T.C
FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BAZI YENİLEBİLİR BİTKİLERİN ANTİRADİKAL, ANTİBAKTERİYEL VE ANTİKANSER ÖZELLİKLERİ İLE İÇERDİKLERİ FİTOKİMYASAL
BİLEŞİKLERİN SAPTANMASI
YÜKSEK LİSANS TEZİ Fatma KESER
Anabilim Dalı: Kimya Programı: Biyokimya
Danışman: Prof. Dr. Mustafa KARATEPE
T.C
FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BAZI YENİLEBİLİR BİTKİLERİN ANTİRADİKAL, ANTİBAKTERİYEL VE ANTİKANSER ÖZELLİKLERİ İLE İÇERDİKLERİ FİTOKİMYASAL
BİLEŞİKLERİN SAPTANMASI
YÜKSEK LİSANS TEZİ Fatma KESER
(142117109)
Anabilim Dalı: Kimya Programı: Biyokimya
Danışman: Prof. Dr. Mustafa KARATEPE
Tezin Enstitüye Verildiği Tarih: 20 Aralık 2017 OCAK-2018
T.C.
FIRAT ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
BAZI YENİLEBİLİR BİTKİLERİN ANTİRADİKAL, ANTİBAKTERİYEL VE ANTİKANSER ÖZELLİKLERİ İLE İÇERDİKLERİ FİTOKİMYASAL
BİLEŞİKLERİN SAPTANMASI
YÜKSEK LİSANS TEZİ Fatma KESER
(142117109)
Tezin Enstitüye Verildiği Tarih : 20 Aralık 2017 Tezin Savunulduğu Tarih : 08 Ocak 2018
OCAK-2018 Tez Danışmanı : Prof. Dr. Mustafa KARATEPE
(Fırat Üni.)
Diğer Jüri Üyeleri : Prof. Dr. Sevda KIRBAĞ (Fırat Üni.) Yrd. Doç. Dr. Alpaslan KOÇAK (Bingöl Üni.)
ÖNSÖZ
TÜBİTAK tarafından desteklenen bu tezde (TÜBİTAK Proje No:115Z056) Elazığ ve çevresinde yetişen Celtis tournefortii (dağdağan), Malva neglecta (ebegümeci), Rheum
ribes (ışgın), Rumex acetosella (kuzukulağı) ve Portulaca oleracea (semizotu) bitkilerinin
su, etanol ve metanol ekstraktlarının antiradikal, antibakteriyel ve antikanser özellikleri ve içerdikleri fitokimyasal bileşikler saptanmıştır. Bu tezin yürütülmesinde, çalışmalarımı yönlendiren, bilgi ve tecrübelerini esirgemeyen danışmanım sayın Prof. Dr. Mustafa KARATEPE’ye, deneysel aşamaların gerçekleştirilmesinde katkıları olan Prof. Dr. Ökkeş YILMAZ, Prof. Dr. Sevda KIRBAĞ, Prof. Dr. Süleyman SANDAL, Doç. Dr. İsmail TÜRKOĞLU, Doç. Dr. Ömer KAYĞILI, Yard. Doç. Dr. Suat TEKİN ve Yard. Doç. Dr. Ersin DEMİR, ayrıca Kimya Bölüm Şefi Mehmet ORHAN ve Teknisyen Abdurrahman ÖKSÜZ’e teşekkürlerimi sunarım.
Yüksek Lisans çalışmama 115Z056 nolu proje ile mali destek sağlayan TÜBİTAK’a teşekkür ederim.
Desteklerini her zaman yanımda hissettiğim merhum babama, anneme, abime ve sevgili eşim Doç. Dr. Serhat KESER’e en içten duygularımla teşekkür ederim.
Fatma KESER ELAZIĞ – 2018
İÇİNDEKİLER Sayfa No ÖNSÖZ...I İÇİNDEKİLER……….…..II ÖZET………...V SUMMARY………VI ŞEKİLLER LİSTESİ………...…VII TABLOLAR LİSTESİ………...VIII SEMBOLLER LİSTESİ……….………...XI 1. GİRİŞ……….……1 1.1. Genel Bilgiler..………...5 1.2. Serbest Radikaller……...………6
1.2.1. Serbest Radikallerin Oluşumu..………...6
1.2.1.1. Kovalent Bağların Homolitik Kırılması……...6
1.2.1.2. Normal Bir Molekülün Elektron Kaybetmesi………….………...7
1.2.1.3. Normal Bir Moleküle Elektron Transferi...………...7
1.2.2. Hidroksil (OH·) Radikali………..………..….…….……7
1.3. Antioksidanlar………...8 1.3.1. Endojen Antioksidanlar…………...………...10 1.3.2. Eksojen Antioksidanlar.……….10 1.4. Kanser ……….………..11 1.4.1. Kanserin Sebepleri………..………...12 1.4.2. Kanser Tedavisi……...………...13
1.5. Çalışmada Kullanılan Bitkiler………...14
1.5.1. Celtis tournefortii Lam. (Dağdağan)...….………...………...14
1.5.2. Malva neglecta Wallr. (Ebegümeci)…………..……….………...15
1.5.3. Portulaca oleracea L. (Semizotu)……….…….………16
1.5.4. Rheum ribes L. (Işgın)….………...17
1.5.5. Rumex acetosella L. (Kuzukulağı).………...………...…….…….18
Sayfa No
2.1. Arazi Çalışmaları………..……….20
2.1.1. Toplanan Bitkilerin Adları, Mevkileri ve Tarihleri………..…..20
2.2. Ekstraksiyon İşlemleri.………...………...20
2.3. Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi…...………...………21
2.3.1. DPPH Radikali Giderme Aktivitesi………..……….……....21
2.3.2. ABTS Radikali Giderme Aktivitesi……….……….……….21
2.3.3. OH (Hidroksil) Radikali Giderme Aktivitesi……….…....22
2.4. Fitokimyasal İçeriklerin Belirlenmesi………..………….22
2.4.1. Toplam Fenolik Bileşik Miktarı Tayini………..………22
2.4.2. Toplam Flavonoit Miktarı Tayini……….……….….23
2.4.3. Toplam Proantosiyanidin Miktarı Tayini………..……….23
2.4.4. Flavonoit ve Fenolik Asit İçeriğinin Saptanması………...………23
2.4.5. Fitosterol ve Vitamin İçeriğinin Saptanması…….………...…..24
2.4.6. Yağ Asidi İçeriğinin Saptanması………...…..…….……..24
2.4.6.1. Bitki Örneklerinden Lipitlerin Ekstraksiyonu…...………..24
2.4.6.2. Yağ Asidi Metil Esterlerinin Hazırlanması…….………24
2.4.6.3. Yağ Asidi Metil Esterlerinin Gaz Kromatografik Analizi...………...25
2.5. Antimikrobiyal Aktivitenin Belirlenmesi...………...………25
2.6. Antikanser Aktivitenin Belirlenmesi ………26
2.6.1. Araştırmanın Yapıldığı Merkez……….……….26
2.6.2. Çalışmada Kullanılan Hücre Tipleri ve Hücrelerin Takipleri.………...26
2.6.3. Besiyerlerinin Seçimi ve Hücrelerin Beslenmesi..……….27
2.6.4. Hücrelerin Pasajlanması ve Ekimlerinin Yapılması...………27
2.6.5. Bitki Ekstraktlarının Kültür Ortamına Eklenmesi………..………..……..28
2.6.6. MTT Assay……..………...……28
2.7. Verilerin İstatistiksel Analizi...……….…….28
3. ARAŞTIRMA BULGULARI………30
3.1. Celtis tournefortii (Dağdağan) Bitkisine Ait Analiz Sonuçları……….30
3.1.1. C. tournefortii’nin Antiradikal Aktivite Sonuçları.………...30
3.1.2. C. tournefortii’nin Fitokimyasal İçerik Sonuçları……...30
Sayfa No
3.1.4. C. tournefortii’nin Antikanser Aktivite Sonuçları.………..……….…….33
3.2. Malva neglecta (Ebegümeci) Bitkisine Ait Analiz Sonuçları……...………35
3.2.1. M. neglecta’nın Antiradikal Aktivite Sonuçları………..………...35
3.2.2. M. neglecta’nın Fitokimyasal İçerik Sonuçları………..………....36
3.2.3. M. neglecta’nın Antibakteriyel Aktivite Sonuçları ………...38
3.2.4. M. neglecta’nın Antikanser Aktivite Sonuçları………..39
3.3. Portulaca oleracea (Semizotu) Bitkisine Ait Analiz Sonuçları.………...41
3.3.1. P. oleracea’nın Antiradikal Aktivite Sonuçları………...41
3.3.2. P. oleracea’nın Fitokimyasal İçerik Sonuçları…..………...42
3.3.3. P. oleracea’nın Antibakteriyel Aktivite Sonuçları………...44
3.3.4. P. oleracea’nın Antikanser Aktivite Sonuçları…..…………...………...……..45
3.4. Rumex acetosella (Kuzukulağı) Bitkisine Ait Analiz Sonuçları.……….……...47
3.4.1. R. acetosella’nın Antiradikal Aktivite Sonuçları..………...47
3.4.2. R. acetosella’nın Fitokimyasal İçerik Sonuçları………..………..………48
3.4.3. R. acetosella’nın Antibakteriyel Aktivite Sonuçları…….………...50
3.4.4. R. acetosella’nın Antikanser Aktivite Sonuçları……….………...51
3.5. Rheum ribes (Işgın) Bitkisine Ait Analiz Sonuçları...53
3.5.1. R. ribes’in Antiradikal Aktivite Sonuçları.……….………...53
3.5.2. R. ribes’in Fitokimyasal İçerik Sonuçları………...53
3.5.3. R. ribes’in Antibakteriyel Aktivite Sonuçları…..……...56
3.5.4. R. ribes’in Antikanser Aktivite Sonuçları..……...57
4. TARTIŞMA………....60 4.1. Antiradikal Aktivite………...………..……..60 4.2. Fitokimyasal İçerik………...………...64 4.3. Antimikrobiyal Aktivite………...………...72 4.4. Antikanser Aktivite………..………...74 5. SONUÇ VE ÖNERİLER………...77 6. KAYNAKLAR……….………...79 7. ÖZGEÇMİŞ.…………...………86
ÖZET
Bazı Yenilebilir Bitkilerin Antiradikal, Antibakteriyel ve Antikanser Özellikleri ile İçerdikleri Fitokimyasal Bileşiklerin Saptanması
Bitkilerde doğal yolla meydana gelen antioksidan bileşikler antibakteriyel, antikanser ve antiradikal özellikler gösterirler. Bu antioksidan bileşikler bitkilerin meyvelerinde, tohumlarında, çiçeklerinde, kabuklarında ve köklerinde bol miktarda bulunmaktadır. Yapılan çok sayıda araştırma meyve ve sebzelerin bol miktarda tüketilmesinin hastalıklara yakalanma oranını düşürüp, kalp-damar rahatsızlıklarında, kanser vakalarında ve ölüm oranlarında belirgin düzeyde azalmayı sağladığını göstermiştir. Bitkilerin sahip olduğu potansiyel antiradikal, antibakteriyel ve antikanser özelliklerin belirlenmesi ve bitkilerin içerdiği fitokimyasal bileşiklerin (fenolik asitler, flavonoitler, vitaminler, steroller, yağ asitleri, vs) belirlenmesi son yıllarda büyük bir ilerleme kaydetmeye başlamıştır. Ayrıca son zamanlarda antibiyotiklere dirençli bakterilerin ortaya çıkması ve sentetik antibiyotiklerin, kanser ve tümör tedavisinde kullanılan sentetik ilaçların sahip olduğu istenmeyen yan etkiler, doğal kaynaklı antibiyotikler ve ilaçların üretilmesine öncülük etmiştir.
Bu çalışmada Elazığ ve çevresinden toplanan Celtis tournefortii (dağdağan), Malva
neglecta (ebegümeci), Rheum ribes (ışgın), Rumex acetosella (kuzukulağı) ve Portulaca oleracea (semizotu) bitkilerinin su, etanol ve metanol ekstrelerinin antiradikal,
antibakteriyel ve antikanser özellikleri ve bu bitkilerin içerdiği fitokimyasal bileşikler saptandı. Ekstrelerin antiradikal özellikleri DPPH, ABTS ve OH radikali yok etme testleri ile incelenirken; antibakteriyel özellikleri ise Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus bakterileri ve Candida albicans
mayası gibi enfeksiyona neden olabilen farklı mikroorganizmalara karşı belirlendi. Bu bitkilerin antikanser özellikleri MCF-7 (insan meme kanseri), HCT-116 (insan kolon kanseri), PC-3 (insan prostat kanseri) ve A2780 (insan over kanseri) hücreleri üzerinde in vitro şartlar altında MTT testiyle saptandı. Ayrıca bu beş bitki türünün içerdiği vitaminler, steroller, flavonoitler, fenolik asitler ve yağ asitleri de tayin edildi.
Sonuçlara göre M. neglecta metanol ve C. tournefortii su ekstresinin OH radikali yok etmede; P. oleracea su ekstresinin ABTS radikali yok etmede; R. ribes ve R. acetosella su, etanol ve metanol ekstrelerinin OH, ABTS, DPPH radikali yok etmede standart antioksidan BHT’den daha yüksek aktivite gösterdikleri belirlendi. Ekstrelerin antibakteriyel aktiviteye sahip oldukları, özellikle bazı bakteri türlerini standart antibiyotikten daha etkili yok ettikleri gözlendi. Bu tezdeki bitkilerin MCF-7, HCT-116, PC-3 ve A2780 kanser hücreleri üzerinde artan doza bağlı olarak çok etkili antikanser aktivite gösterdikleri belirlendi (p<0.05).
Anahtar Kelimeler: C. tournefortii, M. neglecta, R. ribes, R. acetosella, P.
SUMMARY
The Establishing of Antiradical, Antibacterial and Anticancer Properties with Phytochemical Compounds of Some Edible Plants
The natural antioxidant compounds show the antibacterial, anticancer and antiradical properties. These antioxidant compounds are abundantly found in the vegetables, fruits, seeds, flowers, barks and roots. Many of the previous studies have been shown that the plenty of vegetables and fruits consumption reduce the risk of diseases, and this consumption causes an appreciable decrease in the cardiovascular diseases, cancer cases and death rates. Recently, the determination of the potential antiradical, antibacterial and anticancer properties of the plants, as well as the determination of the phytochemical compounds in the plants (phenolic acids, flavonoids, vitamins, sterols, fatty acids, etc.) have been began to record a great progress. In recent years, the emergence of antibiotic resistant bacteria and unwanted side effects in the synthetic drugs, which are used for the treatment of cancer and tumor, has pioneered to product antibiotics and drugs with the natural origin.
In this study, it was determined that the antiradical, antibacterial and anticancer properties of the water, ethanol and methanol extracts of Celtis tournefortii, Malva
neglecta, Rheum ribes, Rumex acetosella, Portulaca oleracea and the phytochemical
compounds contained in these plants. The antiradical properties of the extracts were investigated via DPPH, ABTS, OH radical scavenging activities, their antibacterial properties were determined against several microorganisms, which are caused infection, such as Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus
bacteria and Candida albicans yeast. Anticancer properties of these plants were deterimined by MTT assay on the MCF-7 (human breast cancer), HCT-116 (human colon cancer), PC-3 (human prostate cancer) ve A2780 (human ovarian cancer) cells under in vitro conditions. In addition, vitamins, sterols, flavonoids, phenolic acids and fatty acids contents were also assayed contain in these five plant species.
According to results, it was determined that M. neglecta methanol and C. tournefortii water extracts for scavenging of OH radical; P. oleracea water extract for scavenging of ABTS radical; R. ribes and R. acetosella water, ethanol, methanol extracts for scavenging of OH, ABTS, DPPH radicals showed higher activity than standard antioxidant BHT. It was observed extracts have antibacterial activity; in particular, they were more effective scavenged than standard antibiotic for some bacteria species. It was determined that plants in this thesis showed very potent anticancer activity increasing dose-dependently on MCF-7, HCT-116, PC-3, A2780 cancer cell lines (p<0.05).
Keywords: C. tournefortii, M. neglecta, R. ribes, R. acetosella, P. oleracea, antiradical, anticancer, antibacterial
ŞEKİLLER LİSTESİ
Sayfa No
Şekil 1.1. Antioksidan gruplar ve görevleri………...………9
Şekil 1.2. Celtis tournefortii bitkisinin yaprak ve meyvelerinin genel görünüşü ……...14
Şekil 1.3. Malva neglecta bitkisinin genel görünüşü……….………..15
Şekil 1.4. Portulaca oleracea bitkisinin genel görünüşü…..…………...………17
Şekil 1.5. Rheum ribes bitkisinin genel görünüşü…………...……….18
Şekil 1.6. Rumex acetosella bitkisinin genel görünüşü………...……….19
TABLOLAR LİSTESİ
Sayfa No
Tablo 1.1. Antioksidanların sınıflandırılması.……….………...11 Tablo 3.1. Celtis tournefortii ekstrelerinin ABTS, OH, DPPH radikali yok etme aktiviteleri...………...30 Tablo 3.2. Celtis tournefortii’nin total flavonoit, total proantosiyanidin ve total fenolik bileşik değerleri……….………31 Tablo 3.3. Celtis tournefortii’nin flavonoit ve fenolik asit içerikleri…..………31 Tablo 3.4. Celtis tournefortii’nin yağda çözünen vitaminler, fitosterol ve yağ asidi içerikleri………...………..32 Tablo 3.5. Celtis tournefortii ekstrelerinin antimikrobiyal aktiviteleri………...33 Tablo 3.6. Celtis tournefortii ekstrelerinin insan prostat kanseri (PC-3) üzerindeki
antikanser aktiviteleri……….……...34 Tablo 3.7. Celtis tournefortii ekstrelerinin insan over kanseri (A2780) üzerindeki
antikanser aktiviteleri…….………34 Tablo 3.8. Celtis tournefortii ekstrelerinin insan meme kanseri (MCF-7) üzerindeki
antikanser aktiviteleri………...…….35 Tablo 3.9. Celtis tournefortii ekstrelerinin insan kolon kanseri (HCT-116) üzerindeki
antikanser aktiviteleri……...……….35
Tablo 3.10. Malva neglecta ekstrelerinin ABTS, OH, DPPH radikali yok etme aktiviteleri ………...36
Tablo 3.11. Malva neglecta’nın total flavonoit, total proantosiyanidin ve total fenolik bileşik değerleri…...……...36 Tablo 3.12. Malva neglecta’nın flavonoit ve fenolik asit içerikleri…….……….………37 Tablo 3.13. Malva neglecta’nın yağda çözünen vitaminler, fitosterol ve yağ asidi
içerikleri……...………..38 Tablo 3.14. Malva neglecta ekstrelerinin antimikrobiyal aktiviteleri...……..………39
Sayfa No
Tablo 3.15. Malva neglecta ekstrelerinin insan prostat kanseri (PC-3) üzerindeki antikanser aktiviteleri………...………..………...39 Tablo 3.16. Malva neglecta ekstrelerinin insan over kanseri (A2780) üzerindeki antikanser
aktiviteleri………..…40 Tablo 3.17. Malva neglecta ekstrelerinin insan meme kanseri (MCF-7) üzerindeki antikanser aktiviteleri……...………..………...40 Tablo 3.18. Malva neglecta ekstrelerinin insan kolon kanseri (HCT-116) üzerindeki
antikanser aktiviteleri………...………..41 Tablo 3.19. Portulaca oleracea ekstrelerinin ABTS, OH, DPPH radikali yok etme
aktiviteleri...………..……….41 Tablo 3.20. Portulaca oleracea’nın total flavonoit, total proantosiyanidin ve total fenolik
bileşik değerleri……....………...42 Tablo 3.21. Portulaca oleracea’nın flavonoit ve fenolik asit içerikleri………..43 Tablo 3.22. Portulaca oleracea’nın yağda çözünen vitaminler, fitosterol ve yağ asidi içerikleri……..………...44 Tablo 3.23. Portulaca oleracea ekstrelerinin antimikrobiyal aktiviteleri………...45 Tablo 3.24. Portulaca oleracea ekstrelerinin insan prostat kanseri (PC-3) üzerindeki
antikanser aktiviteleri…...………...45 Tablo 3.25. Portulaca oleracea ekstrelerinin insan over kanseri (A2780) üzerindeki
antikanser aktiviteleri...46 Tablo 3.26. Portulaca oleracea ekstrelerinin insan meme kanseri (MCF-7) üzerindeki
antikanser aktiviteleri………...………...46 Tablo 3.27. Portulaca oleracea ekstrelerinin insan kolon kanseri (HCT-116) üzerindeki
antikanser aktiviteleri..………..………47 Tablo 3.28. Rumex acetosella ekstrelerinin ABTS, OH, DPPH radikali yok etme
aktiviteleri……...47 Tablo 3.29. Rumex acetosella’nın total flavonoit, total proantosiyanidin ve total fenolik bileşik değerleri……..………...48 Tablo 3.30. Rumex acetosella’nın flavonoit ve fenolik asit içerikleri..………...49
Sayfa No Tablo 3.31. Rumex acetosella’nın yağda çözünen vitaminler, fitosterol ve yağ asidi içerikleri………...………..50 Tablo 3.32. Rumex acetosella ekstrelerinin antimikrobiyal aktiviteleri..………....51 Tablo 3.33. Rumex acetosella ekstrelerinin insan prostat kanseri (PC-3) üzerindeki
antikanser aktiviteleri.……….………..51 Tablo 3.34. Rumex acetosella ekstrelerinin insan over kanseri (A2780) üzerindeki
antikanser aktiviteleri.……….……….………...52 Tablo 3.35. Rumex acetosella ekstrelerinin insan meme kanseri (MCF-7) üzerindeki
antikanser aktiviteleri.………..………...52 Tablo 3.36. Rumex acetosella ekstrelerinin insan kolon kanseri (HCT-116) üzerindeki
antikanser aktiviteleri…………...….………53 Tablo 3.37. Rheum ribes ekstrelerinin ABTS, OH, DPPH radikali yok etme
aktiviteleri………..53 Tablo 3.38. Rheum ribes’in total flavonoit, total proantosiyanidin ve total fenolik bileşik değerleri……..……….………..54 Tablo 3.39. Rheum ribes’in flavonoit ve fenolik asit içerikleri……….………..55 Tablo 3.40. Rheum ribes’in yağda çözünen vitaminler, fitosterol ve yağ asidi içerikleri...56 Tablo 3.41. Rheum ribes ekstrelerinin antimikrobiyal aktiviteleri………..57 Tablo 3.42. Rheum ribes ekstrelerinin insan prostat kanseri (PC-3) üzerindeki antikanser aktiviteleri……...………….………..57 Tablo 3.43. Rheum ribes ekstrelerinin insan over kanseri (A2780) üzerindeki antikanser aktiviteleri…...……….………..58 Tablo 3.44. Rheum ribes ekstrelerinin insan meme kanseri (MCF-7) üzerindeki antikanser aktiviteleri...……….………..58 Tablo 3.45. Rheum ribes ekstrelerinin insan kolon kanseri (HCT-116) üzerindeki antikanser aktiviteleri………..……..59
SEMBOLLER LİSTESİ
A0 : Kontrol absorbansı A1 : Numune absorbansı
ABTS : 2,2´-Azino-bis(3-etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit)
ABTS•+ : 2,2´-Azino-bis(3-etilbenzotiyazolin-6-sülfonik asit) radikali BHA : Bütillenmiş hidroksianisol
BHT : Bütillenmiş hidroksitoluen DPPH : 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil
DPPH• : 1,1-Difenil 2-pikril hidrazil radikali GSH : Redükte glutatyon
GSH-Px : Glutatyon peroksidaz enzimi GSSG : Okside glutatyon
H2O2 : Hidrojen peroksit LPO : Lipid peroksidasyon MDA : Malondialdehit O2•- : Süperoksit radikali OH• : Hidroksil radikali PBS : Fosfat tamponu
SOD : Süperoksit dismutaz enzimi
TBA : Tiyobarbitürik asit
1. GİRİŞ
Bilimsel gelişmelerin hızlı bir şekilde gerçekleşmesi sonucunda doğal antioksidanların yerini alan sentetik antioksidanların toksik etki gösterip kansere yol açtığı belirlenince, bunların kullanımlarına sınırlamalar ve yasaklamalar getirilmeye başlanmıştır. Bu durum doğal yollardan elde edilen antioksidanlara olan ilgiyi arttırmış ve özellikle bitkisel kökenli antioksidanlar bu çalışmaların odağını oluşturmaya başlamıştır. Ayrıca bitkilerden elde edilen ürünlerin yalnızca antioksidan olarak değil antibiyotik ve antikanser özelliklere de sahip oldukları belirlenmiştir. Doğal antioksidanların başlıca kaynağını bitkiler oluşturmaktadır. Meyve, sebze, baharat, bitkisel çay ve tohumlar birçok çalışmaya konu olmuş ve yukarıda belirtilen önemli etkilerin bu bitki kısımlarının içerdiği fenoller, flavonoitler, tokoferoller, karotenler, vitaminler, yağ asitleri, steroller vb bileşiklerden kaynaklandığı bu çalışmalarda gösterilmiştir.
Canlılarda meydana gelen fizyolojik ve metabolik olaylar enzimler, hormonlar, vitaminler ve iz elementler gibi farklı bileşenler tarafından yürütülen yükseltgenme ve indirgenme reaksiyonlarının birleşiminden oluşmaktadır. Organizmadaki redoks dengesinde oluşabilecek herhangi bir değişim hücrelerin ve dokuların fonksiyonlarının bozulmasına neden olur ve bu durum düzeltilmezse ölümle sonuçlanır (Gülçin, 2002). Canlı hücrelerde birçok koruma ve savunma mekanizmaları vardır. Bu mekanizmalar organizmayı oksijen metabolizmasının toksik etkilerine karşı koruma için gereklidir (Fridovich, 1975). Bu nedenle biyolojik sistemlerde antioksidan savunma mekanizmalarının araştırılması ve geliştirilmesi ile ilgili çalışmalar son günlerde büyük bir önem arz etmektedir. Son yıllarda en çok merak edilen ve araştırılan biyolojik süreçlerden biri olan yaşlanma da dahil olmak üzere birçok hastalığın oksidatif hasarlar nedeniyle oluştuğu kanıtlanmıştır.
Bilindiği gibi serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri canlı organizmada sürekli meydana gelmektedir. Serbest radikallerin insanlarda kanser, damar tıkanıklığı, sıtma, romatizma ve çeşitli nörodejeneratif hastalıkları da içeren birçok hastalığın patolojisiyle alakalı olduğu gösterilmiştir. Reaktif oksijen türleri fazla üretilince dokulara hasar verebilmektedir. Meydana gelen bu hasar sonucunda reaktif oksijen türleri kendiliğinden oluşabilmektedir. Biyomoleküllerde meydana gelen oksidatif hasar DNA, lipitler, karbohidratlar ve proteinlere zarar vererek çeşitli ürünler oluşturabilir. Örneğin DNA
oksidasyonu sonucunda 8-hidroksideoksiguanozin, lipitlerin oksidasyonu sonucunda izoprostanlar, proteinlerin oksidasyonu sonucunda ise yapıları değişen amino asitler meydana gelir (Gülçin vd., 2002). Reaktif oksijen türlerinin oluşumunu ve meydana getirdikleri hasarı önlemek amacıyla canlı organizmalarda birçok savunma mekanizması gelişmiştir. Bu savunma mekanizmasına antioksidan savunma sistemi, bu sistemin elemanlarına da antioksidanlar denmektedir. Antioksidanlar reaktif oksijen türleri gibi aşırı reaktif maddeleri ve bunların reaksiyonlarını dengede tutmak amacıyla sürekli bir aktivite göstermek zorundadırlar. Canlı organizmada bulunan antioksidanlar, oksijen metabolizması sırasında oluşan radikallerin yok edilmesini sağlarlar. Bu antioksidan bileşikler arasında A, C, E vitaminleri, selenyum, glutatyon, katalaz, glutatyon peroksidaz, süperoksit dismutaz vb enzim ve kimyasal bileşikler sayılabilir (Byung, 1994).
Bitkilerde bulunan A, C vitaminleri, tokoferoller, karotenler, flavonoitler ve polifenolik bileşikler gibi antioksidan maddeler birçok hastalığa karşı koruma sağlamaktadır (Abushita vd., 1997). Canlı organizmalar beslenme yoluyla α-tokoferol, β-karoten ve askorbik asit gibi antioksidanlar almaktadırlar ve bu bileşikler süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz ve katalaz gibi endojen antioksidan enzimlerle beraber oksidatif hasarları önlemekte ve organizmayı korumaktadırlar (Meyer vd., 1998; Nakagawa vd., 1999). Bütün bunlara ilaveten antioksidan bileşiklerin aynı zamanda antimikrobiyal, antibakteriyel, antiviral, antimutajenik, antialerjik, antikanserojen, antiülserojenik, antitümör, antimetastaz aktivite ve yüksek kan basıncını düşürme gibi fizyolojik aktivitelere sahip olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Miyake vd., 1999).
Bitkilerde yaprak, çiçek, meyve, gövde, kabuk, tohum vb kısımlarda doğal antioksidan bileşiklerin (karotenoidler, vitaminler, fenoller, flavonoitler, steroller, yağ asitleri, glutatyon vb) meydana geldiği ve bu doğal antioksidan bileşiklerin singlet ve triplet oksijen söndürücüsü, peroksit yok edicisi, enzim inhibitörleri olarak fonksiyonları oldukları belirlenmiştir (Larson, 1988; Ramarathnam vd., 1988; Pratt ve Hudson, 1990). Birçok epidemiyolojik çalışma bol miktarda sebze ve meyve tüketiminin bazı hastalıklara yakalanma riskini azalttığını, kalp-damar rahatsızlıkları, kanser vakaları ve ölüm oranlarında belirgin azalmalara neden olduğunu ve kalp-damar hastalıkları ve kanser hastalıklarına yakalanma riski ile sebze-meyve tüketimi arasında ters bir orantı olduğunu göstermiştir. Sebze ve meyvelerin bu özelliklerinin ihtiva ettikleri askorbik asit, tokoferoller, karotenoitler, vitaminler, flavonoitler, steroller, fenolik bileşikler gibi temel bileşik gruplarından kaynaklandığı ileri sürülmüştür. Çünkü bu tür bileşikler bitkilerde bol
miktarda bulunmaktadırlar. Bitki ve bitkisel ürünlerin doğal antioksidan, antiradikal, antimikrobiyal, antibakteriyel, antitümör ve antikanser özelliklerinin araştırılması ve bazı antioksidan bileşiklerin izolasyon ve karakterizasyon işlemleri son günlerde büyük bir ivme kazanmıştır. Özellikle halk arasında tıbbi amaçlarla kullanılan bitkiler bu tarz çalışmaların odağında yer almaktadır (Ames vd., 1993; Dragsted vd., 1993; Gülçin, 2002).
Bitkilerin enfeksiyon karşısında kimyasal savunma mekanizması olarak biyoaktif maddeler ürettiği ve bu maddelerin antibiyotik etki de gösterebildiği bilinmektedir. Bilim ve teknoloji bakımından gelişmemiş veya yeni gelişmekte olan ülkelerin büyük bir kısmında nüfusun yarıdan fazlasının halen bitkisel kaynaklardan elde edilen geleneksel ilaçları kullandıkları belirlenmiştir. Dünya Sağlık Örgütü veri ve tahminlerine göre dünyadaki nüfusun kırsal kesimde yaşayan yaklaşık %80’lik kısmı birincil sağlık bakımı için şifalı bitkilere başvurmaktadır. Son zamanlarda antibiyotik tedavi amacıyla bu aktiviteye sahip bitkilerin kullanımı artmaktadır. Bunlara ek olarak şifalı bitkiler dünyada büyük bir ekonomik gelir kaynağını da oluşturmaktadır. Günümüzde birçok bitkinin yaprak, çiçek, meyve, tohum vb. kısımlarının farklı çözücülerdeki ekstrelerinin Gram-pozitif ve Gram-negatif bakterilere karşı antibiyotik aktivitelerinin belirlenmeye çalışıldığı görülmektedir (Modi vd., 2012).
Sentetik antibakteriyel ilaçların gelişigüzel kullanımı antibiyotiklerin önemli bir kısmına dirençli bakterilerin ortaya çıkmasına neden olmuştur (Karaman vd., 2003). Buna ilaveten yüksek maliyet, istenmeyen yan etkiler ve sentetik antibiyotiklerden kaynaklanan aşırı hassasiyet, alerjik reaksiyonlar ve çeşitli bağışıklık sistemi hastalıkları sentetik antibiyotiklerin cazibesini ve kullanımını azaltmaya başlamıştır (Schinor vd., 2007). Bütün bu sebepler bilim adamlarını yeni antibiyotik maddelerin üretilmesi arayışına itmiştir. Bu sebeple biyoaktif potansiyeli yüksek, daha düşük yan etkilere sahip, maliyeti düşük, etkili bitkisel kaynaklı ilaçların keşfine acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Dolayısıyla bilim dünyasında gözler halk tıbbında kullanılan bitkilerin biyolojik olarak aktif olan özlerine ve bunlardan izole edilen bileşiklere çevrilmiştir (Essawi ve Srour, 2007). Bitki türevli antibiyotikler çok büyük tedavi edici potansiyele sahiptirler ve uzun yıllardan beri halk tıbbında sentetik antibiyotiklerin yan etkilerini azaltmak suretiyle çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadırlar (Iwu vd., 1999). Yine birçok enfeksiyonun bitkisel ilaçlarla tedavi edildiği bilinmektedir. Bitkilerden elde edilen doğal ürünler saf bileşikler veya bitki özleri kimyasal çeşitliliklerinin çok yüksek düzeyde olması nedeniyle yeni bir ilaç için sayısız fırsatlar sunabilirler. Bu sebeple bilim adamları mikrobik enfeksiyonlara karşı daha
etkili ilaçlar geliştirmek için yeni yollar aramakta ve halk tıbbına daha ilgili yaklaşmaktadırlar. Sonuç olarak yeterli antibiyotik etkiye sahip fitokimyasal maddelerin çeşitli enfeksiyonların tedavisinde kullanılabileceği öngörülmektedir (Modi vd., 2012).
Kanser modern dünyadaki ölümlerin %20’den fazlasını oluşturmakta ve dünya nüfusunun 1/3’inden fazlasını etkilemektedir. Kansere sebep olan etkenler arasında tütün kullanımı, viral enfeksiyonlar, radyasyon, çeşitli kimyasallar, çevre faktörleri ve beslenme alışkanlıkları sayılabilir (Lemkebthomas vd., 2008). Dünyanın birçok yerinde kanser tedavisinde cerrahi müdahale, kemoterapi ve radyoterapi gibi etkili ve önemli tedavi yöntemlerinin yanında geleneksel halk tıbbı gibi alternatif tedavi yöntemleri de kullanılmaktadır (Hilal vd., 2012). Bitkiler kanser tedavisinde kullanılan en eski ilaçlar arasında yer almaktadırlar ve ilk olarak 70’li yıllarda yapılan araştırmalarda lenfoma, akciğer ve testis kanseri tedavisinde etkili oldukları belirlenmiştir (Wen vd., 2011). Bu araştırmalarda bitkilerin vücut dengesini yeniden düzenledikleri ve dokularda kanser nedeniyle oluşan tahribata karşı hastanın direncini arttırdıkları saptanmıştır. Araştırma sonuçlarına göre tıbbi bitkilerin antikanser özelliklerinin yapılarındaki antioksidan ve fitokimyasal bileşiklerden kaynaklandığı belirlenmiştir. Ayrıca tıbbi bitkiler ucuz ve kolay ulaşılabilir olmalarının yanında modern ilaçlara göre hiçbir toksik etkiye sahip olmadıkları için kanser tedavisinde sıklıkla kullanılmaktadırlar (Prema vd., 2011). Bilim dünyası bitki orijinli doğal ürünlerin araştırılması, izolasyonu ve bunların antikanser aktivitlerinin belirlenmesi için yoğun çaba sarf etmektedir (Pandey ve Madhuri, 2009).
Bu tezde doğal kaynaklı ürünlerin etkilerinin araştırılması ve bu çalışmalara katkı sağlaması amacıyla gıda olarak halk arasında tüketilen Celtis tournefortii (dağdağan),
Malva neglecta (ebegümeci), Rheum ribes (ışgın), Rumex acetosella (kuzukulağı) ve Portulaca oleracea (semizotu) bitkilerinin su, etanol ve metanol ekstrelerinin antiradikal
özellikleri OH, ABTS ve DPPH radikalleri giderme testleriyle, fitokimyasal içerikleri ise toplam fenolik bileşik miktarı, toplam flavonoit miktarı, toplam proantosiyanidin miktarı, fenolik asitler, flavonoitler, vitaminler, steroller ve yağ asidi içerikleri saptanarak belirlendi. Bunlara ilaveten bu bitkilerin antimikrobiyal özellikleri Bacillus megaterium,
Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeroginosa, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus bakterileri ve Candida albicans mayası gibi enfeksiyon oluşturabilen mikroorganizmalar üzerindeki etkilerine
bakılarak, antikanser özellikleri ise PC-3 (insan prostat kanseri), MCF-7 (insan göğüs kanseri), HCT-116 (insan kolon kanseri) ve A-2780 (insan yumurta kanseri) hücreleri
üzerinde in vitro olarak belirlendi. Bu tezde yapılan testlerin sonuçlarının tıp, kimya, biyoloji, biyokimya, mikrobiyoloji, botanik, farmakoloji, onkoloji ve eczacılık gibi birçok bilimsel alandaki çalışmalara öncülük edeceğini ve bu alanlarda bitkisel kaynaklı doğal ürünlerin kullanımına çok büyük katkılar sağlayacağını ummaktayız.
1.1. Genel Bilgiler
Bitkiler hayatın devamlılığı için gerekli olan oksijen ve besini sağlayarak yaşamımızı sürdürmemizi sağlarlar. Antik çağlarda temelleri atılan şifalı bitkilerle tedavi günümüze kadar insanlar tarafından başvurulmuş ve sürekli olarak geliştirilmiştir. Günümüzde, sağlıksız beslenme, hareketsizlik, aşırı stres ve ekolojik dengenin bozulması vb. sebepler yüzünden hastalıklarda artış gözlenmektedir.
Teknolojik gelişmeler insanların yaşam kalitesini arttırmasına rağmen insan ömrüne etkisi aynı şekilde olmamıştır. Tıp alanına yansıyan teknolojik ilerlemenin, insan sağlığına ve ömrüne daha büyük yararlar getirmesi beklenirken yaşam kalitesinin mutlu ve sağlıklı geçtiği söylenemez. Son yıllarda teknolojik gelişmelerin etkisiyle alternatif tedavi denilebilecek yöntemlere hemen hemen her hastalığın tedavisinde başvurulmaya başlanmış ve önemli sonuçlar da elde edilmiştir. Her hastalığın çaresinin doğada bulunduğu ve insanoğlunun onu arayıp bulması gerektiği antik çağlardan beri kabul gören bir olgudur. Ancak hastalıkların tedavi edilmesi, hangi ilacın hangi hastalığın çaresi olduğunun bulunması, hangi ilacın hangi işlemlerden geçtikten sonra ne kadar ölçüyle uygulanması gerektiği, insanoğlunun binlerce yıldır çözmeye çalıştığı problemler arasında yer almaktadır. Bu nedenle insanoğlu binlerce yıldır hastalıkları tedavi etmesini sağlayacak ilaçları doğanın kaynaklarına başvurarak elde etmeye çalışmaktadır.
Türkiye’de tıbbi bitkilerin sayısı yaklaşık 650 kadar olup bunların hemen hemen hepsi doğal ortamda kendiliğinden yetişmektedir. Küçük bir kısmı kültüre alınmış bu bitkilerin üretilmesi ise çok kısıtlı bir alanda yapılmaktadır (Baytop, 1984). Tıbbi ve aromatik bitkilerin ilaç sanayi, meşrubat ve gıda üretimi, kozmetik ve parfüm endüstrisi gibi birçok alanda kullanılmaları onların tüketimlerinin hızlı bir şekilde artmasına neden olmuştur. Günümüzde ilaç sanayisinin geliştirdiği ilaçların dörtte birinin sahip olduğu ve asıl tedaviyi sağlayan etken maddeleri bitkisel kökenlidir. Sentetik ilaçların sahip oldukları istenmeyen etkiler yüzünden insanlar bitkisel kökenli ilaçlara yönelmeye başlamışlardır (Çöllü, 2007).
1.2. Serbest Radikaller
Serbest radikal, bir veya daha fazla ortaklanmamış elektrona sahip olan atom veya moleküllere denir. Boş olan orbitalini doldurup kararlı hale gelebilmek için başka elektronlara ihtiyaç duymaktadır ve bu nedenle ortaklanmamış elektronları serbest radikallerin aşırı reaktif hale gelmesine neden olur (Willcox vd, 2004). Radikaller canlılarda normal metabolik reaksiyonlar sırasında oluşabildikleri gibi bazı dış etkenler tarafından da oluşturulmaktadır. Serbest radikallerin yaşam süreleri kısa olmasına karşın sahip oldukları kararsızlık nedeniyle bütün hücre bileşenlerini etkileyebilirler. Oksijen metabolizmasına sahip memelerde serbest radikaller oksijen kökenlidirler (Uysal, 1998). Oksijen canlıların hayatlarını devam ettirebilmeleri için gerekli bir element olup, hücrede bazı reaksiyonlar sonucunda suya dönüşmektedir. Bunun sonucunda hücre kendisi için gerekli enerjiyi sağlamaktadır. Ancak bu reaksiyonlar dizisinde oksijenin yaklaşık %1-3’ü olarak suya dönüşemez ve süperoksit anyonu, hidroksil radikali gibi serbest radikallere dönüşür (Nakazawa vd., 1996).
Bütün olumsuz etkilerine rağmen serbest radikaller hücrelerin enerji üretiminde rol oynadıkları gibi vücudun normal metabolik reaksiyonları esnasında meydana gelen birçok faydalı biyokimyasal olayların da içinde yer alırlar. Örneğin oksidasyon neticesinde meydana gelen serbest radikaller vücutta antijenlerle mücadelede bağışıklık sistemine yardımcı olurlar. Fakat dış etmenlerin etkisiyle fazla miktarlarda oluşurlarsa hücre tahribatına sebep olabilirler (Nelson ve Cox, 2004). Oksijen kökenli serbest radikallerin hücrede aşırı miktarda meydana gelmeleri durumuna oksidatif stres denir ve bütün hücre komponentleri (yağlar, karbonhidratlar, proteinler, nükleik asitler) üzerinde hasar oluşturabilirler.
1.2.1. Serbest Radikallerin Oluşumu
1.2.1.1. Kovalent Bağların Homolitik Kırılması
Yüksek enerjiye sahip elektromanyetik dalgalar veya 500–600ºC gibi yüksek sıcaklıklar kimyasal bağların kırılmasına neden olur. Kırılma sırasında bağ yapısındaki iki elektronun her biri ayrı ayrı atomlar üzerinde kalıyorsa, bu tür kırılmaya homolitik kırılma denir.
X : Y X• +Y•
1.2.1.2. Normal Bir Molekülün Elektron Kaybetmesi
Radikal özelliği olmayan bir molekül elektron kaybederken dış orbitalinde paylaşılmamış elektron kalırsa radikal oluşur. Mesela glutatyon, tokoferoller ve askorbik asit gibi hücre içi antioksidanlar, radikallere tek elektron verip radikalleri indirgerler ve kendilerinin radikalleri meydana gelir.
X : Y X: + Y+
1.2.1.3. Normal Bir Moleküle Elektron Transferi
Radikal özelliği olmayan bir moleküle tek elektron transferi edilidiğinde dış orbitalinde paylaşılmamış elektron oluşursa bu çeşit bir indirgenme olayı radikal oluşumuna sebep olabilir. Mesela moleküler oksijenin tek elektron ile indirgendiğinde radikal formu olan süperoksit (O2•-) oluşur. Bu mekanizma yoluyla radikal oluşumu biyolojik sistemlerde sürekli meydana geldiğinden canlılar için çok önemlidir (Akkuş, 1995).
A+e- A
•-1.2.2. Hidroksil (OH•) Radikali
Hidroksil radikali serbest radikaller içinde en aktif radikal olarak kabul edilir. Bu sebeple canlı ortamda meydana gelen OH• radikali hemen hemen her moleküle saldırabilir ve oluştuğu yerde çok büyük hasarlara neden olabilir (Kawanashi vd., 2001; Imahori vd., 2008). OH• radikali iki farklı şekilde oluşabilir: Birincisi Fenton reaksiyonu adı verilen H2O2’nin geçiş metalleri varlığında indirgenmesi yoluyla, ikincisi ise Haber-Weiss
reakasiyonu adı verilen H2O2’nin O2•- ile tepkimesi sonucunda oluşabilir. İkinci reaksiyon
katalizörsüz çok yavaş ilerler fakat Fe+3
katalizörlüğünde çok hızlı gerçekleşir (Cheeseman ve Slater, 1993; Matsuzaki vd., 2009).
O2-•+ Fe+3 O2 + Fe+2
H2O2 + O2•- OH•+ OH-+ O2 (Haber-Weiss reaksiyonu)
Su yüksek enerjili iyonize edici radyasyona maruz kalırsa yine OH• radikali oluşabilir. Bir OH• radikali yüzlerce yağ asidini ve yan zincirini lipit hidroperokside dönüştürebilir. Meydana gelen hidroperoksitler birikerek membran yapısını bozar ve hücrenin parçalanmasına neden olurlar. Ayrıca bu şekilde oluşan hidroperoksitlerden MDA gibi reaktif ve toksik son ürünler de meydana gelebilir (Girotti, 1998; Uysal, 1998; Bolanos vd., 2009).
OH• radikali inorganik ve organik bileşiklerde elektron transfer raksiyonlarına sebep olmasına rağmen normalde oluşamaz. Bunun sebebi OH• oluşumu için moleküler oksijenin üç değerlikli olarak indirgenememesidir çünkü bu fazlasıyla zor gerçekleşen bir durumdur. OH• meydana gelebilmesi için O2•- ve H2O2 gereklidir ancak bu radikaller CAT, GSH-Px
veya SOD enzimleriyle ortamdan uzaklaştırılırlar (Smirnoff ve Palanca, 1995; Bolanos vd., 2009).
1.3. Antioksidanlar
Canlılarda bulunan DNA, karbohidrat, lipit ve protein gibi okside olabilecek biyomoleküllerin oksidasyonunu engelleyen veya geciktirebilen maddelere antioksidanlar denir (Çavdar vd., 1997). Antioksidan moleküllerce zengin sebze ve meyvelerin tüketilmesi insanları radikallerin meydana getirdiği doku ve hücre hasarlarına karşı ve dolaylı olarak bazı hastalıklardan korumaktadır (Rang vd., 2006). İşlenmiş gıdalarda bozulmayı önleyip raf ömrünü uzattığı için sentetik antioksidanlar katkı maddesi olarak kullanılırlar. Örneğin BHT (Bütillenmiş hidroksi toluen), PG (propil gallat), BHA (Bütillenmiş hidroksi anisol) ve TBHQ (t-bütilhidrokinon) en çok kullanılan sentetik antioksidan maddelerdir. Fakat sentetik antioksidanlar ve oluşumuna sebep oldukları yan ürünlerin bazı kanser türlerine sebep oldukları gözlenmiştir (Öztürk vd., 2007; Tepe vd., 2007). Bu sebeple doğal ürünlerden sentetik antioksidanların yerine kullanılabilecek doğal antioksidanların tespit edilmesi ve üretilmesi için yapılan araştırmalar önem kazanmış ve artmıştır. C vitamini (askorbik asit) ve E vitamini türevleri (tokoferoller) bu amaçlarla kullanılan en önemli ve yaygın doğal antioksidan maddelerdir. Fenolik bileşikler, amino asitler, karotenoitler, flavonoitler ve enzimatik antioksidanlar (süperoksit dismutaz, glukoz oksidaz, katalaz) diğer önemli doğal antioksidan maddelerdir (Riesche vd., 2002).
Canlılarda serbest radikaller oluştuğu zaman organizmayı oksidatif stresten korumak amacıyla antioksidan savunma sistemi devreye girer. Birinci savunma hattını serbest radikallerin oluşmasını engelleyen antioksidanlar oluşturur. İkinci savunma hattını vitamin E ve vitamin C gibi antioksidanların zincir oksidasyonunun başlamasını önlemesi ve zincirleme reaksiyonların yayılımını engellemesi oluşturur. Üçüncü savunma hattını ise hasarı onarma ve eski haline getirmeye çalışan onarıcı ve yeniden yapılandırıcı enzimler (proteazlar, lipazlar, transferazlar ve DNA onarıcı enzimler gibi antioksidanlar) oluştururlar (Şekil 1.1 ve Tablo 1.1) (Fridovich, 1975).
Şekil 1.1. Antioksidan gruplar ve görevleri
Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler:
1) Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutar veya daha zayıf yeni moleküle çevirir (toplayıcı etki). Antioksidan enzimler ve trakeobronşiyal mukus bu tip etki gösterirler.
2) Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltır veya inaktif şekle dönüştürür (bastırıcı etki). Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler.
3) Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engellerler (zincir kırıcı etki). Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler.
4) Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılmasını sağlarlar (onarıcı etki).
1.3.1. Endojen Antioksidanlar
Endojen antioksidanlar, enzim ve enzim olmayanlar olmak üzere iki sınıfa ayrılırlar. Enzim olan endojen antioksidanlar şunlardır: Süperoksit dismutaz (SOD), Glutatyon peroksidaz (GSH-Px), Glutatyon S-Transferazlar (GST), Katalaz (CAT), Mitokondriyal sitokrom oksidaz sistemi, Hidroperoksidaz.
Enzim olmayan endojen antioksidanlar şunlardır: Melatonin, Seruloplazmin, Transferrin, Miyoglobin, Hemoglobin, Ferritin, Bilirubin, Glutatyon, Sistein, Metiyonin, Ürat, Laktoferrin, Albümin.
1.3.2. Eksojen Antioksidanlar
İnsanlar için eksojen antioksidanlar, vitaminler, ilaçlar ve gıda antioksidanları olmak üzere sınıflandırılabilirler.
Vitamin eksojen antioksidanlar şunlardır: α-tokoferol (vitamin E), β-karoten, Askorbik asit (vitamin C), Folik asit (folat).
İlaç olarak kullanılan eksojen antioksidanlar şunlardır: Ksantin oksidaz inhibitörleri (allopürinol, oksipürinol, pterin aldehit, tungsten), NADPH oksidaz inhibitörleri (adenozin, lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, nonsteroid antiinflamatuvar ilaçlar, diphenyline iodonium), Rekombinant süperoksit dismutaz, Troloks (vitamin E analoğu), Endojen antioksidan aktiviteyi artıranlar (GSH-Px aktivitesini artıran ebselen ve asetilsistein), Nonenzimatik serbest radikal toplayıcılar (mannitol, albümin), Demir redoks döngüsü inhibitörleri (desferroksamin), Nötrofil adezyon inhibitörleri, Sitokinler (TNF ve IL-1), Barbitüratlar, Demir şelatörleri.
Gıdalardaki eksojen antioksidanlar şunlardır: Bütillenmiş hidroksitoluen (BHT), Bütillenmiş hidroksianisol (BHA), Sodyum benzoat, Etoksikuin, Propilgallat, Fe-süperoksit dismutaz.
Tablo 1.1. Antioksidanların sınıflandırılması ANTİOKSİDANLAR
Vücutta Bulunan Antioksidanlar Besin Kaynaklı Antioksidanlar
Enzimler Küçük Moleküller Sentetik Doğal
Katalaz Askorbik Asit BHA Tokoferoller
Peroksidaz Glutatyon BHT Karotenler
Süperoksit Dismutaz Ürik Asit TBHQ Fenoller Glutatyon Peroksidaz Metal Bağlayıcılar
(Hmg ve Myg gibi)
Propil Gallat Flavonlar
Glutatyon Redüktaz Kuersetin Kateşinler
1.4. Kanser
Kanser, hücrelerde meydana gelen DNA hasarı nedeniyle hücrelerin kontrolsüz ve/veya anormal olarak büyümesi ve çoğalmasıdır. İnsan vücudunda 24 saatte yaklaşık olarak 10.000 DNA mutasyonu meydana gelmesine rağmen bağışıklık sistemimiz her milisaniye vücudumuzu taramakta ve kanserli hücreleri yok etmektedir. Normal vücut hücreleri bölünebilme özelliğine sahip olup, ölen hücrelerin yenilenmesi ve hasar gören dokuların onarılması için bu özelliklerini kullanırlar. Ancak bu yetenekleri kısıtlıdır çünkü sınırsız bölünemezler. Her hücre yaşamı süresince belirli sayıda bölünebilmektedir. Sağlıklı hücre ne zaman, nerede bölünmesi gerektiğini bilmektedir. Aksine kanserli hücreler, bu bilinci kaybetmişlerdir ve kontrolsüz bir şekilde bölünüp çoğalmaktadırlar. Kanser hücreleri bir araya gelerek tümör oluştururlar ve bu tümörler normal dokuları sıkıştırıp, içine girip veya tahrip olmalarına neden olabilirler. Kanserli hücreler bulundukları tümörden ayrılıp, kan veya lenf dolaşımı ile vücudun diğer bölgelerine giderlerse, yeni gittikleri dokularda tümör kolonileri oluşmasına neden olur ve büyümeye devam ederler. Kanserin vücudun diğer bölgelerine yayılmasına metastaz denmektedir (Atıcı, 2007).
Kanserler, oluşmaya başladığı organ ile mikroskoptaki görünümlerine göre sınıflandırılabilirler. Farklı tip kanserler, farklı hızda büyür, farklı yayılma gösterir ve farklı tedavilere yanıt verirler. Bu yüzden kanser tedavisinde, mevcut kanser tipine göre farklı tedavi yöntemleri uygulanır, çünkü her kanser aynı yapıya sahip değildir.
Vücutta mutasyona maruz kalan hücrelerin ancak çok küçük bir kısmı kansere yol açmaktadır. Bu durumun nedenleri şöyle sıralanabilir:
1. Mutasyona uğrayan hücreler normal hücrelere göre daha az yaşama yeteneğine sahiptirler ve bu sebepten ölürler.
2. Mutasyona uğrayan hücrelerin birçoğunda aşırı büyümeyi önleyen tümör baskılayıcı genler bulunmaktadır. Bu nedenle canlı kalabilen mutant hücrelerin çok azı kanserli hücreye dönüşebilir.
3. Çoğunlukla kanser potansiyeli taşıyan hücreler büyüyüp kanser oluşturmadan önce vücudun bağışıklık sistemi tarafından yok edilirler. İmmün sistemin etkinliğini bozan olaylar kanser hazırlayıcı etmenler olarak kabul edilir (Sigerist, 1960).
1.4.1. Kanserin Sebepleri
Kanserin asıl sebebi hücre bölünmesi sırasında DNA replikasyonunun hatalı olması nedeniyle bölünen hücrenin farklılaşmasıdır. DNA replikasyonunda anomaliye neden olduğu kabul edilen birçok faktör vardır ve bunlara predispozan (hazırlayıcı) faktörler adı verilir. Hücre bölünmesi, dokuların tamiri ve/veya yenilenmesi amacıyla gerçekleşmektedir. Doku tamirini ve yenilenmesini hızlandıran bütün etmenler bir kanser hazırlayıcısı olabilir. Kansere neden olan olgular şu şekilde sıralanabilir:
1. X-ışınları, gama ışınları, radyoaktif maddelerden yayılan partikül radyasyonları ve UV ışınları gibi iyonize edici radyasyonlar kansere zemin hazırlamaktadır. Bu radyasyonların etkisiyle oluşan iyonlar yüksek derecede reaktif olmaları nedeniyle dokularda DNA zincirlerini koparır ve böylece mutasyona neden olurlar.
2. Bazı kimyasal maddelerin mutasyona neden olma ihtimaleleri çok yüksektir. Mutasyona sebep olan bu kimyasal maddelere kanserojen maddeler adı verilir.Anilin boya türevleri, silika tozları, asbest, metilmetakrilat, sigara dumanındaki çok sayıdaki kimyasal, kömür ve alçı tozu örnek olarak verilebilir. Modern çağda en fazla kanserojeni sigara dumanı ihtiva etmektedir. Fiziksel yönden tahriş edici maddeler de kansere sebep olabilirler. Dokularda oluşan tahribat hızlı bir mitoz faaliyetine neden olarak yeni hücrelerin oluşumunu hızlandırır. Mitoz ne kadar fazla ve hızlı olursa mutasyon riski de o kadar fazla olur. Bu tip fiziksel sebepler içinde (saçla oynama, dudak ısırma, ben (nevus) koparma), bazı tahriş edici gıdaların aşırı ve sık tüketimi, yara kabuklarıyla oynama sayılabilir.
3. Bazı ailelerde kalıtsal eğilim nedeniyle yüksek bir kansere yakalanma ihtimali vardır. Bu durum birçok kanser çeşidinde, kanser oluşumundan önce birden fazla mutasyona ihtiyaç duyulduğu gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Kanser yatkınlığı olan bu ailelerde kalıtsal genomda birden fazla mutasyona uğramış gen vardır. Bu nedenle bu kişilerde kanser gelişmeye başlamadan önce çok az sayıda ilave mutasyon kanseri başlatmak için yeterli olabilir.
4. Kanser sebepleri arasında viral faktörlerin etkisi de sayılmaktadır.
Cinsiyete göre en çok görülen kanser türleri; kadınlarda rahim, meme ve kalın bağırsak kanseri, erkeklerde ise prostat, mide, akciğer ve kalın bağırsak kanserleridir. Kanserin görüldüğü yerler aşağıdaki gibi yüzdeyle sıralanabilir: Cilt %10, beyin ve omurilik %1, genital bölgeler: kadınlarda %8, erkeklerde %20, sindirim sistemi %25, meme %14, solunum yolları: kadınlarda %3, erkeklerde %2, karaciğer ve safra kesesi %3, diğer organlar %8 (Atıcı, 2007).
1.4.2. Kanser Tedavisi
Bütün hastalıkların tedavisinde asıl rolü bağışıklık sistemi üstlenmektedir. Bağışıklık sistemini zayıflatan etkenlerin yok edilmesi tedavinin ilk basamağını oluşturmaktadır. Kanserli hücre ve/veya hücrelerin nereye ve ne oranda metastaz yaptığını tahmin etmek imkansız olduğu için kanser tedavisi gören hastanın bağışıklık sisteminin güçlendirilmesi ve yayılmış hücrelerin bağışıklık sistemi tarafından yok edilmesi asıl istenen durumdur.
Kanser tedavisi onkoloji uzmanları tarafından yapılmaktadır. Kanser tedavisi 5 farklı yolla yapılmaktadır:
1. Cerrahi müdahale: Kanserli dokuyu ve çevresindeki risk taşıyan sağlıklı dokuyu çıkartıp almak. Bazı vakalarda kanserli dokuyu çıkarıp almak olanaksız olabilir. Bu tip durumlarda hastaya radyoterapi veya kemoterapi uygulanır.
2. Radyoterapi (ışın) tedavisi: Uygun dozda ışın uygulanmasıyla kanserli hücrelerinin yok edilmesi.
3. Kemoterapi: Kanserli hücreleri yok etmek için uygun ilaçlar kullanılması.
4. Alternatif tıp: Bağışıklık sistemini güçlendirmeyi ve asıl tedaviye destek olmayı amaçlayan, ancak güvenilirliği ve etkinliği kontrollü deneylerle doğrulanmaya ihtiyaç duyan ön-tıbbi yöntemler.
5. İmmünoterapi: Bağışıklık sistemi hücrelerinin kansere karşı etkili olarak kullanılmasıdır (Sigerist, 1960; Atıcı, 2007).
1.5. Çalışmada Kullanılan Bitkiler
1.5.1. Celtis tournefortii Lam. (Dağdağan)
Şekil 1.2’de gösterilen, Ulmaceae (Karaağaçgiller)’e ait olan Celtis tournefortii ülkemizde çitlembik, dardağan, dağdağan gibi yerel isimlerle tanınmaktadır. Genellikle Mart-Nisan ayları arasında çiçek açan bu tür sık çalılık veya ağaçlık bölgelerde, kayalık bayırlarda veya nadiren ormanlarda kendiliğinden yetişmektedir (Davis, 1988). Bazı Celtis türlerinin sara krizinde, ayak terlemelerinde, yara iyileştirmede kullanıldıkları belirtilmiştir. Tohumları böbrek kumlarına karşı, yaprakları mide ağrısında, kan durdurmada, yatıştırıcı ve hazım kolaylaştırıcı olarak kullanılmaktadır. Meyvelerinin ise ishalin, dizanterinin ve ülserin tedavisinde tüketildiği bilinmektedir (Öztürk, 2008).
1.5.2. Malva neglecta Wallr. (Ebegümeci)
Şekil 1.3’de gösterilen, Malvaceae familyasında yer alan Malva neglecta (ebegümeci) ülkemizde her türlü toprakta, yol, tarla, orman, su kenarı gibi yerlerde güneş alan bölgelerde yetişen çok yıllık otsu bir bitkidir (Davis, 1988). İçeriğinde B ve C vitaminleri, demir, bakır, kalsiyum, fosfor, malik asit, sitrik asit, okzalik asit, tartarik asit, karbohidratlar bulunmaktadır. Protein bakımından zengin olan genç sürgün ve yaprakları sebze olarak tüketilmektedir (Güder, 2008). M. neglecta Doğu Anadolu’da alternatif tıpta en çok kullanılan bitkiler arasında yer almaktadır. Bu bitkinin üriner problemlerin tedavisinde, astım, ülser, soğuk algınlığı, karın ağrıları, sindirim problemleri, diyare, mide ağrısı ve boğaz ağrısında kullanıldığı belirtilmiştir (Türker ve Dalar, 2013). M. neglecta bitkisinin antioksidan özellikleri ve fenolik içerikleri (Mavi vd., 2004; Dalar vd., 2012; Güder ve Korkmaz, 2012; Türker ve Dalar, 2013), antiülserojenik aktiviteleri (Gürbüz vd., 2005) ve antibakteriyel özellikleri (Seyyednejad vd., 2010) belirlenmiştir.
1.5.3. Portulaca oleracea L. (Semizotu)
Şekil 1.4’de gösterilen, Portulaca oleracea (semizotu), Portulaceae (Semizotugiller)’ye ait olan tek yıllık otsu bir bitkidir ve ülkemizde sebze olarak tüketilmektedir (Davis, 1988). Ancak fazla üretimi yapılmayan bu bitki sulak yerlerde, dere kenarlarında, çayırlarda kendiliğinden yetişmektedir. Yenebilir bir sebze olmasının yanında geleneksel tıpta da ilaç olarak kullanımı mevcuttur. Örneğin kanlı dizanteri, yılan ve böcek sokması, astım, ülser, ishal ve basur tedavisinden kullanılan bu bitkinin antiseptik, antispazmodik, idrar söktürücü ve kurt düşürücü özellikleri de vardır (Kaşar, 2009). Taze semizotunun yüksek miktarda E, C ve A vitaminleri, karotenoid türevleri, omega 3 yağ asitleri, glutatyon, glutamik asit, aspartat, flavonoitler ve fenolik bileşikler içerdiği belirlenmiştir (Akdeniz, 2007). P. oleracea ile ilgili çalışmalar incelendiğinde bu bitkinin çeşitli kısımlarının antiradikal aktiviteleri (Peksel vd., 2006; Lim ve Quah, 2007; Ercisli vd., 2008; Cho vd., 2008; Oliveira vd., 2009; Siriamornpun ve Suttajit, 2010; Boga vd., 2011; Dkhil vd., 2011; Erkan, 2012; Uddin vd., 2012; Alam vd., 2014; Li vd., 2014; Silva ve Carvalho, 2014), ratlarda mide kanserine karşı koruyucu etkileri (Li vd., 2014), besin olarak faydaları (Uddin vd., 2014), fenolik bileşiklerinin DNA hasarına karşı koruyucu etkileri (Silva ve Carvalho, 2014), antibakteriyel aktiviteleri (Cho vd., 2008; Ercisli vd., 2008), bazı fitokimyasal bileşikleri (Oliveira vd., 2009; Siriamornpun ve Suttajit, 2010; Erkan, 2012; Alam vd., 2014), nefrotoksisiteye karşı koruyucu etkileri (Karimi vd., 2010), metanol ekstresinin antikanser aktivitesi (Tan vd., 2013) ve bazı polisakkaritlerinin antitümör aktivitelerinin (Zhao vd., 2013) belirlendiği gözlenmiştir.
Şekil 1.4. Portulaca oleracea bitkisinin genel görünüşü
1.5.4. Rheum ribes L. (Işgın)
Şekil 1.5’de gösterilen, Rheum ribes (ışgın) Polygonaceae’ye ait olan bir tür olup, içerdiği antrasen türevleri nedeniyle Ortadoğu’da en önemli ilaç hammaddelerinden biri olarak kullanılmaktadır. Bu bitki çoğunlukla İran, Lübnan ve Türkiye’nin doğusunda kendiliğinden yetişmektedir (Davis, 1988). Ülkemizde yetişen tek Rheum türü olan R. ribes L. (ışgın)’ın genç sürgünleri ve sapı hemoroid, kızamık, çiçek gibi hastalıkların yanı sıra mide rahatsızlıkları ve ishale karşı kullanılmaktadır. Taze kökler ve sürgünler ülkemizde sebze ve meze olarak tüketilmektedir. Diyabet, ülser, hipertansiyon, obezite ve sindirim sorunlarına karşı tüketildiği kaynaklarda yer almaktadır (Uyar, 2011). R. ribes bitkisinin
antioksidan aktivitesi (Oktay vd., 2007; Öztürk vd., 2007; Tanrikut vd., 2013), antibakteriyel aktivitesi (Alaadin vd., 2007), besin olarak özellikleri (Özcan vd., 2007) ve antihiperglisemik özellikleri (Kasabri vd., 2011) saptanmıştır.
Şekil 1.5. Rheum ribes bitkisinin genel görünüşü
1.5.5. Rumex acetosella L. (Kuzukulağı)
Şekil 1.6’da gösterilen, Rumex acetosella (kuzukulağı), Polygonaceae familyasında yer almaktadır. Bu familyanın ülkemizde 67 türü bulunmaktadır ve bu türlerin 25 tanesi
Rumex cinsine aittir (Davis, 1988). R. acetosella Mayıs-Eylül ayları arasında çiçek açan
çok yıllık otsu bitki olup halk arasında sebze olarak tüketilmelerinin yanında müshil etkisi nedeniyle kabızlıkta kullanılmaktadır. Ayrıca idrar söktürücü ve ateş düşürücü etkilere sahip olduğu, yapraklarının ve köklerinin iltihaplarda ve kanı temizlede, yanıkların tedavisinde de kullanıldığı belirtilmektedir (Kuruüzüm, 1996; Kuruüzüm, 1999; Kahraman, 2009). R. acetosella ile ilgili literatürler incelendiğinde bu bitkinin antiradikal özellikleri (Alpinar vd., 2009; Özen, 2010; Pereira vd., 2011; Ahmed vd., 2013; Isbilir ve Sagiroglu, 2013) ve antimikrobiyal özelliklerinin (Wegiera vd., 2011) belirlendiği gözlenmiştir.
2. MATERYAL ve METOD
2.1. Arazi Çalışmaları
04/05/2015–27/10/2015 tarihleri arasında Elazığ ili Sivrice, Keban ilçeleri ve çevrelerinden Celtis tournefortii (dağdağan), Malva neglecta (ebegümeci), Rheum ribes (ışgın), Rumex acetosella (kuzukulağı) ve Portulaca oleracea (semizotu) bitkileri toplanmıştır. Toplanan bitkilerin detayları aşağıda belirtilmiştir.
2.1.1. Toplanan Bitkilerin Adları, Mevkileri ve Tarihleri
1. Rheum ribes (Işgın) 04.05.2015 Elazığ-Sivrice arası, Sivrice, Karaçalı Köyü çevresi, Dağlık Alanlar. 1400 m.
2. Rumex acetosella (Kuzukulağı) 25.05.2015 Elazığ-Sivrice arası, Gözeli Ovası, Şirinyazı çevresi, Tarla kenarı. 1550 m.
3. Portulaca oleracea (Semizotu) 13.07.2015 Elazığ-Sivrice arası, Kamışlık Dağı, Tarlatepe Köyü çevresi, Dere kenarı. 1430 m.
4. Malva neglecta (Ebegümeci) 15.07.2015 Elazığ-Sivrice arası, Kuşakçı Dağı, Kürk Köyü, Eskibağlar mevkii, Dere kenarı. 1480 m.
5. Celtis tournefortii (Dağdağan) 27.10.2015 Elazığ-Keban arası, Altınkürek Köyü çevresi. 1450 m.
Toplanan bitkiler laboratuar ortamında, oda sıcaklığında ve gölgede kurutuldu. Kurutulan bitkiler toplandıkları bölgeye ve türlerine göre tasnif edilerek ekstraksiyon işlemlerine kadar saklandı. Ekstraksiyon işlemine geçilmeden önce toplanan bitkilerin kısımları blenderde öğütülerek ekstraksiyona hazır hale getirildi.
2.2. Ekstraksiyon İşlemleri
Ekstraksiyon işlemi için öğütülen ve toz haline getirilen bitki numuneleri 1 litrelik ağzı kapaklı erlenlerde numunenin yaklaşık 20 katı çözücü ile manyetik karıştırıcıda karıştırıldı. Bitki kalıntısı ekstrelerin içinde bulunduğu çözelti renksizleşinceye kadar
çözücüsü değiştirilerek karıştırıldı. Elde edilen ekstreler süzgeç kağıdıyla süzüldü. Süzülmüş ekstreler birleştirilerek çözücüleri uzaklaştırıldı. Daha sonra bu ekstreler çalışılacağı zaman µg/mL konsantrasyonunda kendi çözücüsünde çözünerek analize uygun hale getirildi.
2.3. Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi
Antioksidan kapasite belirleme testleri Shimadzu marka UV-1700 Spectrophotometer model UV sprektrofotometresinde gerçekleştirildi.
2.3.1. DPPH Radikali Giderme Aktivitesi
Serbest radikal giderme, Shimada vd. (1992) metoduna göre bazı modifikasyonlarla yapıldı. Serbest radikal olarak DPPH• kullanıldı ve 1 mM’lık çözeltisi hazırlandı. Deney tüplerine 500 µg/mL ekstre aktarılıp toplam hacim 3 mL olacak şekilde saf etanol ile tamamlandı. Daha sonra numune tüpüne stok DPPH• çözeltisinden 1 mL ilave edildi. 30 dk oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edildi. İnkübasyondan sonra etanoldan oluşan köre karşı 517 nm de absorbansları ölçüldü. Kontrol olarak, 3 mL etanol ve 1 mL DPPH• çözeltisi kullanıldı. Azalan absorbans, geriye kalan DPPH• radikal giderme aktivitesini vermektedir:
%DPPH• Yok Etme Aktivitesi = [(A0-A1)/A0] x 100
A0 = Kontrolün absorbans değeri
A1 = Ekstre ilave edildikten sonraki absorbans değeri
2.3.2. ABTS•+ Radikali Giderme Aktivitesi
Bu metotta, 2.45 mM K2S2O8 ve 7 mM ABTS çözeltileri 1:1 oranında karıştırılarak
oda sıcaklığında ve karanlıkta 16 saat inkübasyona bırakıldı. Hazırlanan bu ABTS radikal çözeltisinin 734 nm’de absorbansı alınarak 1.660±0.02 absorbansına ulaşılana kadar etil alkolle seyreltildi. Bu absorbans kontrol absorbansı olarak kullanıldı. Daha sonra bu radikal çözeltisinden deney tüplerine 4 mL bırakıldı ve bu tüplerin üzerine 500 µg/mL bitki ekstresinden eklenerek oda sıcaklığında ve karanlıkta 2 saat inkübasyona bırakıldı. Bu sürenin sonunda örneklerin absorbansı 734 nm’de PBS (Fosfat Tamponu, pH=7.4)’den
oluşan köre karşı kaydedildi. Azalan absorbans ortamdan yok edilen ABTS radikallerinin miktarını vermektedir (Yu vd., 2002). Ekstrelerin ortamdaki ABTS radikallerinin ne kadarını yok ettiği şu formülle hesaplandı:
%ABTS Yok Etme Aktivitesi = [(A0-A1)/A0] x 100
A0 = Kontrolün absorbans değeri
A1 = Ekstre ilave edildikten sonraki absorbans değeri
2.3.3. OH (Hidroksil) Radikali Giderme Aktivitesi
Bu metotta, ekstrelerin hidroksil radikali (OH•) yok etme aktiviteleri Halliwell vd. (1987) metoduna göre gerçekleştirildi. Reaksiyon karışımı 500 μL bitki ekstresi, 500 μL 3.6 mM deoksiriboz, 200 μL 100 μM FeCl3, 200 μL 104 mM EDTA, 100 μL 1 mM H2O2
ve 100 μL 1 mM askorbik asit çözeltisinden oluşturuldu ve vortekste iyice karıştırıldı. 37 °C’deki etüvde 1 saat bekletilen tüplerin üzerine 1 mL %2.8 TCA ve 1 mL %1.0 TBA eklendikten sonra sıcak su banyosunda 50 °C’de 30 dk bekletilen örnekler bütanol fazına alınarak 532 nm dalga boyunda UV’de absorbansları kaydedildi. Ekstrelerin ortamdaki OH radikallerinin ne kadarını yok ettiği şu formülle hesaplandı:
% OH Yok Etme Aktivitesi = [(A0-A1)/A0] x 100
A0 = Kontrolün absorbans değeri
A1 = Ekstre ilave edildikten sonraki absorbans değeri
2.4. Fitokimyasal İçeriklerin Belirlenmesi
2.4.1. Toplam Fenolik Bileşik Miktarı Tayini
Ekstrelerin toplam fenolik bileşik miktarları Slinkard ve Singleton (1977) metoduna göre yapıldı. Standart olarak gallik asit kullanıldı. 1 mL bitki ekstresi deney tüpüne alınarak üzerine 0.5 mL Folin–Ciocalteu reaktifi eklendi ve 3 dk sonra 3 mL %2’lik Na2CO3 çözeltisi eklenen örnekler sürekli karıştırılarak 2 saat bekletildi. Bu sürenin
sonunda 760 nm dalga boyunda numunelerin absorbansları kaydedildi. Kaydedilen absorbanslar daha önceden hazırlanan gallik asit standart grafiğinden elde edilen denklemde yerine konularak, her bir bitki ekstresinin ihtiva ettiği toplam fenolik bileşik miktarı gallik asit eşdeğeri (mg gallik asit/ g ekstre) olarak hesaplandı.
2.4.2. Toplam Flavonoit Miktarı Tayini
Bitkilerin total flavonoit içerikleri Kim vd. (2003) metoduna göre catechin eşdeğeri olarak belirlendi. Bu metotta 0.5 mL bitki ekstresi saf suyla 4 mL’ye tamamlandı. Sonra örneklerin üzerine 0.3 mL %5’lik NaNO2 çözeltisinden ve 0.3 mL %10’luk AlCl3
çözeltisinden ilave edilip oda sıcaklığında 5 dk bekletildi. Bu sürenin sonunda karışıma 2 mL 1 M NaOH eklenip vortekste iyice karıştırıldı. Reaksiyon sonunda oluşan pembe renkli örneklerin absorbansı 510 nm’de U.V.’de kaydedildi. Ekstrelerin ihtiva ettiği total flavonoit miktarı önceden hazırlanmış catechin standart grafiği üzerinden elde edilen denklemde yerine konarak µg catechin / g ekstre olarak hesaplandı.
2.4.3. Toplam Proantosiyanidin Miktarı Tayini
Ekstrelerin proantosiyanidin içeriği Amaeze vd. (2011) metoduna göre gerçekleştirildi. Bunun için 0.5 mL ekstre üzerine 1.5 mL %4’lük vanilin-metanol çözeltisi ve 0.75 mL derişik HCl çözeltisi eklendi. Reaksiyon karışımı iyice karıştırılıp oda sıcaklığında 15 dk bekletildi. Bu sürenin sonunda 500 nm dalga boyunda numunelerin absorbansları kaydedildi. Kaydedilen absorbanslar daha önceden hazırlanan catechin standart grafiğinden elde edilen denklemde yerine konularak, her bir bitki ekstresinin ihtiva ettiği toplam proantosiyanidin miktarı catechin eşdeğeri (mg catechin / g ekstre) olarak hesaplandı.
2.4.4. Flavonoit ve Fenolik Asit İçeriğinin Saptanması
Bitkilerin metanol fazında homojenizasyonuyla elde edilen ekstrelerinin ihtiva ettiği flavonoit ve fenolik asitlerin analizi HPLC cihazı ile ters faz kolon kullanılarak gerçekleştirildi. Bu analizde mobil faz olarak %1 asetik asit içeren metanol/su/asetonitril (46/46/8) karışımı kullanıldı (Zu vd., 2006). Bu faz 0.45 µm çapında membran filtresiyle filtre edildi ve kullanmadan önce ultrasonik olarak deaerate edildi. Akış oranı ve enjeksiyon hacmi sırasıyla 1.05 mL/dk ve 10 µL belirlendi. Bütün kromatografik analizler 25 °C’de gerçekleştirildi. Kromatografik piklerin analizi alıkonma süreleri ve UV spektrumlarının referans standartlarla karşılaştırılmasıyla gerçekleştirildi.
