Mikroorganizmalar ısınmaya maruz kaldıklarında, ölüm oranı oldukça doğrusal bir eğim vermekte, ancak yüksek basınçlı inaktivasyon her zaman birinci dereceden kinetik takip etmemektedir (Klotz ve ark. 2007). Farkas ve Hoover, (2000), Smelt ve ark. (2002) basınca dayanıklı hücrelerde, doğrusal olmayan bir ilişki bildirmişlerdir. Bazı araştırmacılar ise, ölüm oranlarında birinci derece kinetiği yakından takip eden sonuçlar bulmuşlardır (Mussa ve ark. 1999, Ponce ve ark. 1998a).
Gram(+) bakteriler muhtemelen hücre zarındaki farklılıkların bir sonucu olarak Gram (-) bakterilerden daha barotolerantlardır. Gram(+) bakteriler, Gram(-) bakterilere kıyasla hücre yapılarında peptidoglikan ve teikoik asiti daha yüksek oranda bulunudurmaktadırlar (Russell ve ark. 1995, Smelt 1998, Patterson 2005). Araştırmacılar bu durumun yüksekbasınç işleminden kaynaklanan membran hasarını tamir etme yeteneği ile ilişkili olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca, sabit büyüme fazındaki hücreler, üstel büyüme fazındaki hücrelerden daha kolay membran hasarını onarabilmektedir. Metrick ve ark. (1989), YHB uygulamasına tabi tutulmuş farklı Salmonella suşlarında canlı kalan suşların yeniden ürüne dahil edildiğinde, barotoleransta orijinal suştan önemli ölçüde farklı olmadığını bildirmişlerdir.
2.9.1. Hücre morfolojisinde oluşan değişimler
Hücre morfolojisi basınç uygulamasıyla değişmekte ve hücre bölünmesi yavaşlamaktadır. Hücreler uzamakta ve protoplazma viskozitesi değişmektedir (Arıcı 2006). Basınç altında gaz kofullarının sıkışması, hücre duvarının hücre zarından ayrılması, hücre zarının çekmesi, çekirdek veya hücre içi organellerin değişimi, hücre içi maddelerin hücre dışına sızması gibi morfolojik değişimler olmaktadır (İbanoğlu 2002). Bu değişimlerin devamında hücre duvarının kalınlaşması ve kıvrılması gerçekleşebilmektedir (Arıcı 2006). 0,6 MPa YHB ile hücre içi gaz vakuollerinin içe çöktüğü, Hoover ve ark. (1989) tarafından E. coli’de, 40 MPa basınç altında normalde 1-2 μ olan hücre uzunluğunun 10-100 μ’a çıktığı ifade edilmiştir. Hareketli mikroorganizmaların hareket yeteneklerini kaybetmesinin basınç etkisi ile ortaya çıkan yapısal değişimlerden kaynaklandığı ayrıca YHB’ın etkilerinin mikroorganizmanın türüne, basınçlama parametrelerine bağlı olarak tersinir olabilmekte ve
24
basınçkaldırıldıktan sonra mikroorganizmaların eski biçim ve canlılıklarına dönebildiği bildirilmiştir.
2.9.2. Hücre duvarında meydana gelen değişiklikler
Hücre duvarı mikrobiyal hücrelerin şeklini ve sağlamlığını vermektedir. YHB’ın hücre duvarına verdiği zarar nedeniyle, hücreler daha geçirgen olmaktadır (Rastogi ve ark. 2000). Genel olarak, basıncın mikroorganizmalarda zarar verdiği ilk bölgenin hücre zarı olduğu anlaşılmıştır (Hugas ve ark. 2002, Ross ve ark. 2003). Hücre zarı yapısı, fosfolipit ve proteinlerden oluşmaktadır. Basınç uygulanmış hücre zarları, genellikle değişen geçirgenlikler göstermektedir. Hücre membranına zarar Gram(-) ve çubuk şekilli hücrelerde, Gram(+) ve kok şekilli olanlardan daha ciddi olmaktadır (Spilimbergo ve ark. 2002). Hücre duvarı bozulması 400-500 MPa arasındaki uygulamalarda olmakta, çekirdek zarı 100 MPa basınç uygulamaları altında etkilenmeye başlamaktadır. Hücre zarı geçirgenliğinde meydana gelebilecek değişimler hücrenin ölümüne yol açabilmektedir (He ve ark. 2002). Hücrenin içyapısı, organellerin morfolojisi basınca daha duyarlıdır (Hartmann ve Delgado 2003). 500 MPa üzeri basınçlarda hiçbir organel tanınamamaktadır (Brul ve ark. 2000). Perrier- Cornet ve ark. (1995), maya hücresi üzerine 250 MPa YHB sonucu % 15 hacimazalması gözlemlemişlerdir. Bu etki, hücre içinden hücre dış ortamına kütle transferi ile açıklanmaktadır.
Park ve ark. (2001), Lactabacillus viridescens’a 400 MPa (5 dk) YHB sonucunda, SEM (tarama elektron mikrograf) ile yaptıkları incelemede hücre duvarında nodüllerin oluştuğunu, TEM (transmisyon elektron mikrograf) kullanılarak yaptıkları incelemede stoplazmik membran ile hücre duvarı arasında boşlukların oluştuğunu gözlemlemişlerdir.
Ritz ve ark. (2001) tarafından yapılan bir araştırmada sitrat tamponundaki L. monocytogenes’e 10 dk 400 MPa YHB’ın hücre membranına yaptığı başlıca etkilerden birinin, hücre membranındaki fosfolipitlerin düzeninin bozulması olduğu görülmüştür. 400 MPa YHB, hücrenin hacminde önemli bir değişiklik yapmazken, membran bütünlüğünün bozulmasına ve hücre yüzeyinde tomurcukların oluşmasıyla bazı fiziksel zararlar meydana gelmesine neden olduğu bildirilmiştir. Membran potansiyeli ve metabolik aktivitedeki düşüşün hücrelerin büyük bir bölümünde zarar oluşturmadığı görülmüştür. Basıncın sebep olduğu hücre zarındaki görev bozuklukları muhtemelen membran proteinlerinin denatürasyonuna bağlı olarak, aminoasit alımının inhibisyonuna neden olmaktadır. Pek çok çalışma, YHB uygulamasından sonra mikroorganizmaların hücre içi elemanlarının kaybını göstermiştir. Hücrelerden bu bileşenlerin sızmaları, hücre zarındaki hasara işaret eder ve
25
hücrelerden artan kayıp oranı yükseldikçe ölümün ve hasarın derecesi de o nispette artmaktadır (Arıcı 2006). Zarar görmemiş hücre membranı normalde geçirgen değildir (Patterson 2005). Ancak YHB ile birlikte, hücre zarı geçirgenliği artmaktadır (Yuste ve ark. 2002). Basıncın, membranda geri dönüşümsüz zararlarından dolayı logaritmik çoğalma fazında hücreler inaktive olurken sabit fazda membran bütünlüğü korunmaktadır. YHB ile sıcaklık membran akışkanlığında zıt etki göstermektedirler. Tekli ve çoklu doymuş yağ asitleri oranının artması ve membran akışkanlığının düzenlenmesi ile psikrofilik bakterilerin fizyolojik adaptasyona neden olduğu bildirilmektedir (Molina-Hoppner ve ark.2003).
2.9.3. Biyokimyasal reaksiyonlarda meydana gelen değişimler
YHB, hacim arttıran reaksiyonları yavaşlatırken, hacim azaltan reaksiyonları isehızlandırmaktadır. Biyokimyasal reaksiyonların çoğu hacim değişimine neden olduğu için basınç uygulamasından etkilenmektedir (Patterson 2005). Mikrobiyal hücrelerin basınçla inaktivasyonunda önemli protein bölgeleri içeren enzimler ve özellikle hücre zarına bağlı enzimlerdir (Mackey ve ark. 1995). Enzim inaktivasyonunu teşvik eden faktörler molekül içi yapıların değişimi ve enzimin aktif bölgelerindeki değişimlerdir (Arıcı 2006). YHB ile birlikte, hücre içi bileşenler parçalanmakta, hücrede enerji üreten reaksiyonlar yavaşlamakta, hücre büyümesi için gerekli enzimler fonksiyonlarını kaybetmekte ve büyüme için gerekli olan pH aralığı azalmaktadır (Hugas ve ark. 2002). YHB uygulamasıyla laktik asit bakterilerinin bazı proteinlerinin fonksiyonlarını ve morfolojisini değiştirdiği (Molina- Hoppner ve ark. 2003) bildirilmiştir. Bunula birlikte L. monocytogenes’e basınç uygulanmasından sonra hücre aktivitesiyle ortaya çıkan esteraz’ın özelliklerini değiştirdiği görülmüştür (Ritz ve ark. 2001). YHB’a enzimlerin direnci değişkenlik göstermektedir. Mikrobiyal enzimlerden B. subtilis α-amilaz 500 MPa basınca direnç gösterirken, L. Monocytogenes fosfoglukomutaz ve akonitaz’ın 200 MPa ile inaktive olduğu, ancak enzimlerin yüksek basınçla inaktive olması ile L. monocytogenes’in basıncadirenci arasında bir ilişki tespit edilemediği bildirilmiştir (Patterson 2005). Mikroorganizmalar üzerine YHB’ın öldürücü etkisinin, denatürasyon sonrası bazı önemli enzimlerin inaktivasyonu sonucu gerçekleştiği, 100-300 MPa basınçlar arasında tersinir olan denatürasyonun, 300 MPa üzeri basınçlarda geri dönüşümsüz hale geçtiği ifade edilmiştir (Hoover ve ark. 1989).
26
2.9.4. Genetik mekanizmada meydana gelen değişimler
Nükleik asitler yüksek basınca proteinlerden daha dayanıklı olup, basınçtan daha az etkilenmektedirler. DNA ve proteinlerin basınca karşı farklı toleransta olmasının nedeni olarak moleküller arası hidrojen bağlarının DNA’da proteinlere kıyasla daha yüksek oranda olması gösterilmektedir (Hoover ve ark. 1989). Yapılan araştırmalarda 100 MPa’da uzun süreli uygulamalarda bile bazı hücrelerin DNA yapısının korunduğu bildirilmiştir (Gökmen ve Acar 1995). DNA’nın tabi yapısında stabilizasyon ortaya çıkmaktadır. Buna karşın E. coli’de çekirdek materyallerinde sıkışma olduğu (Mañas ve Mackey 2004) ve L. viridescens’a (5 dk) 600 MPa YHB uygulandığında DNA’nın bozulduğu bildirilmiştir (Park ve ark. 2001).