Zoledronik asid ve Tamoksifen Kombinasyonunun MCF-7 Meme Kanseri Hücre Serisi Üzerine Etkis

Zoledronik asidin 10 µM/L ile Tamoksifenin 10 nM/L konsantrasyonunun kombine verildiği hücre grubunda hücre sayısında 48. saatte % 19, 72. saatte % 33 azalma gözlendi. Zoledronik asidin 10 µM/L konsantrasyonu ile tamoksifenin 100 nM/L konsantrasyonunun kombine verildiği hücre grubunda hücre sayısında 48. saatte % 16, 72. saatte ise % 30 oranında azalma gözlendi.

Zoledronik asidin 100 µM/L ile tamoksifenin 10 nM/L konsantrasyonunun kombine verildiği hücre grubunda hücre sayısında 48. saatte % 19, 72. saatte % 54 azalma gözlendi. Zoledronik asidin 100 µM/L konsantrasyonu ile tamoksifenin 100 nM/L konsantrasyonunun kombine verildiği hücre grubunda hücre sayısında 48. saatte % 28, 72. saatte ise % 63 oranında azalma gözlendi.

Tamoksifen ve zoledronik asidin farklı kombinasyonlarının MCF-7 hücre serileri üzerine olan etkileri Şekil 5’ de grafik olarak gösterilmektedir.

0 20 40 60 80 100 120 140 Zol 1+T mx1 0 Zol 10+ Tm x 10 Zol 100+ Tm x 10 Zol 1+T mx1 00 Zol 10+T mx 100 Zol 100+ Tm x100 C a n lı H ü cr e S a y ıs ı (% ) 24. saat 48. saat 72. saat

Şekil 5. Tamoksifen ve Zoledronik Asidin Farklı Dozlardaki Kombinasyonlarının MCF-7 Hücre Serileri Üzerine Olan Etkileri

(canlı hücre/toplam hücre x 100)

Zol 1=Zoledronik asid 1 µM/L Zol 10=Zoledronik asid 10 µM/L Zol 100=Zoledronik asid 100 µM/L Tmx 10=Tamoksifen 10 nM/L Tmx 100=Tamoksifen 10 nM/L

45

Tamoksifenin tek başına uygulandığı hücre grubu kontrol grubu ile kıyaslandığında ilk 72 saatte hücre sayılarındaki artışı engellerken hücre sayısı üzerine azaltıcı yönde bir etkisi gözlenmedi. Ancak tamoksifenle zoledronik asidin kombine verildiği hücre gruplarında zoledronik asidin tek başına kullanıldığı hücre gruplarına kıyasla daha fazla etki saptandı. Bu etki özellikle 72. saatte 100 nM/L tamoksifen ve 100 µM/L zoledronik asid kombinasyonunda % 63 oranı ile en belirgindi (x²=27.4, p=0.0000007).

Zoledronik asidin 1 µM/L ile tamoksifenin 10 ve 100 nM/L konsantrasyonlarının kombine edildiği gruplarda MCF-7 hücre serilerine azaltıcı yönde bir etki gözlenmedi.

Zoledronik asid ve tamoksifen ajanlarının farklı konsantrasyon ve kombinasyonlarının MCF-7 hücre serileri üzerine olan etkinlikleri 48. ve 72. saatlerde yüzde olarak hesaplandı. Bulunan değerler Pearson Ki Kare analizi ile değerlendirilerek zoledronik asid ve tamoksifen kombinasyonlarının en etkin doz ve zamanı hesaplandı. Elde edilen Person Ki Kare (x²) ve p değerleri Tablo 8 de gösterildi.

Tablo: 8. Zoledronik Asid ve Tamoksifenin Farklı Konsantrasyonlarının ve Kombinasyonlarının MCF-7 Hücre Serileri Üzerine Olan Etkilerinin Pearson Ki Kare Analizi ile Değerlendirilmesi

Hücre Sayısını Azaltma Oranı %

48. saat 72. saat x² p Zol 10 13 25 4.68 0.03 Zol 100 16 52 28.88 0.0000001 Zol10 + Tmx 10 19 33 5.9 0.02 Zol 100 + Tmx 10 19 54 26.43 0.0000003 Zol 10 + Tmx 100 16 36 10.40 0.0012 Zol 100 + Tmx 100 28 63 27.4 0.0000007

Zol 1=Zoledronik asid 1 µM/L Zol 10=Zoledronik asid 10 µM/L Zol 100=Zoledronik asid 100 µM/L Tmx 10=Tamoksifen 10 nM/L Tmx 100=Tamoksifen 10 nM/L

Pearson Ki Kare Analizi uygulanılarak yapılan istatistiksel analize göre zoledronik asidin 10 ve 100 µM/L konsantrasyonlarının tek başına ve tamoksifenin 10 ile 100 nM/L konsantrasyonlarının kombine edildiği gruplardaki hücre sayıları üzerine olan azaltıcı etkinlikleri istatistiksel olarak anlamlı bulundu.

46

Zoledronik asid 10 µM/L konsantrasyonun 48. ve 72. saatlerdeki etkinlikleri kıyaslandığında 72. saatteki etkisi istatistiksel olarak daha anlamlı bulundu (x²=4.68, p=0.03).

Zoledronik asid 100 µM/L konsantrasyonun 48. ve 72. saatlerdeki etkinlikleri kıyaslandığında 72. saatteki etkisi istatistiksel olarak daha anlamlı bulundu (x²=28.88, p=0.0000001).

Zoledronik asid 10 µM/L konsantrasyonun ile tamoksifenin 10 nM/L dozunun kombine edildiği grubun 48. ve 72. saatleri kıyaslandığında 72. saatteki etkisi istatistiksel olarak daha anlamlı bulundu (x²=5.9, p=0.02).

Zoledronik asid 100 µM/L konsantrasyonun ile tamoksifenin 10 nM/L dozunun kombine edildiği grubun 48. ve 72. saatleri kıyaslandığında 72. saatteki etkisi istatistiksel olarak daha anlamlı bulundu (x²=26.43, p=0.0000003).

Zoledronik asid 10 µM/L konsantrasyonun ile tamoksifenin 100 nM/L dozunun kombine edildiği grubun 48. ve 72. saatleri kıyaslandığında 72. saatteki etkisi istatistiksel olarak daha anlamlı bulundu (x²=10.40, p=0.0012).

Zoledronik asid 100 µM/L konsantrasyonun ile tamoksifenin 100 nM/L dozunun kombine edildiği grubun 48. ve 72. saatleri kıyaslandığında 72. saatteki etkisi istatistiksel olarak daha anlamlı bulundu (x²=27.4, p=0.0000007).

Zoledronik asidin çözdürülmesinde kullandığımız DMF ile tamoksifenin çözdürülmesinde kullandığımız etanol ile oluşturulan gruplar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında DMF ve etanolün MCF-7 hücre serilerinde hücre sayıları üzerine bir etkisi gözlenmedi.

47

6. TARTIŞMA

Zoledronik asidin doz ve zaman bağımlı olarak meme kanser hücre serilerinde invitro olarak hücre sayılarını azalttığı ispatlanmıştır. Hughes ve arkadaşları (140) zoledronik asidin osteoklastik aktiviteyi inhibe ederek osteoklast sayısında anlamlı bir azalmaya neden olduğunu göstermişlerdir. Zoledronik asid ve incadronate gibi nitrogen içerikli bifosfonatlar ile bu etkinin sadece osteoklastlarla sınırlı olmadığı invitro olarak insan multiple myeloma hücre serilerinde gösterildi (142, 143).

Pamidronat, incadronat ve zoledronik asid gibi bifosfonatlarla yapılmış çalışmalarla bifosfonatların makrofaj (154), osteoklast (140, 155) ve myeloma hücrelerinde (142, 143) apopitozise neden olduğu gösterildi.

Thomas ve arkadaşları (24) MCF 7 hücre serilerinde antiprogestin bir ajan olan RU-486 ve tamoksifen kombinasyonunun ilk 3 günde sinerjistik etkili olduğunu gösterdi.

Zoledronik asidin antitümör etkinliğini nasıl gösterdiği tam olarak aydınlatılmamış olmakla birlikte mevolanat sentez yolundaki anahtar enzim olan, farnezil pirofosfatı inhibe edip Ras, Rap1, Rho ve Rab gibi G proteinlerin prenilasyonunu önleyerek bu etkiyi sağladığı düşünülmektedir (140, 141).

Jagdev ve arkadaşlarının (20) MCF-7 meme kanseri hücre serilerinde, zoledronik asid ve paklitaksel kombinasyonunun meme kanseri hücrelerinde sinerjistik etki yaptığını gösterdikleri çalışmada deney ortamına 100 µM mevalonat yada 50 µM fermasol ilavesi ile zoledronik asidin apopitotik etkisinin önlenmesi bu düşünceyi desteklemektedir.

Zoledronik asid ve paklitaksel kombinasyonunun doz ve zaman bağımlı olarak MCF-7 hücre serilerinde hücre sayısını azalttığı gösterildi. 0.1-1 µM/L zoledronik asidin uygulamasının MCF 7 hücre sayıları üzerine anlamlı bir etkisinin olmadığı 10 ve 100 µM/L zoledronik asid konsantrasyonlarının MCF 7 hücre sayısında belirgin bir azalmaya neden olduğu ve kontrol grubu ile kıyaslandığında 100 µM/L zoledronik asidin meme kanseri hücrelerini 72. saatte % 63.5, 96. saatte % 87.1 azaltmakta olduğu gösterildi (20).

Çalışmamızda da Jagdev ve arkadaşlarının çalışmasına benzer şekilde 1 µM/L zoledronik asid konsantrasyonu uygulanan hücre serisinde 24, 48 ve 72. saatte

48

hücre sayısı üzerine etkisini gözlemlemedik. 100 µM/L zoledronik asid uygulanan hücre serisinde kontrol grubuna göre hücre sayısında 48. saatte % 16, 72. saatte % 52 azalma gözlemledik.

Fluorescence insitu nick translation metodu kullanarak zoledronik asidin MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre serilerinde apopitozisi uyardığı gösterilmiştir. 0.1-1 µM zoledronik asidin MCF 7 hücrelerinde apopitozise etkisi az iken 10 µM zoledronik asid 4 kat, 100 µM zoledronik asid 10 kat daha fazla apopitozise neden olmaktadır (20). MDA-MB-231 meme kanseri hücre serilerinde ise 0.1-10 µM konsantrasyondaki zoledronik asidin apopitozis üzerine etkisinin az olduğu 100 µM konsantarasyondaki zoledronik asidin ise 15 kat daha fazla apopitozise neden olduğu gösterilmiştir (20).

MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre serilerinde Fluorescence insitu nick translation metodu kullanılarak yaptıkları analize göre zoledronik asid ve paklitaksel kombinasyonu tek başına kullanılmalarına kıyasla 2 kat daha fazla apopitozise neden olmuştur. 2 µM/L paklitaksel ve 10 µM/L zoledronik asid kombinasyonu zoledronik asidin tek başına kullanımı ile kıyaslandığında 5 kat, paklitakselin tek başına kullanımı ile kıyaslandığında 4 kat daha fazla apopitozise neden olmuştur. Jagdev ve arkadaşlarına göre bu etki zoledronik asid ile paklitaksel arasındaki sinergistik etki sonucu ortaya çıkmaktadır (20).

Çalışmamızda MCF-7 meme kanseri hücre serilerinde zoledronik asid ve tamoksifen kombinasyonunun nasıl bir etkisinin olacağı çalışıldı. İlk 72 saatte tamoksifen MCF-7 meme kanseri hücrelerinde çoğalmayı engellerken tek başına tamoksifen verilen hücre serileri kontrol grupları ile kıyaslandığında hücre sayılarını azaltıcı yönde anlamlı bir etki gözlenmedi. Ancak 10 µM/L zoledronik asid 10 nM/L tamoksifenle kombine edildiğinde zoledronik asidin aynı konsantrasyonunun tek başına kullanımı ile kıyaslandığında hücre sayısını 48. saatte % 6, 72. saatte % 8 oranında daha fazla azalttığı, 10 µM/L zoledronik asid 100 nM/L tamoksifenle kombine edildiğinde zoledronik asidin aynı konsantrasyonunun tek başına kullanımı ile kıyaslandığında hücre sayısını 48. saatte % 6, 72. saatte % 29 oranında daha fazla azalttığı gözlendi. 100 µM/L zoledronik asid 100 nM/L tamoksifenle kombine edildiğinde zoledronik asidin aynı konsantrasyonunun tek başına kullanımı ile kıyaslandığında hücre sayısını 48. saatte % 12, 72. saatte % 11 oranında daha fazla

49

azalttığı gözlendi. Bu sinerjistik etki özellikle 100 µM/L zoledronik asidin, 100 nM/L tamoksifenle konsantrasyonu ile kombine edilerek uygulanan hücre grubunda ve 72. saatte hücre sayısı üzerine olan % 63 azaltıcı etki ile en belirgin olarak saptandı (x²=27.4, p=0.0000007).

Thomas ve arkadaşları (24) MCF-7 hücre serilerinde antiprogestin bir ajan olan RU-486 ve tamoksifen kombinasyonunun ilk 3 günde sinerjistik etkili olduğunu, 3. günden sonra ise tamoksifenin tek başına kullanılmasına kıyasla tamoksifen, RU- 486 kombinasyonun bir üstünlüğü olmadığını göstermişlerdir.

Çalışmamızda da aynı şekilde ilk 3 gün içerisinde 10 ve 100 µM/L zoledronik asid ile 10, 100 nM/L tamoksifen kombinasyonunun tek başına zoledronik asid ve tek başına tamoksifen uygulaması ile karşılaştırıldığında MCF-7 hücre sayılarını azaltıcı etki bakımından kombine edilen gruplarda hücre sayıları üzerine olan azaltıcı etki daha fazla idi.

Yaptığımız çalışmada 10 ve 100 µM/L zoledronik asid konsantrasyonunun MCF-7 meme kanseri hücrelerini en fazla 72. saatde azalttığı tespit edildi. Bununla birlikte bifosfonatlar mineralize kemiğe daha yüksek bir affinite göstermekte ve hızla kemiğe lokalize olmakta böylelikle klinik uygulamada primer meme kanseri hücreleri veya onun visseral metastazlarındaki kanser hücreleri çok kısa bir periyotta bu bileşiklere maruz kalmaktadırlar. Zoledronik asidin serum tepe konsantrasyonu birkaç saat boyunca 1-3 µM seviyelerinde bulunmuştur (156). Sato ve arkadaşlarının (157) alendronate ile kemik metastazı olan ratlar üzerinde yaptıkları çalışmaya göre bifosfonatlar kemiğe daha yüksek affinite göstermekte ve akut etkileri osteoklastlar üzerinde gözlenmektedir. Bununla birlikte invivo olarak 2-6 ve 12 saat süre bifosfonat tedavisi osteoklast haricindeki hücrelerde de bifosfonatların etkisini daha doğru yansıtabilir. Çalışmamıza göre 100 M zoledronik asid ile MCF-7 hücrelerinin tedavisi bu 12 saatlik periyotta hücre sayıları üzerine anlamlı bir azaltıcı etkiye sahip değildi. Jagdev ve arkadaşları (20) MCF-7 ve MDA-MB-231 meme kanseri hücre serilerinde Fluorescence insitu nick translation metodu kullanarak zoledronik asidin erken dönemde meme kanseri hücreleri üzerine olan etkilerini saptamaya çalışmışlar ve ilk 12 saatte çok az apopitozise neden olduğunu göstermişlerdir. Caxon ve arkadaşlarının (158) nitrojen içerikli bifosfonatların makrofajlarda zaman bağımlı

50

olarak apopitozise neden olduğunu gösterdikleri çalışmada da erken dönemde zoledronik asidin hücre morfolojisi üzerine etkisi çok az bulunmuştur.

Klinik olarak bifosfonatlar endokrin yada kemoterapötik ajanlarla kombine olarak kullanılmaktadır (159). Yoneda T ve arkadaşları (160) meme kanserli fare modellerinde bifosfonatların kemoterapötik ajanların antitümör etkinliğini arttırdıklarını gösterdiler. Çalışmamızda zoledronik asid MCF-7 hücre sayılarını doz ve zaman bağımlı olarak azaltmakta, 100 µM/L zoledronik asid ile 100 nM/L tamoksifen konsantrasyonları kombine edildiğinde 72. saatte hücre sayılarını % 63 oranında azaltmaktadır (p=0.0000007).

Zoledronik asidin meme kanseri hücreleri üzerine sitotoksik etkisi açıktır. Bu etkinin kalsiyumla şelat oluşturmasının sonucu olmadığı Jagdev ve arkadaşlarının (20) yaptığı çalışmada gösterilmiştir. Jagdev ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada ilginç olarak MCF-7 ve MDA MB-231 hücre serileri üzerinde farklı seviyelerde zoledronik asid duyarlılığı saptanmıştır. Bunun kesin nedeni belli değildir. MCF-7 hücre serileri agresif tip p53 ekspresyonu yaparken MDA MB-231 hücre serileri ılımlı bir p53 ekspresyonu yapmaktadır (161). Bu farklılık apopitozise olan direnci açıklayabilir. Alternatif olarak MDA MB-231 hücre serileri bazı sitokinler veya lokal growth faktörler salgılayarak zoledronik asid tarafından oluşturulan apopitozise karşı direnç geliştirebilirler (162).

Jagdev ve arkadaşları (20) zoledronik asidin MCF-7 hücre serilerinde apopitozise yol açmalarına ilave olarak mevolanat sentez yolunuda inhibe ettiklerini göstermişlerdir. Bu inhibisyon Lukman ve arkadaşları (140, 141) tarafından osteoklast hücrelerinde, Shipman ve arkadaşları (142, 143, 155) tarafından insan myeloma hücrelerinde, Rogers ve arkadaşları (154) tarafından makrofaj hücrelerindede gösterilmiştir. Zoledronik asid ile tedavi edilen meme kanser hücrelerine geranilgeraniol ilavesi ile apopitozisin önlendiği farnesol ilavesi ile hücre ölümünün kısmen önlendiği gösterilmiştir (20). Bifosfonatlar bu yolla osteoklastların yapısını bozabilir ve apopitozise neden olabilir (155). Tersi olarak Roger ve arkadaşları (154) makrofajlarda bifosfonatların neden olduğu apopitozisin farnesol ve geranilgeraniol ilavesi ile düzelmediğini göstermişlerdir. Bu çalışmalar arasındaki farklı sonuçların nedeni bilinmemektedir.

51

Sonuç olarak, zoledronik asid ve tamoksifenin farklı doz ve kombinasyonlarının MCF-7 hücre serileri üzerine olan etkinliklerini mevcut laboratuar imkanlarımız ölçüsünde direkt MCF-7 hücre sayıları üzerindeki azaltıcı etkiyi saptayarak gösterdik. Bu yöntem invitro ilaç etkinliğini saptamada en geçerli yöntemlerden birisidir. Ancak direkt sitotoksik etkinliklerinin yanı sıra hücreyi ölüme götüren apopitozis gibi hücre morfolojileri üzerine olan etkilerinde saptandığı (20, 158) benzer çalışmalardaki gibi kullandığımız ajanların MCF-7 meme kanseri hücre morfolojileri üzerine olan etkilerinide saptayabilmiş olsaydık muhtemelen elde ettiğimiz etkinlik daha yüksek bulunacaktı. Bununla birlikte kullanmış olduğumuz mevcut teknikle zoledronik asidin MCF-7 meme kanseri hücre serilerinde doz ve zaman bağımlı olarak hücre sayısını azalttığını ve tamoksifen ile kombine edildiğinde bu etkinin doz ve zaman bağımlı olarak arttığını gözlemledik.

52

7. KAYNAKLAR

1. Liotta LA, Steeg PS, Stetler-Stevenson WG. Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation. Cell 1991:64:327-336.

2. Garcia M, Jemal A, Ward EM, Center MM, Hao Y, Siegel RL, Thun MJ. Global Cancer Facts & Figures 2007. Atlanta, GA: American Cancer Society 2007:2-12

3. 3. Baring CC, Squires TS, Tong T. Cancer statistics, 1993. CA Cancer J Clin 1993;43:7- 26.

4. Murphy B, Muss H. Hormonal therapy of breast cancer: state of the art. Oncology 1997;11:7-13.

5. Chang M, Liu H, Jordan VC. Hormone and Growth Factor Receptors. In: Donegan WL, Priatt J.S. (eds). Cancer of the Breast, 5th ed. Philadelphia: PA Saunders 2002:417-441.

6. Jaiyesimi IA,Buzdar AU, Decker DA.Hortobagyi GN. Use of tamoksifen for breast cancer: twenty-eight years later. J Clin Oncol 1995;13:513-529.

7. Tonetti DA, Jordan VC. Possible mechanisms in the emergence of tamoxifen-resistant breast cancer. Anticancer Drugs 1995;6:498-507.

8. Sedlacek SM, Horowitz KB. The role of progestins and progesterone receptors in the treatment of breast cancer. Steroids 1984;44:467-484.

9. Goldhirsch A, Gelber RD. Endocrine therapies of breast cancer. Semin Oncol 1996;23:494-505.

10. Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group. Tamoksifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials. Lancet 1998;351:1451-1467.

11. Coleman RE. Skeletal complications of malignancy. Cancer 1997;80:1588-1594.

12. Fleisch H. Bisphosphonates: mechanisms of action. Endocr Rev 1998;19:80-100.

13. Hatoum HT, Lin SJ, Smith MR, Barghout V, Lipton A. Zoledronic acid and skeletal complications in patients with solid tumors and bone metastases: analysis of a national medical claims database. Cancer 2008;113:1438-1445.

14. Li EC, Davis LE. Zoledronic acid: a new parenteral bisphosphonate. Clin Ther 2003;25:2669-2708.

15. Shipman CM, Rogers MJ, Apperley JF, Graham R, Russell G, Croucher PI. Anti-tumour activity of bisphosphonates in human myeloma cells. Leuk Lymphoma 1998;32:129- 138.

16. Miyoshi Y, Taguchi T, Tamaki Y, Noguchi S. Current status of endocrine therapy for breast cancer. Breast Cancer 2003;10:105-111.

17. Budman DR, Calabro A. Zoledronic asid (Zometa) enhances the cytotoxic effect of gemcitabine and fluvastatin: in vitro isobologram studies with conventional and nonconventional cytotoxic agents. Oncology 2006;70:147-153.

53

18. Ottewell PD, Mönkkönen H, Jones M, Lefley DV, Coleman RE, Holen I. Antitumor effects of doxorubicin followed by zoledronic acid in a mouse model of breast cancer. J Natl Cancer Inst 2008;100:1167-1178.

19. Daubiné F, Le Gall C, Gasser J, Green J, Clézardin P. Antitumor effects of clinical dosing regimens of bisphosphonates in experimental breast cancer bone metastasis. J Natl Cancer Inst 2007;99:322-330.

20. Jagdev SP, Coleman RE, Shipman CM, Rostami-H A, Croucher PI. The bisphosphonate, zoledronic acid, induces apoptosis of breast cancer cells: evidence for synergy with paclitaxel. Br J Cancer 2001;84:1126-1134.

21. Sutherland RL, Green MD, Hall RE, Reddel RR, Taylor IW. Tamoxifen induces accumulation of MCF 7 human mammary carcinoma cells in the G0/G1 phase of the cell cycle. Eur J Cancer Clin Oncol 1983;19:615-621.

22. Sutherland RL, Hall RE, Taylor IW. Cell proliferation kinetics of MCF-7 human mammary carcinoma cells in culture and effects of tamoxifen on exponentially growing and plateau-phase cells. Cancer Res 1983;43:3998-4006.

23. Reddel RR, Murphy LC, Hall RE, Sutherland RL. Differential sensitivity of human breast cancer cell lines to the growth-inhibitory effects of tamoxifen. Cancer Res 1985;45:1525-1531.

24. Thomas M, Monet JD. Combined effects of RU486 and tamoxifen on the growth and cell cycle phases of the MCF-7 cell line. J Clin Endocrinol Metab 1992;75:865-870.

25. Jemal A, Siegel R.,Ward E. Hao Y, Xu J, Murray T, et al. Cancer Statistics 2008 CA Cancer J Clin 2008;58:71-96.

26. Kanserle Savaş Politikası ve Kanser Verileri. T.C. Sağlık Bakanlığı Kanser Savaş Dairesi Başkanlığı Bakanlık Yayınları Ankara 2002;618:145.

27. Harris JR, Lippman ME, Veronesi U, Willett W. Breast cancer. N Engl J Med. 1992;327:319-328.

28. Garber JE, Offit K. Hereditary cancer predisposition syndromes. J Clin Oncol 2005;23:276-292.

29. Bilimoria MM, Morrow M. The woman at increased risk for breast cancer: evaluation and management strategies. CA Cancer J Clin 1995;45:263-278.

30. Garber JE, Offit K. Hereditary cancer predisposition syndromes. J Clin Oncol 2005;23:276-292.

31. Martin AM, Weber BL. Genetic and hormonal risk factors in breast cancer. J Natl Cancer Inst 2000;92:1126-1135.

32. Oldenburg RA, Kroeze-Jansema K, Kraan J, Morreau H, Klijn JG, Hoogerbrugge N, et al. The CHEK2*1100delC variant acts as a breast cancer risk modifier in non- BRCA1/BRCA2 multiple-case families. Cancer Res 2003;63:8153-8157.

54

33. Fung YK, T'Ang A. The role of the retinoblastoma gene in breast cancer development. Cancer Treat Res 1992;61:59-68.

34. Klijn JG, Berns PM, Schmitz PI, Foekens JA. The clinical significance of epidermal growth factor receptor (EGF-R) in human breast cancer: a review on 5232 patients. Endocr Rev 1992;13:3-17.

35. Sainsbury JR, Nicholson S, Angus B, Farndon JR, Malcolm AJ, Harris AL. Epidermal growth factor receptor status of histological sub-types of breast cancer. Br J Cancer 1988;58:458-460.

36. Perren TJ. c-erbB-2 oncogene as a prognostic marker in breast cancer. Br J Cancer 1991;63:328-332.

37. Kurebayashi J. Biological and clinical significance of HER2 overexpression in breast cancer. Breast Cancer 2001;8:45-51.

38. Liao DJ, Dickson RB. c-Myc in breast cancer. Endocr Relat Cancer 2000;7:143-164.

39. von Lintig FC, Dreilinger AD, Varki NM, Wallace AM, Casteel DE, Boss GR. Ras activation in human breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2000;62:51-62.

40. Walker RA, Wilkinson N. p21 ras protein expression in benign and malignant human breast. J Pathol 1988;15:147-153.

41. Sierra A, Castellsagué X, Escobedo A, Lloveras B, García-Ramirez M, Moreno A, et al. Bcl-2 with loss of apoptosis allows accumulation of genetic alterations: a pathway to metastatic progression in human breast cancer. Int J Cancer 2000;89:142-147.

42. Polyak K. Breast cancer gene discovery. Expert Rev Mol Med 2002;4:1-18.

43. Wooster R, Neuhausen SL, Mangion J, Quirk Y, Ford D, Collins N, et al. Localization of a breast cancer susceptibility gene, BRCA2, to chromosome 13q12-13. Science 1994;265:2088-2090.

44. Henderson BE, Ross RK, Judd HL, Krailo MD, Pike MC. Do regular ovulatory cycles increase breast cancer risk? Cancer 1985;56:1206-1208.

45. Parazzini F, La Vecchia C, Negri E, Franceschi S, Tozzi L. Lifelong menstrual pattern and risk of breast cancer. Oncology 1993;50:222-225.

46. Pike MC, Spicer DV, Dahmoush L, Press MF. Estrogens, progestogens, normal breast cell proliferation, and breast cancer risk. Epidemiol Rev 1993;15:17-35.

47. Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer. Breast cancer and hormone replacement therapy: collaborative reanalysis of data from 51 epidemiological studies of 52,705 women with breast cancer and 108,411 women without breast cancer. Lancet 1997;350:1047-1059.

48. Bhatia S, Robison LL, Oberlin O, Greenberg M, Bunin G, Fossati-Bellani F, Meadows AT. Breast cancer and other second neoplasms after childhood Hodgkin's disease. N Engl J Med 1996;334:745-751.

55

49. Willett WC, Stampfer MJ, Colditz GA, Rosner BA, Hennekens CH, Speizer FE. Moderate alcohol consumption and the risk of breast cancer. N Engl J Med 1987;316:1174-1180.

50. Gapstur SM, Potter JD, Sellers TA, Folsom AR. Increased risk of breast cancer with alcohol consumption in postmenopausal women. Am J Epidemiol 1992;136:1221-1231.

51. Vachon CM, Cerhan JR, Vierkant RA, Sellers TA. Investigation of an interaction of alcohol intake and family history on breast cancer risk in the Minnesota Breast Cancer Family Study. Cancer 2001;92:240-248.

52. Boyd NF, Lockwood GA, Byng JW, Tritchler DL, Yaffe MJ. Mammographic densities and breast cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1998;7:1133-1144.

53. Dupont WD, Parl FF, Hartmann WH, Brinton LA, Winfield AC, Worrell JA, et al. Breast cancer risk associated with proliferative breast disease and atypical hyperplasia. Cancer 1993;71:1258-1265.

54. Escobar PF, Patrick RJ, Rybicki LA, Weng DE, Crowe JP. The 2003 revised TNM staging system for breast cancer: results of stage re-classification on survival and future comparisons among stage groups. Ann Surg Oncol 2007;14:143-147.

55. Spratt JS, Spratt SW. Medical and legal implications of screening and follow-up procedures for breast cancer. Cancer 1990;66:1351-1362.

56. Skrabanek P. False premises and false promises of breast cancer screening. Lancet 1985;2:316-320.

57. Kamby C, Vejborg I, Kristensen B, Olsen LO, Mouridsen HT. Metastatic pattern in recurrent breast cancer. Special reference to intrathoracic recurrences. Cancer 1988;62:2226-2233.

58. Clavien PA, Laffer U, Torhost J, Harder F. Gastro-intestinal metastases as first clinical manifestation of the dissemination of a breast cancer. Eur J Surg Oncol 1990;16:121- 126.

59. Bendell JC, Domchek SM, Burstein HJ, Harris L, Younger J, Kuter I, et al. Central nervous system metastases in women who receive trastuzumab-based therapy for metastatic breast carcinoma. Cancer 2003;97:2972-2977.

60. James JJ, Evans AJ, Pinder SE, Gutteridge E, Cheung KL, Chan S, et al.. Bone metastases from breast carcinoma: histopathological - radiological correlations and prognostic features. Br J Cancer 2003;89:660-665.

61. Schapira DV, Urban N. A minimalist policy for breast cancer surveillance. JAMA 1991;265:380-382.

62. te Boekhorst DS, Peer NG, van der Sluis RF, Wobbes T, Ruers TJ. Periodic follow-up after breast cancer and the effect on survival. Eur J Surg 2001;167:490-496.