere az miktarda glutatyon konjugatlar (GS-R), merkaptidler (Cr, Cu (I), Cu (II), Se, Zn), tiyoeter ve tiyoester formlar n n yan s ra yükseltgenmi disülfit dimer formu (GSSG) eklinde bulunmaktad r. Jekil 3’de indirgenmi glutatyonun yap s görülmektedir. Sitoplazmada GSH/GGSG oran 10:1’dir (24). Hücrelerdeki oksidatif stres, GSH ve GSSG durumu ölçülerek de erlendirilebilir ve s kl kla bu ikisi aras ndaki oran olarak ifade edilir. Bu oran oksidatif stresin önemli oldu u hastal klar n klinik göstergesi olarak de erlendirilmektedir (25,26). GSH, oksidatif stresin birikimini yans tan ya lanmaya ba l durumda GSSG’ye yükseltgenmi olur. Glutatyonun yükseltgenmi formu glutatyon disülfid’tir (GSSG) (21). Hücrelerdeki GSH’ n büyük ço unlu u sentez edildi i yer olan sitoplazmada bulunur ( ekil 3)(27).
Normal ko ullarda hücre içi GSH düzeyi ba l ca iki mekanizma ile düzenlenmektedir: sentez h z n n kontrolü ve hücre d na ç kmas . Bununla birlikte GSH düzeyi hücrenin tiyol dengesini de i tiren çe itli ko ullar ve ajanlardan da etkilenmektedir. Bu durum glutatyon-S-konjugatlar ya da komplekslerinin olu mas na ve/veya glutatyonun hücre içi organellerinde da l m n n bozulmas na neden olmaktad r. Glutatyon düzeyi; hamilelik, egzersiz, beslenme, hormonal/stres düzeyinden de etkilenmektedir (28). GSH’ n sentezi iki enzimle hücre sitozolünde gerçekle mektedir. GSH’ n sentezinde ilk reaksiyon ;-glutamilsistein olu umunu sa lamak üzere L-Glutamat ile L-Sisteinin konjuge olmas d r. Bu reaksiyonu ;-glutamil sistein ligaz olarak da bilinen ;-glutamil sistein sentetaz (;-GCS) kataliz etmektedir. ;-GCS reaksiyonunda peptidik ;-zinciri olu turmak üzere glutamat’ n ;-karboksil gruplar sistein’in amino gruplar ile reaksiyona girer böylece GSH hücre içi peptidazlar n hidrolizinden korunmu olmaktad r (24). Ayr ca sisteinin bulunabilirli i de GSH sentezinde h z s n rlay c d r. Sistein ve okside aminoasit formu olan sistin hücrelere sodyuma ba l ve ba l olamayan ta y c larla hücreye al nmaktad r (29). :lk basamaktan sonra glutatyon sentetaz (GS) ile; ;-glutamilsistein’e glisin eklenerek glutatyon (GSH) meydana gelmektedir. Her iki basamakta da birer ATP molekülü kullan lmaktad r (Jekil 4) (30).
Sentezden sonra GSH mitokondri, çekirdek ve endoplazmik retikulum gibi hücre içi kompartmanlara ve hücre d bo lu a (kan plazmas ve safra) di er dokular ve hücreler taraf ndan kullan lmak üzere da lmaktad r. Çok az miktarda akci er s v s ve beyin omurilik s v s gibi hücre d bo luklara da verilmektedir. GSH ve konjugatlar apikal membrandan multidrug resistanse protein 2 (MRP2) ile geçmekte halbuki kan plazmas na bazolateral membrana geçi te MRP1 ve organik anyon transport polipeptid proteinler (Oatp 1) görev almaktad r. Hücre içi transportunda arac l k eden spesifik proteinler hakk nda bilinenler azd r. Glutatyonun mitokondriye geçi inin bir k sm dikarboksilat ve okzoglutarat ta y c s ile çekirde e geçi i ise muhtemelen çekirdek porlar ndan pasif difüzyonla gerçekle mektedir. Endoplazmik retikulma geçi i ise bilinmemektedir (Jekil 5)(28).
ekil 5. Glutatyonun hücre içi da l m ve hücre d na ç k (28)
Hücre içinde meydana gelen GSH sentezinin tersine y k m hücre d nda ekstrasellüler bo lukta meydana gelmektedir. Glutatyon katabolizmas ekstrasellüler olarak ;-glutamil transpeptidaz enzimi ile olmaktad r. ;-glutamil transpeptidaz enzimi, hücrelerin apikal yüzeylerinde eksprese edilmekte sadece GSH’ n de il glutatyon-S-konjugatlar n n ve glutatyon komplekslerinin de katabolizmas na arac l k etmektedir. ;-glutamil transpeptidaz; GSH ve GSH konjugatlar ndan ya hidroliz reaksiyonlar n katalize etmekte [serbest L-glutamik
da transpeptidasyon reaksiyonunu katalize etmektedir [;-Glutamil aminoasitler (;-Glu-AA) + sisteinil glisin (Cys-Gly) ve sisteinil glisin konjugatlar (RS-Cys-Glc) olu maktad r]. Transpeptidasyon reaksiyonunda olu an ;-glutamil aminoasitleri, hücre içi enzim ;-glutamil siklotransferaz n substrat d r ve tekrar hücrelere geri dönerler. glutamil siklotransferaz; ;-glutamilaminoasidin 5-okzoprolin ve serbest bir aminoaside dönü ümünü kataliz etmektedir. Olu an 5-okzoprolin, 5-okzoprolinaz ile glutamata dönü mektedir. Transpeptidasyon reaksiyonunda olu an di er ürünler sisteinil glisin ya da sisteinil glisin konjugatlar , sistein ile glisin aras ndaki peptid ba n y kan ektoprotein dipeptidazlar ile daha ileri hidrolize edilmektedir. Her iki reaksiyonda olu an serbest aminoasitler ve ;-glutamil aminoasitleri hücrelere geri al nmakta ve tekrar GSH’ n olu umunda kullan lmaktad r. Çünkü bu yol hücrelerden kaybolan GSH’ n tekrar döngüsünü sa layan bir yoldur (Jekil 6)(24,28).
GSH ve GSH içeren bile ikler hücrelerden sal n nca, organ içinde ve organlar aras nda glutatyonun y k m ve kullan m n söz konusudur Glutatyonun metabolizmas n n ba l ca yeri olan karaci erde; sinüzoidal bölümlerin yan s ra safra bo lu unda katabolizmas , y k m ürünlerinin baz lar n n karaci erden tekrar emilimi, sistein-S-konjugatlar n n merkaptoürik aside dönü ümü ya da aminoasitlerin kullan m gibi olaylar gerçekle mektedir. Sistein -S- konjugatlar (Cys-SR) N-asetil transferaz enziminin substrat d r, tekrar hücrelere döner ve N- asetil- sistein- konjugatlar (N-asetil- sistein- SR ya da merkaptoürik asit) olu ur. Mekaptoürik asit hücrelerden d ar ç kar, feçes ya da idrarla at l r. Mekaptoürik asidin transport mekanizmas belli de ildir.
GSH; koenzim, kofaktör ve /veya bir çok enzimin substrat d r ve konjugasyon ve redoks reaksiyonlar na kat lmaktad r. Oksidatif stres ya da elektrofilik bile iklere maruz kal nd nda, hücre içinde GSSG ve glutatyon-S-konjugatlar (GS-R) olu maktad r. Konjugasyon reaksiyonlar kendili inden meydana gelmekle birlikte bir nükleofil olarak GSH; glutatyon transferaz’ n (GST) katalize etti i reaksiyonda çe itli elektrofillerle (ksenobiyotik ya da endojen metabolitler) reaksiyona girmekte böylece GSH-konjugatlar n olu turmaktad r. GSH; glutatyon peroksidaz (GPx) ile oksidanlar n indirgenmesini, glutaredoksin (GRX), peroksiredoksinler (PRX) ve tiyoredoksinler (TRX) arac l ile de proteinlerin tiyol gruplar n n denge durumunun sürdürülmesini sa lamaktad r (Jekil 7)(28).
2.6.1.2. @-Glutamil Sistein Sentetaz (EC 6.3.2.2)
Glutatyonun de novo sentezinde h z s n rlay c enzim olan ve daha önceleri ;-glutamil sistein sentetaz (;-GCS) olarak da bilinen glutamat sistein ligaz (GCL) enzimi 73 kDa a rl nda, tüm substratlar ba lama yeri içeren a r alt birim (katalitik, GCLC) ve 28 kDa (düzenleyici, GCLR) a rl nda substrat ve inhibitörlere ba lanmada a r altbirimin afinitesini düzenleyen hafif alt birimden olu an bir heterodimerdir (31). ;-GCS enzimi altbirimler aras ndaki disülfid ba ile stabilize edilmektedir. ;-glutamat sistein sentetaz reversibl disülfid ba lar olu tu unda aktive olmakta, disülfid ba n n varl veya yoklu u enzimin substrat veya inhibitörlere kar affinitesini düzenlemektedir (32,33). Disülfid ba GSH’ n fizyolojik konsantrasyonunda (0.5 ile 10 mM) indirgenmekte; GSH düzeyinin azalmas disülfid ba olu umu ve optimum enzim aktivitesi olu umunu att rmaktad r. :nsanda a r alt birimde 14 sistein, hafif alt birimde 6 sistein bulunmaktad r. Optimum enzim aktivitesi için gereken disülfid ba lar en az iki çifttir. Bir çift disülfid ba a r alt birim ve hafif alt birim aras ndad r. :kinci disülfid ba molekül içindedir. Fizyolojik konsantrasyonlar nda glutatyon, GSH’ n feedback inhibisyonu (geriye do ru besleme) yönünde ;-glutamat sistein sentetaz enziminin
konformasyonunda de i iklik meydana getirerek moleküller aras disülfid ba n
indirgemektedir. :nsan a r alt birim kromozomun 6p12’de haritalanm t r. Tek kopya geni ve üç alleli bulunmaktad r. :nsan hafif alt birim ise 1p21’de haritalanm t r, tek kopya geni vard r (32).
Çe itli bile ikler ;-glutamil sistein sentetaz aktivitesini artt rarak redükte glutatyon düzeyini artt rmaktad r (22). Huang ve ark. (33) yapt klar çal malar nda ;-glutamil sistein sentetaz enziminin a r ve hafif alt birimleri aras nda disülfid ba olu tu unda substrat ba lama yerinin s k hale geçti ini, GSH ve di er tripeptidlerin ba lamas n n zorla t n ; subünitler aras disülfid ba n n indirgenmesinden sonra konformasyonel de i iklik ile substrat ba lanma yerinin gev ek duruma geçti i ve tripeptidlerin kolay ba lanabildi ini göstermi lerdir (Jekil 8).
ekil 8. ;-GCS enziminde disülfid ba olu umu ve indirgenmesini gösteren bir model (33)
;-GCS aktivitesini ve/veya mRNA’s n azaltan/artt ran uyaranlar ve olu an cevap konusunda bilinenler azd r. Bu de i ikliklerden sorumlu mekanizmalar tamamem bilinmemektedir. De novo glutatyon sentezinin düzenlenmesi en az üç faktör ile olmaktad r: hücrelerde ;-GCS düzeyi, substrat bulunabilirli i (özellikle sistein) ve ;-GCS üzerinde GSH’ n feed back inhibisyonu. ;-GCS aktivitesi, nitrozasyon ve fosforilasyon ile de düzenlenebilmektedir (33). Glutamat ve glisinin hücre içi konsantrasyonu yüksek oldu undan, GSH biyosentezini s n rland ran sistein konsantrasyonudur. Bu yüzden hücrelere al nan sistin ve sisteinin art GSH biyosentezini artt rmaktad r (27). GSH, ;-GCS’nin non allosterik feed back inhibitörüdür, GSH enzime ba lanmada glutamat ile yar maktad r (27).
2.6.1.3. Glutatyon Peroksidaz (EC 1.11.1.9)
Glutatyon peroksidaz (glutatyon:H2O2 oksidoredüktaz, EC 1.11.1.9; GPx) Mills
taraf ndan hemoglobini oksidatif y k mdan koruyan eritrosit enzimi olarak ilk defa 1957 y l nda ke fedilmi tir. Glutatyon peroksidazlar endotel hücrelerinde eksprese edilen ba l ca selenoproteinlerdendir. Endotelde selenoproteinlerin rolü, oksidatif hücre hasar ndan koruma yetene i ile ilgilidir. Endotelde hidroperoksitleri indirgeyerek endotel hücresinin fizyolojisinin sürdürülmesi ve oksidatif hasardan korunmas n sa lar. Endotel hücresinde özellikle süperoksit, hidroperoksit ve nitrik oksit gibi reaktif oksijen türleri ve nitrojen ürünleri olu maktad r. Bu ürünlerin metabolizmas ve fizyolojik fonksiyonlar glutatyon peroksidazlar ile düzenlenmektedir. Endotelde selenoproteinler; hücre adezyon moleküllerin ekspresyonunu kontrol ederek hücre adezyonunu, siklooksijenaz ve lipoksijenaz aktivitesini kontrol ederek eikosanoid olu umunu, süperoksit anyon/nitrik oksit dengesini sa layarak vasküler tonusun
GPx’de denen GPx-1’dir. GPx-1; H2O2’i ve kolesterol ve uzun zincirli ya asiti peroksitlerini
içeren bir grup organik hidroperoksitleri metabolize etmektedir (36). 1970’lerin ba nda iki grup, GPx-1’in selenyuma ba l enzim oldu unu göstermi tir. Daha sonralar GPx-1 proteininde selenosistein (Sec), selenyumun bir k sm olarak tan mlanm t r. Günümüzde selenosistein, sisteine benzemesine ra men yirmi birinci aminoasit olarak bilinmektedir.
Selenosistein, GPx-1’in katalitik bölgesinde bulunmakta ve sisteine yap sal olarak benzemektedir (37). GPx’ler selenyum-ba ml GPx’ler ve selenyum-ba ms z GPx’ler olarak iki gruba ayr lmaktad r. Glutatyon peroksidaz n birinci formu (GPx-1); bütün türlerde GPx-1 her biri bir selenosistein rezidüsü ta yan ve molekül a rl 22–23 kDa olan dört alt üniteden olu mu homotetramerik bir proteindir (36, 38). GPx-1’in moleküler mekanizmalar ve i levleri ekil 9’de gösterilmektedir.
Sitozolde bulunan glutatyon peroksidaz n ikinci formu gastrointestinal veya GI-GPxG1 olarak adland r lmaktad r. GPx-2 olarak adland r lan bu formu, GPx-1 ile % 60 amino asit dizi benzerli i göstermektedir. H2O2 ve ya asidi hidroperoksitleri indirgerler, fakat fosfolipid
hidroperoksitlere etkileri yoktur (36).
GPx-1’in ke finden sonra, birçok y l plazmadaki GPx aktivitesinin karaci er ve farkl organlardaki enzimin s z nt s ndan kaynaklanabilece i dü ünüldü. Selenyum artt nda enzim aktiviteleri artmakta, azald nda plazma GPx aktivitesi azalmaktayd . Plazma GPx’i (GPx-3), GPx-1 ile benzer substrat spesifitesi göstermekte ve fakat k rm z kan hücrelerini presipite eden GPx-1 antikorlar ile reaksiyona girmemektedir. Çal malarda GPx-3’ün alt birimlerinin moleküler a rl n n 23–25 kDa oldu u ve GPx-1 ile % 40–50 aras nda homoloji gösterdi i öngörülmektedir (36).
Fosfolipid hidroperoksid glutatyon peroksidaz [(PHGPx, GPx-4); 20-22 kDa a rl nda monomerik yap dad r ve substrat olarak lipid peroksitlerin yan s ra H2O2’de kullanmaktad r.
GPx-3 hücre d nda i lev gören bir glikoproteindir. Glutatyon peroksidaz benzeri di er proteinler; selenyum-ba ms z olanlar selenosistein yerine sistein içeren glutatyon peroksidazlard r (36).
Epididime spesifik glutatyon peroksidaz (GPx-5)] ve olfaktör epitelyumunda bulunan (GPx-6). Bu enzimler peroksitlerin y k m nda substrat spesifiteleri ve dokulardaki da l m farkl l k göstermektedirler (36). Yap lar aras nda da çe itlilik vard r; GPx-1,2,3 90 kDa homotetramerik yap da, altbirimlerinin molekül a rl 22-25 kDa’dur; GPx-4 20-22 kDa a rl nda monomerik enzimlerdir. GPx’ler; glutatyon redüktaz ve GSH arac l ile NADPH’dan elekron alarak hidrojen peroksit ve organik hidroperoksitlerin indirgenmesini katalize ederler böylece hücreleri oksidatif strese kar korurlar (Jekil 10) (38).
2.6.1.4. Glutatyon Redüktaz ( EC 1.6.4.2)
ROS’un hem enzimatik hem de enzimatik olmayan detoksifikasyonu GSH’dan GSSG olu umu ile sonuçlan r. GSSG’deki art hücrelere zararl oldu u için GSSG s kl kla hücrelerin d na transport edilir bu da total GSH’un azalmas ile sonuçlan r. GSSG’nin elimine etmek için daha ekonomik olan yol, glutatyon redüktaz aktivitesi iledir ve NADPH’a ba l bir reaksiyonla GSSG’den GSH olu maktad r. Mitokondri ve sitoplazmada yer alan glutatyon redüktaz, disülfid ba ile ba lanm homodimer eklindedir. Glutatyon redüktaz aktivitesindeki art a birbirinden ayr iki mekanizma arac l k edebilir: birincisi Glutatyon redüktaz aktivitesi ve/veya düzeyinde art , ikincisi hücrelerde NADPH kayna olan pentoz fosfat ant n n aktivitesinin artarak NADPH düzeyinde art . Glutatyon redüktaz; FAD-içeren piridin nükleotid disülfid oksidoredüktaz ailesindendir. Aktif enzim; her biri FAD, NADPH ve GSSG için ba lanma yerleri içeren iki altbirimden olu maktad r. Enzim NADPH’dan GSSG’ye elektron ak nda önemli rol oynayan redoks-aktif disülfid de içerir. Glutatyon redüktaz, okside glutatyonu indirgenmi hale dönü türürken, NADPH’dan gelen elektronlar yükseltgenmi glutatyonun disülfid ba na direkt olarak aktar lmaz. Önce FAD’ye aktar l r. Enzimin katalizledi i reaksiyon s ras nda FAD, NADPH taraf ndan indirgenir. Bundan gelen elektronlarda enzimin aktif merkezinde iki sistein rezidüsü aras ndaki disülfid ba na (-S-S) aktar l r. Bu ekilde –SH gruplar GSSG ile etkile ime girerek GSSG iki GSH’a indirgenmektedir. Fizyolojik artlarda reaksiyon esas olarak tek yönlüdür ve glutatyon redüktaz bu yolla hücre içerisinde GSH/GSSG oran n n yüksek tutulmas n sa lamaktad r ( ekil 10)(27, 33).
2.6.2. HÜCRE DI I ANT OKS DAN 2.6.2.1. Resveratrol
2.6.2.1.1. Yap3sal Özellikleri
Polifenoller; flavonoidler, antosiyaninler, fenolik asitler, lignanslar ve stilbenleri kapsayan bir antioksidan ailesidir. Tümü fenil alanin türevidir ve reaktif hidroksil grubu olan aromatik halka içerirler. Stilbenlerin alt s n f içinde yer alan resveratrolün (3,5,4’– trihydroxystilbene) trans ve cis izomerik formlar bulunmaktad r. Trans izomeri bitkilerde daha fazla bulundu undan dolay , üzerinde çok say da çal ma yap lm t r. Resveratrol do ada 3-O- -glukozidler (glikozile) eklinde bulunur: “Piseidler”. Resveratrolün minör konjuge formlar 1-2 metil grubu (3,5-trimethoxy-4’-hydroxystilbene: “Pterostilben” ), bir sülfat grubu ya da ya asiti içermektedir. Yer de i tirme en fazla iki hidroksil grubu ile olmaktad r, böylece konjuge polifenoller antioksidan durumun sürdürülmesini sa lamaktad r. Do al olarak olu an resveratrol analoglar üç hidroksil grubundan ziyade dört hidroksil grubu ta yan “piseatannol” (3,4,3’,5’- trans-tetrahydroxystilbene) formunda bulunmaktad r (Jekil 11) (4).
2.6.2.1.2. Kaynaklar3
Resveratrol ve analoglar (piseatannol, pterostilben) üzüm, arap, yer f st , yabanmersini, dut, çilek, bö ürtlen ve keçiboynuzunda bulunmaktad r. Resveratrol 1976 y l nda üzümde fitoaleksin olarak ke fedilmi tir. 1982 y l nda resveratrolün Çin ve Japonya’da Kojo-kon (Kojo-kon: Itadori çay olarak da bilinmektedir) olarak adland r lan; cilt enfeksiyonlar , fungal enfeksiyonlar, kalp, karaci er ve damar hastal klar nda kullan lan “Polygonum cuspidatum”un kurutulmu köklerinde bulundu u bildirilmi tir. :nsan diyeti genistein, kuarsetin, epigallokate in (soya fasulyesi, ye il çay ekstresi) ve resveratrol (üzüm kabu u, yer f st ) gibi çok say da bitki kaynakl polifenol içerir. 1970’li y llar n ba lar nda Fransa’da k rm z arap tüketimi ile kardiovasküler hastal k s kl aras nda ters orant saptanm t r: “Frans z paradoksu”. Daha sonralar bu molekülün pek çok yararl etkileri tan mlanm t r (4, 40) Trans izomeri daha stabildir ve UV, yüksek pH ile trans izomeri cis
izomerine dönü ürken görünür k ve dü ük pH’da cis izomeri trans izomerine dönü mektedir (5).
2.6.2.1.3. Biyosentezi
Resveratrol s n rl say da bitkiler taraf ndan sentezlenir. Normalde fazla miktarda bulunmaz, strese cevap olarak üretilir. Biyosentezini stilben sentaz enzimi kataliz eder. Resveratrolün biyosentezi malonil-CoA’dan üç C2 ünitesi ile p-kumarol-CoA’n n p-kumarol
kal nt s n n dekarboksilasyon ile kondensasyon sonucu meydana gelir. Daha ileri reaksiyonlar bifenolik halkan n 3. pozisyonunda do al resveratrolün glikozil ya da sülfat kal nt lar na konjuge olmas d r (Jekil 12). Resveratrol oksidatif y k ma daha duyarl iken glikozillenmi piseid formu daha dirençlidir. Glikozillenmi resveratrol biyolojik aktivitenin sürdürülmesini sa lar, daha fazla çözünür ve stabildir, böylece insan barsa ndan daha kolay emilmektedir (4).
ekil 12. Resveratrolün biyosentezi (4)
2.6.2.1.4. Diyetle Al3nan Resveratrolün Emilimi
:nsan barsak Caco-2 hücrelerinde diyetle al nan resveratrolün ço unlukla barsak düzeyinde emildi i gösterilmektedir. Resveratrolün emilimi ve ta nmas s çan barsak, insan kolon karsinom Caco-2 hücre hatt , insan hepatosit ve sa l kl bireyler gibi bir çok modelde çal lm t r. S çan ince barsak modelinde resveratrol fazla miktarda jejunumdan, az miktarda da ileumdan emilmektedir. Bazolateral tarafa transport edilen resveratrolün ço u glukuronid ve sulfat formunda konjuge edilir. Tüm perfüze edilen resveratrol ve konjugatlar n n yaln zca % 6’s barsak epitelini geçmektedir (4). Resveratrol diyet ürünlerinde cis ve trans eklinde bulunur, ço unlukla glikozillenmi formu 3-O-beta-D-glukozid’tir. Glikozilasyon resveratrolün
enzimatik olarak oksidasyonunu inhibe eder ve böylece biyolojik aktivitesini korur, stabilitesini ve biyoyararlan m n artt r r. Barsak hücrelerinde sadece aglikone resveratrol emilebildi i için emilim sürecinde glikozidazlar gerekir. Bu nedenle, yiyecekteki aglikone ve glikozile resveratrolün birbirine oranlar emilim h z n düzenler. Trans-piseidin deglikozile edilmesi ince barsakta laktaz florizin hidrolaz [Lactase phlorizin hydrolase (LPH)] ve sitozolik-ß-glukozidaz [Cytosolic-ß-glucosidase (CBG)] taraf ndan gerçekle mektedir. Enterositlerden geçi te trans– piseidin 2 yolu vard r: Birinci yol apikal membran üzerinde bulunan LPH iledir. Lümene aglikon trans-resveratrol olarak sal n r. Daha sonra apikal membrandan pasif olarak difüze olur. :kinci yol sodyuma ba l glukoz transporter 1 [Sodium-dependent glucose transporter1 (SGLT1)] ile f rçams kenar (brush-border) membran n geçtikten sonra CBG ile glukozidlerin y k m d r. Deglikozilasyondan sonra trans-piseidten trans-resveratrol olu maktad r. Trans -resveratrol enterositlerde daha ileri metabolize edilir, olu an yeni bile ik glukuronat konjugatlar d r. Major glukuronat trans-resveratrol-3-O-]-glukuronidtir. Minör olan ise,
trans-resveratrol-4'-O-]-glukuronidtir. Trans-resveratrolün glukuronidasyonu sadece karaci erde de il enterositlerde de UDP-glukuronoziltransferaz [UDP-glucuronosyltransferase (UGT)] ailesinden UGT1A1 ile olmaktad r. Glukuronokonjugatlar enterositlerden lümene ekskrete edilir. Metabolitlerin apikal membrandan pasif olarak difüze olmas negatif yüklerinden dolay fizyolojik pH’da mümkün de ildir. Bu bile ikler MRP ailesinden [multidrug resistance associated protein family (MRP)] özellikle MRP2 ile d ar ya at l r. MRP2 yaln zca apikal membran üzerinde bulunmaktad r. MRP2 ak pompas hem trans-piseidin hem de trans -resveratrolün d ar ya ak ile ilgilidir. Hücrede do al form (piseid ya da resveratrol) glukuronidlerden daha fazlad r ( ekil 13) (41).
2.6.2.1.5. Diyetteki Resveratrolün Dokulara Transportu
Resveratrolün hidrofilik konjugatlar na dönü ümü kana geçi ini, vücutta da l m n ve at l m n kolayla t r r. Hayvan çal malar nda resveratrolün oral al nd ktan sonra aglikone ve konjuge formlar n n kanda saptand gösterilmektedir. Resveratrol oral yolla al nd ktan birkaç saat sonra dokulara da lmaktad r. Zamanla ikinci pik görülünceye kadar plazma konsantrasyonu azalmaktad r. :kinci pik safradan sal nd ktan sonra tekrar dola ma girmesinden kaynaklanmaktad r. Resveratrol ve metabolitleri karaci er ve safra kesesi taraf ndan kandan filtre edilerek safra ile barsaklara at l r. Daha sonra tekrar geri emilime u ramaktad r. Resveratrol oral yolla al nd ktan k sa süre sonra kolonda bulunur. Ancak dokulara da l m birkaç saati al r. :nsan karaci er hücresine resveratrolün al m ve metabolizmas in vitro modellerde çal lm t r. :nsan karaci er hücresine resveratrolün al m ba lang çta art gösterirken (dakikalar içinde) daha sonra stabil olmaktad r (saatler içinde). Resveratrolün dü ük konsantrasyonunda, hepatosit hücre içine al m nda, s cakl a hassas aktif ta y c lar arac l k ederken yüksek konsantrasyonda ise molekül doygunlu a ula mayacak ekilde fakat konsantrasyona ba l olarak hücrelere difüze olmaktad r (4). Hepatoblastoma hücrelerinde, resveratrolün pasif difüzyon ve olas l kla ta y c arac l mekanizma ile hücre içine al nd gösterilmi tir. Dü ük konsantrasyonda, total al m n yar s ndan fazlas ta y c arac l mekanizma ile olmaktad r. Fizyolojik ko ullarda bu mekanizma, özellikle albumin olmak üzere serum proteinlerine ba l olmas na ra men kan dola m nda bulunan resveratrolün hepatik hücrelere al m n sa lamaktad r. Ta y c arac l transportta iki hipotez ileri sürülmektedir. Birincisi: aktif ta y c n n organik anyon transport polipeptid olabilece i, di eri resveratrol-albumin kompleksine ba lanan albuminin ta y c proteinler ile resveratrolün hücre içine al nabilece idir. Resveratrol-albumin kompleksinin albumin membran reseptörü taraf ndan tutulaca ve daha sonra hücre membran nda serbest b rak laca varsay lmaktad r (Jekil 14) (42).
ekil 14. Resveratrolün plazmadan hücre içi hedeflere olas yollar
(A: Albumin, B: Resveratrol) (42)
Albuminin çok say da amfifilik molekülü ta d ve ba lad bilindi inden resveratrolün plazmada ta y c s olarak iyi bir adayd r. :nsan serum albumin ve s çan plazma albumin ile resveratrolün etkile iminin oldu u gösterilmi tir. Serbest ya asitlerinin albumin’e resveratrolün ba lanmas nda pozitif etkileri oldu u gösterilmi tir (42).
Resveratrolün hücre içi reseptörleri konusunda bilinenler çok azd r. Resveratrolün aril
hidrokarbon reseptörüne (AhR) ba lanan digoksinin yar mal antogonisti oldu u
gösterilmi tir. Resveratrol, AhR’nin nukleusa tranlokasyonunu sa lamaktad r. Genistein ve resveratrol gibi fitoöstrojenler, insan östrojenleri ile baz yap sal benzerlikler göstermekte ve östrojen reseptörüne ba lanabilmektedir böylece östrojene cevap veren düzenleyici genlerin transkripsiyonunu aktive etmektedir. Dietil stilbestrerole benzeyen yap s ndan dolay “fitoöstrojen” olarak da tan mlanan resveratrol estradiol ile kombine oldu unda “süperagonist” olarak fonksiyon görmektedir. Son yap lan çal malarda resveratrolün her iki izomerinin l ml konsantrasyonda (>10 _M) yaln zca süperöstrojen etkinli ine sahip oldu u; daha dü ük konsantrasyonlarda (<1 _M) antiöstrojenik etkilerinin bulundu u gösterilmi tir. Resveratrol meme kanseri hücrelerinde östrojen reseptör agonisti olarak rol oynamaktad r (42).
2.6.2.1.6. Diyetle Al3nan Resveratrolün At3l3m3
Hayvan modelinde resveratrolün böbreklerden at l m n n saatler içinde ba lad ve 12-24 saat sonra artt gösterilmi tir. Böbrekte ba l ca aglikon (do al) formda bulunurken, idrarda konjuge formu ço unluktad r. :nsanda at l m zaman resveratrolün plazmada bulunan konsantrasyonuna ba l olarak de i ebilmektedir. Ba lang ç ile at l m miktar aras nda korelasyon bulunmamaktad r. Çok küçük miktarda resveratrol h zla metabolize ve elimine olurken; belirli dozun üzerinde resveratrol dokularda al konulmakta ve birikmekte böylece hücre al m ve hücre içi sinyalleme için haz rda bulunmaktad r. Resveratrolün metabolizmas ve at l m ile ilgili birçok soru i areti bulunmaktad r. Resveratrolün konjuge formlar n n dokulara transportu ya da at l m için hedeflenmesi henüz aç klanmam t r. :n vitro
çal malarda resveratrolün yaln zca aglikon formu kullan ld ndan hepatositlerde resveratrolün konjuge formlar n n kan ak ndan hangi yola (emilim ya da at l m) hedeflenece i henüz bilinmemektedir (Jekil 15)(4).
2.6.2.1.7. Resveratrolün Sinyal leti Yollar3
ROS; NFLB, ve AP-1 gibi transkripsiyon faktörlerinin ve mitojen-aktive protein kinaz (MAPK) fosforilasyonu ve aktivasyonu ile enflamasyonu artt rmada önemli rol oynamaktad r. Kronik enflamasyon, kanser, kardivasküler, pulmoner ve nörolojik hastal klara neden olmaktad r. Resveratrol MAPK kaskad n harekete geçirebilir. MAPK’lar n yolun a a s na do ru hedefleri mitojenik proinflamatuar enzimler ve nükleer transkripsiyon faktörleridir. Resveratrol, farkl düzeylerde rol oynayabilir. Resveratrol protein kinaz C (PKC) fosforilasyonunu inhibe ederek yolun yukar s na do ru rol oynayabilir. Resveratrol MAPK kaskad n aktive eden di er kinazlar n fosfotidilinozitol-3-kinaz (PI3K) fosforilasyonunu ve protein kinaz B’nin (Akt/PKB) fosforilasyonunu inhibe edebilir. Bu olaylar ile resveratrol vasküler düz kas hücrelerinde p70 ribozomal protein S6 kinaz’ n (p70S6K) fosforilasyonunu
azalt r. Resveratrol ERK1/2/JNK/p38 kinaz’ n tirozin fosforilasyonunu ve vasküler hücrelerde nukleusa translokasyonunu inhibe ederek MAPK kaskad n a a ya do ru bask lar. Fosforilasyonun ve sitoplazmadan nukleusa translokasyonun inhibisyonu vazokonstrüksiyon, anjiyogenez, proliferasyon ve diferansiyasyon ile ilgili genlerin ifadelenmesini azaltmaktad r. MAPK’lar n (JNK, ERK1/2 ve p38 kinaz) programlanm hücre ölümünde, farkl la mada ve hücrenin normal proliferasyonunda önemli rolleri bulunmaktad r (43).
Resveratrolün in vitro MAPK sinyal yolunu inhibe etti i gösterilmi tir. Domuz koroner arterlerinde yap lan çal mada resveratrolün ERK1/2, p38 kinaz ve JNK fosforilasyonunu azaltarak MAPK aktivitesini inhibe etti i gösterilmi tir. Bir ba ka çal mada da resveratrolün hücre içi adezyon molekülü-1 (ICAM-1) ve vasküler adezyon molekül-1 (VCAM) gibi adezyon moleküllerini anlaml olarak azaltt gösterilmi tir. Resveratrolün trombosit agregasyonunun inhibe etmesi kardiyoprotektif etkisinde bir ba ka mekanizmas d r (43).
Okside LDL (oxLDL) ve ROS gibi uyaranlar, NF-LB yolunu aktive etme potansiyeline sahiptir. NFLB, sitoplazmada inhibitör LB (ILB) ile birlikte iken inaktif kompleks olarak bulunur. Uyarana yan t olarak olarak ILB kinaz kompleksinin katalitik alt birimi (IKK), ILB-’n n iki serin aminoasidini fosforiller. Bu fosforilasyon 26S proteozom taraf ndan ILB’nin ubikitine ba l y k m n tetikler. Aktive p50/p65 kompleksinin daha sonra nukleusa translokasyonu olur. p50/p65 kompleksi NFLB spesifik LB DNA motiflerine ba lan r ve siklooksijenaz, sitokin gibi hedef genlerin transkripsiyonunu düzenler. Resveratrol p65’in fosforilasyonunu ve transaktivasyonunu IKK, protein kinaz C (PKC) gibi kinazlar inhibe ederek bask lar (44). Jekil 16’da resveratrolün moleküler hedefleri gösterilmektedir.