YETKİNLİKLER

5.1 – Atividade Tóxica dos Genótipos BR-10, TRC, TRCH e CRCH

A FIGURA 6 mostra os valores de DL50 dos extratos totais obtidos a

partir de sementes dos diferentes genótipos. Todos eles apresentaram toxicidade para camundongos, quando administrados pela via ip, sendo o genótipo BR-10 o mais tóxico (DL50 563,0 22,5 mgP/Kg de peso corpóreo).

Os sintomas apresentados pelos animais foram característicos de comprometimento do sistema nervoso central, tendo sido observado piloereção, estiramento da cauda e patas, taquicardia e convulsão, seguida de morte. É bastante provável que a toxicidade observada seja devida à presença de soyatoxina (SYTX) e toxina da soja (SBTX) nas sementes, uma vez que os princípios tóxicos mantiveram-se ativos após diálise dos extratos e tornaram-se inativos quando estes foram submetidos ao tratamento térmico (92 ºC, 5 minutos). Os sintomas observados foram semelhantes àqueles descritos por Vasconcelos et al. (1994) e Siebra (1998; 2004), quando administraram em camundongos, por via ip, a SYTX e SBTX puras, toxinas estas isoladas de sementes da soja comercial e do genótipo BR-10, respectivamente. Além disso, sintomatologia observada foi similar àquela induzida pela canatoxina (CNTX), uma neurotoxina (CARLINI e GUIMARÃES, 1981).

O genótipo BR-10 foi, então, selecionado para dar prosseguimento ao isolamento e caracterização da SYTX, tendo em vista ter apresentado o menor valor de DL50, quando comparado aos demais genótipos.

FIGURA 6 – Atividade tóxica dos extratos totais obtidos a partir dos genótipos BR-10, Teresina-RC, Teresina-RCH e Cariri-RCH. A atividade foi expressa como DL50, representando a quantidade de proteína, em mgP/Kg de peso

corpóreo de camundongo, capaz de produzir convulsão e morte em 50% dos animais injetados por via intraperitoneal. Letras iguais representam valores que não diferiram significativamente (p > 0,05) pelo teste de Tukey.

. 0 200 400 600 800 1000 1200 BR-10 Teresina-RC Teresina- RCH Cariri-RCH DL 50 c a b bc

5.2 – Purificação da SYTX de Sementes de Soja, Genótipo BR-10

Vasconcelos e colaboradores (1994) já haviam relatado que DTT, 0,005 M, conferia estabilidade à toxina, prolongando sua toxicidade. Neste trabalho foi observado que a presença do DTT não apenas manteve a toxicidade da SYTX, como também foi crucial para sua obtenção, sendo, portanto, utilizado em todo o processo. A temperatura foi outro fator importante para manutenção da atividade tóxica dessa proteína. Assim sendo, praticamente todas as etapas foram conduzidas a 4 ºC.

O extrato total obtido a partir da farinha dos genótipos foi submetido à precipitação com sulfato de amônio em diferentes faixas de saturação, como descrito anteriormente no item 4.4.2. A fração 20-55% (F20-55%) foi a que

apresentou maior toxicidade para camundongos quando administrada por via ip, sendo, então, a fração escolhida para dar prosseguimento ao processo de purificação da SYTX. A F20-55%, também denominada de PREP.B, após diálise

contra Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5 e adição de DTT 0,005 M, foi submetida à cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose previamente equilibrada com o tampão Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5 (FIGURA 7). O material não retido, eluído com tampão de equilíbrio, foi composto por dois picos protéicos denominados PREP.C-Ia e C-Ib. Logo após, foi adicionado NaCl 0,15 M para a retirada do PREP.C-II. Finalmente, foi aplicado um gradiente salino (NaCl) na faixa de 0,15 a 0,7 M, que resultou na eluição de mais duas frações protéicas denominadas de PREP.C-IIIa e PREP.C-IIIb. Determinação da atividade tóxica, realizada com todas essas frações, revelou toxicidade no PREP.C-Ia, sabidamente rico em SBTX, e PREP.C-IIIb. Nessa etapa ocorreu a primeira modificação do protocolo estabelecido por Vasconcelos et al. (1994), que utilizaram um gradiente na faixa de 0 – 1 M de NaCl. Essa mudança fez com que a SYTX fosse obtida numa forma quase pura, praticamente livre do KSTI, uma proteína que co-purificava com a SYTX, nessa etapa cromatográfica. Isso foi de fundamental importância, uma vez que o KSTI é

FIGURA 7 – Cromatografia em coluna de DEAE-Celulose. PREP.B (400 mg), contendo DTT 0,005 M, foi aplicado em coluna de DEAE-Celulose (38,0 x 1,6 cm), equilibrada com Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5. PREP.C-Ia e PREP.C-Ib correspondem às proteínas não-retidas. PREP.C-II, proteínas eluídas após adição de NaCl 0,15 M ao tampão de equilíbrio. PREP.C-IIIa e PREP.C-IIIb, proteínas eluídas após aplicação do gradiente salino (0,15 a 0,7 M de NaCl no tampão de equilíbrio). Fluxo: 45 mL/h; Frações: 2,2 mL. O símbolo (●) indica fração com atividade tóxica.

0.15 0.70 0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 51 101 151 201 NaCl (M ) A28 0 nm Frações NaCl 0,15 M NaCl 0,15 – 0,7 M C-Ia C-Ib C-II C-IIIa C-IIIb

capaz de exercer efeitos tóxicos e/ou antinutricionais sobre uma série de modelos experimentais. Com a finalidade de evitar qualquer contaminação da SYTX com o KSTI, o PREP.C-IIIb foi submetido à cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose-4B-tripsina (FIGURA 8). O material não retido, PREP.D-Ib, obtido com o próprio tampão de equilíbrio, Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, contendo NaCl 0,15 M, concentrou toda atividade tóxica e não apresentou atividade inibidora de tripsina. O PREP.D-II, eluído com tampão glicina-HCl 0,05 M, pH 2,2, contendo NaCl 0,15 M, não apresentou toxicidade para camundongos pelas vias ip e iv e foi capaz de inibir a tripsina, demonstrando ser este material o KSTI. Todavia, embora o PREP.C-IIIb ainda tivesse contaminado com o KSTI, observando a FIGURA 5, foi verificado que o PREP.D-II tratava-se de uma fração minoritária, quando comparada ao PREP.D-Ib, evidenciando que a modificação introduzida na cromatografia de troca iônica foi fundamental para a purificação da SYTX.

Finalmente, o PREP.D-Ib foi submetido à cromatografia de exclusão molecular em coluna de Superdex 200 HR 10/30 acoplada a um sistema FPLC (FIGURA 9). Essa etapa teve como objetivos verificar o grau de pureza da toxina, bem como a determinação de sua massa molecular. A pureza do material obtido foi demonstrada pela presença de apenas um pico cromatográfico, apresentando alta toxicidade para camundongos. A TABELA 1 mostra os índices de purificação e rendimento obtidos durante as etapas de purificação da SYTX na presença de DTT 0,005 M. O índice de purificação e o rendimento da SYTX foram 125,1 vezes e 65,2%, respectivamente. Quando esses valores foram comparados com aqueles reportados por Vasconcelos e colaboradores (1994), foi verificado que a purificação da SYTX obtida anteriormente havia sido inferior (119 vezes). A recuperação da atividade tóxica obtida nesse trabalho ficou bem acima dos 46% apresentado previamente. Como já colocado, a presença de DTT 0,005 M foi de grande importância para a purificação da SYTX. De fato, na ausência de DTT, as etapas cromatográficas ocasionaram perfis de eluição muito distintos daqueles observados na presença desse agente redutor. Por exemplo, quando não utilizado DTT, não foi possível a separação das frações PREP.C-IIIa e

FIGURA 8 – Cromatografia em coluna de Sepharose-4B-tripsina. PREP.C-IIIb (10 mg), contendo DTT 0,005 M, foi aplicado em coluna de Sepharose-4B- tripsina (1,0 x 22 cm), equilibrada com Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, contendo NaCl 0,15 M. PREP.D-Ia e PREP.D-Ib correspondem às proteínas não-retidas. PREP.D-II, proteínas eluídas com tampão glicina-HCl 0,05 M, pH 2,2, contendo NaCl 0,15 M. Fluxo: 20 mL/hora; Frações: 1,5 mL. Os símbolos ● e ● indicam as frações com atividade tóxica e inibidora de tripsina, respectivamente.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0 20 40 60 A280 nm Frações D-Ia D-Ib Glicina-HCl 0,05 M, pH 2,2,c/ NaCl 0,15 M D-II

FIGURA 9 – Cromatografia em coluna de Superdex 200 HR 10/30 acoplada a um sistema de FPLC. PREP.D-Ib (1 mg) foi aplicado em coluna de Superdex 200 HR 10/30, previamente equilibrada com Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, contendo NaCl 0,5 M. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 1,0 mL.

TABELA 1– Purificação da soyatoxina (SYTX) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0 10 20 30 A28 0 nm Frações SYTX

Etapaa _{mgP/100 gF}b _DL 50c Índice de Purificaçãod Rendimento e (%) PREP.A (Extrato bruto) 13.100 76,0 563,0 22,5 1,0 100,0 PREP.B (F20-55%) 9.100 89,0 422,0 16,0 1,3 92,7 PREP.C-IIIb (DEAE-Celulose) 84,6 5,0 5,4 0,5 104,2 67,3 PREP.DIb (Sepharose-4B- Tripsina) 70,8 1,0 4,6 0,1 122,4 66,1 SYTX (Superdex 200 HR 10/30) 68,3 1,0 4,5 0,1 125,1 65,2

a _{Etapas de purificação da SYTX como descritas em métodos. Os resultados}

representam a média e o desvio padrão de seis experimentos similares.

b _{Quantidade total de proteína recuperada (mg), em cada etapa de purificação,}

a partir de 100 g de farinha de soja.

c _{Uma DL}

50 representa a quantidade de proteína em mg/Kg de peso corpóreo de

camundongo, capaz de produzir convulsão e morte, dentro de 24 h, em 50% dos animais testados, quando injetados por via intraperitoneal.

d _{Índice de purificação calculado através da relação da DL}

50 de cada etapa de

purificação e àquela do extrato bruto, considerada como 1,0.

e _{Recuperação da atividade tóxica em cada etapa de purificação (extrato bruto,}

PREP.C-IIIb, verificada após a aplicação do gradiente salino na cromatografia de troca iônica em matriz de DEAE-celulose. Em vez disso, um único pico foi obtido, apresentando uma alta atividade inibidora de tripsina e, apenas, uma baixa toxicidade para camundongos pelas vias ip e iv (FIGURA 10).

Há relatos na literatura de que a presença de DTT, durante o processo de purificação de proteínas, é importante para que haja o correto enovelamento dessas moléculas e, ainda, para prevenir a formação de agregados protéicos (O’HANDLEY, 2002). Portanto, é possível que a ausência de DTT tenha alterado a solubilidade da SYTX e/ou de outras proteínas modificando as interações destas com a matriz de DEAE-celulose e, consequentemente, o perfil cromatográfico. Em alguns casos, o DTT tem sido utilizado na purificação de enzimas que possuem resíduos de cisteína em seu sítio catalítico, como a papaína, a fim de manter a atividade catalítica dessas proteínas (XIAM et al., 2000). No caso da SYTX, a atividade tóxica foi independente da presença de DTT, mas foi prolongada na presença desse agente redutor. Portanto, a atividade tóxica da SYTX não parece depender de resíduos de cisteína reduzidos, como no caso da papaína, mas, uma vez reduzidos estes resíduos permitem que a proteína se mantenha numa conformação espacial tal que perdure a sua atividade tóxica.

Como dito anteriormente, Vasconcelos et al. (1994), quando isolaram a SYTX, utilizaram sementes de soja comercial, portanto, uma mistura de genótipos. Nesse trabalho foi feita a escolha de um genótipo, o BR-10, o mesmo utilizado por Siebra (1998, 2004) para isolamento da SBTX. Ainda que tenham sido feitas algumas modificações, as etapas de purificação utilizadas nesse trabalho foram semelhantes àquelas do protocolo estabelecido anteriormente por Vasconcelos et al. (1994), sugerindo que, independentemente do genótipo de soja utilizado, ele pode ser usado para obtenção da toxina.

Quando as duas toxinas da soja foram comparadas em relação à toxicidade e teor nas sementes de soja, os resultados obtidos mostraram que a SYTX (DL50 de 4,5 mgP/Kg de peso corpóreo; 68,3 mgP/100 g de farinha) foi

0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 100 200 A28 0 nm Frações

FIGURA 10 – Cromatografia em DEAE-celulose. PREP.B (400 mg), não contendo DTT 0,005 M, foi aplicado em coluna de DEAE-Celulose (38,0 x 1,6 cm), equilibrada com Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5. PREP.C-Ia e PREP.C-Ib correspondem às proteínas não-retidas. PREP.C-II, representa as proteínas eluídas após adição de NaCl 0,15 M ao tampão de equilíbrio. PREP.C-IIIa e PREP.C-IIIb constituem as proteínas eluídas após aplicação do gradiente salino (0,15 a 0,7 M de NaCl no tampão de equilíbrio). Fluxo: 45 mL/h; Frações: 2,2 mL. NaCl 0,15 – 0,7 M NaCl 0,15 M C-I C-II C-IIIa + C-IIIb

mgP/Kg de peso corpóreo; 30,0 mgP/100 g de farinha).

5.3 – Caracterização Físico-Química, Bioquímica e Estrutural da SYTX

5.3.1 – Massa Molecular

Uma única banda protéica, de massa molecular aparente em torno de 28,0 kDa, foi observada quando a SYTX foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes (PAGE-SDS), na presença de - mercaptoetanol (FIGURA 11). Resultado similar foi obtido na ausência de - mercaptoetanol. Tais resultados mostram que a SYTX, provavelmente, é uma proteína monomérica. Todavia, a massa molecular aparente da SYTX verificada neste trabalho diverge daquela apresentada por Vasconcelos et al. (1994), que foi de 21,0 kDa. É possível que isto esteja relacionado ao material vegetal utilizado para purificação da toxina. Nesse trabalho foi selecionado um genótipo, cujas sementes quiescentes mostraram bom poder de germinação, diferentemente da soja comercial anteriormente utilizada, que representava uma mistura de genótipos desprovidos de capacidade germinativa, mesmo quando avaliada em diferentes condições. Um outro fator que pode ter contribuído, diz respeito à presença de DTT 0,005 M em todas as etapas de purificação realizadas no presente estudo, muito embora não se tenha idéia de como esse agente redutor teria agido de modo a ocasionar essa diferença. Por fim, é também possível que nesse trabalho tenha sido obtida uma nova toxina da soja diferente da SYTX. Afinal, recentemente foi mostrado, através de análises proteômicas, que das 422 proteínas identificadas em sementes de soja, 92 foram tidas como desconhecidas, algumas dessas com massa molecular na faixa de 27 a 30 kDa e pI entre 4,0 e 6,5 (HADJUCH et al., 2005).

FIGURA 11 - Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes, na presença de -mercaptoetanol, da soyatoxina (SYTX). A revelação da eletroforese foi feita com prata. Raia 1 - Marcadores de massa molecular (fosforilase B, 97,0 kDa; albumina sérica bovina, 67,0 kDa; albumina do ovo, 45,0 kDa; anidrase carbônica bovina, 29,0 kDa e inibidor de tripsina de soja tipo Kunitz, 20,1 kDa); Raia 2 – Inibidor de tripsina da soja (KSTI) e Raia 3 – SYTX.

Por cromatografia de exclusão molecular, em coluna de Superdex 200 HR

1 2 3

7,5, contendo NaCl 0,5 M, a SYTX foi resolvida num único pico (FIGURA 9), bem definido, com massa molecular de 25,4 kDa (FIGURA 12). Esta massa molecular é muito próxima àquela verificada por PAGE-SDS.

5.3.2 – Espectro de Absorção e Coeficiente de Extinção (ε1% 1cm)

O espectro de absorção da SYTX, quando solubilizada em água grau milli-Q (1 mg/mL), revelou uma absorção máxima a 280 nm (FIGURA 13). O valor do coeficiente de extinção a 280 nm, ε1%

1 cm, foi de 16,9. Outras proteínas

apresentaram valores de coeficiente de extinção próximos ao encontrado para a SYTX. Como exemplo, a tripsina do pâncreas bovino (14,3), a lectina de Vicia villosa (16,4), o inibidor de tripsina do milho (20,0) e a -glucuronidase de fígado bovino (17,0) (PLAPP e COLE, 1966; QIAN et al., 1994). Por outro lado, o valor de 1%

1 cm da SYTX foi bem superior ao encontrado para a SBTX, que

foi 6,3 (SIEBRA, 2004).

A adição de DTT 0,005 M na amostra causou um ligeiro aumento de absorção, principalmente no comprimento de 280 nm (FIGURA 13). É sabido que o DTT quando oxidado, principalmente devido à presença de oxigênio no meio, absorve a 280 nm, enquanto que na sua forma reduzida isso não ocorre. Portanto, o aumento na absorção parece ser devido ao próprio DTT e não devido à sua interação com a SYTX, já que este agente redutor exerce seu efeito sobre resíduos de cisteína, que não contribuem significativamente para absorbâncias acima de 275 nm (PACE et al., 1995). De fato, como o DTT trata-se de um agente redutor de pontes dissulfeto, não se esperaria que ele interferisse com a absorção dos resíduos de triptofano e/ou da tirosina, a menos que ele deixasse tais aminoácidos mais expostos. Fato semelhante foi observado para a SBTX após a adição de DTT 0,005 M (SIEBRA, 2004).

FIGURA 12 – Estimativa da massa molecular da soyatoxina (SYTX) por cromatografia de exclusão molecular em coluna de Superdex 200 HR 10/30, equilibrada com tampão Tris-HCl 0,025 M, pH 7,5, contendo NaCl 0,5 M. Fluxo: 30 mL/h; Frações: 1,0 mL. y = -2,9206x + 6,2053 R2_{= 0,9999} 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 log M r Kav (ml) BSA A. CARBÔNICA OVALBUMINA CITOCROMO C APROTININA KSTI SYTX

FIGURA 13 – Espectro de absorção da soyatoxina (SYTX). As absorbâncias da proteína (1 mg/mL) foram registradas na faixa de comprimento de onda de 220 a 360 nm. 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 220 240 260 280 300 320 340 360 A bso rbâ ncia Comprimento de onda (nm) SYTX sem DTT SYTX com DTT

5.3.3 – Dosagem de Carboidratos

Por PAGE-SDS, corada com o ácido periódico de Schiff, foi mostrado que a SYTX não possui carboidratos em sua estrutura (FIGURA 14). Esta propriedade diferencia a SYTX de outras neurotoxinas, como a SBTX, que apresentou 5% de carboidratos, e a lectina tóxica da salsa (LTS), que mostrou ter a cadeia glicídica ligada covalentemente aos resíduos de aminoácidos (SANTOS, 2001).

5.3.4 – Determinação da Seqüência NH2-terminal

A seqüência NH2-terminal apresentada pela SYTX foi

SPPGDITIYWGQNIDDGTLTNDIDKGNFF. Essa seqüência exibe 75% de identidade com uma endoquitinase acídica da classe III de soja (YEBOAH et al., 1998) (TABELA 2).

O alinhamento da seqüência NH2-terminal da SYTX com seqüências

deduzidas a partir do cDNA de várias outras quitinases da classe III (ácidas e básicas) mostrou a conservação de vários resíduos de aminoácidos, destacando-se aqui aquelas isoladas de Sesbania rostrata (64%), Oryza sativa (56%), Vitis vinifera (52%), Rehmannia glutinosa (52%), Beta vulgaris (52%) Nicotiana tabacum (48%), Medicago truncatula (50%) e Vigna unguiculata (50%), V. angularis (42%) (ALTSCHUL et al ., 1997) (TABELA 2).

5.3.5 – Avaliação da Atividade Quitinolítica da SYTX

A partir da identidade de seqüência da SYTX com várias quitinases da classe III foi levantada a questão se a SYTX apresentaria atividade

FIGURA 14 – Eletroforese em gel de poliacrilamida da soyatoxina (SYTX) corada com ácido periódico de Schiff. Raia 1: Peroxidade de soja (controle positivo) e Raia 2: SYTX.

TABELA 2 – Comparaçãoa _{da seqüência de aminoácidos NH}

2-terminal da soyatoxina (SYTX) com a seqüência NH2-

terminal de uma endoquitinase de Glycine max (GmC) e com as seqüências deduzidas a partir do cDNA de quitinases de Oryza sativa (OsC), Vitis vinifera (VvC), Rehmannia glutinosa (RgC), Beta vulgaris (BvC), Nicotiana tabacum (NtC), Medicago truncala (MtC), Vigna unguiculata (VuC) e V. angularis (VaC)

SYTX 1-28 S P P G D I T I Y W G Q N I D D G T L T N D I D K G N F GmC 1-28 S T T G G I T I Y W G Q N I D D G T L T S T C D T G N F OsC 21-45 G D I A I Y W G Q N G N E G T L A Q T C A T G N Y VvC 26-50 G G I A I Y W G Q N G N E G T L T Q T C N T G K Y RgC 25-49 G K I S I Y W G Q N G N E G T L A E T C A T G N Y BvC 28-50 I V I Y W G Q N G D E G S L A D T C N S G N Y NtC 23-47 G D I V I Y W G Q N G N E G S L A D T C A T N N Y MtC 25-52 S N A G K I S I Y W G Q N G N E G T L A E A C A T G N Y VuC 21-48 S H A G G I A I Y W G Q N G N E G T L S E A C D T G R Y VaC 23-50 S H A G G I S V Y W G Q N G N E G S L A D A C N T G N Y

a _{As áreas sombreadas representam os aminoácidos conservados. Em amarelo estão os aminoácidos conservados}

em todas as seqüências analisadas; Em azul, o aminoácido conservado em todas as quitinases usadas para comparação com a SYTX e em rosa, os aminoácidos presentes em todas as quitinases, exceto na GmC. As letras

quitinolítica.

Assim sendo, ensaios para avaliação dessa atividade foram realizados usando-se duas metodologias: um ensaio colorimétrico e um zimograma, onde quitina coloidal e glicol quitina foram utilizadas como substratos, respectivamente.

Pelo ensaio colorimétrico foi observado que a SYTX apresentava atividade quitinolítica, cuja atividade foi correspondente a 1,34 nkat/mgP. Através do zimograma, foi detectada uma fraca interação da SYTX com o substrato, quando comparada ao controle (quitinase de Streptomyces griseus) (FIGURA 15). Ainda que os substratos utilizados tenham sido diferentes, a atividade aqui detectada foi comparada com aquela apresentada pela endoquitinase acídica da classe III de soja, cuja atividade foi em torno de 399 nkat/mgP (YEBOAH et al., 1998). Diferenças de especificidade pelo substrato têm sido observadas para diversas enzimas, inclusive para as quitinases. Por exemplo, uma quitinase presente em cepas de Trichoderma, com massa molecular de 42 kDa, apresentou uma capacidade 100 vezes maior de hidrolisar a glicol quitina do que a quitina coloidal (REY et al., 2000).

Considerando as quitinases da classe III, com as quais identidade de seqüência da SYTX foi constatada, há relatos de que aquelas apresentando propriedades ácidas possuem em seus domínios catalíticos os resíduos de Asp (125) e Glu (127), considerados fundamentais para a atividade dessas enzimas (YEBOAH et al., 1998). Uma vez que a SYTX apresentou atividade quitinolítica, é bastante provável que ela possua tais resíduos em sua estrutura. Todavia, a presença de identidade não necessariamente indica que a proteína possui atividade quitinolítica. A concanavalina B, por exemplo, uma proteína de sementes de Canavalia ensiformis, cuja seqüência apresentou similaridade com quitinases acídicas da classe III, além de ter mostrado uma extensão C-terminal de 16 resíduos, característica dessas enzimas, não foi capaz de hidrolisar a quitina (SCHLESIER et al., 1996).

Quitinases apresentando outros de tipos de atividades biológicas têm sido encontradas na literatura. Como exemplos, podem ser citadas as quitinases de Solanum tuberosum, que possui atividade inibitória

FIGURA 15 – Atividade quitinolítica da SYTX em gel de poliacrilamida na ausência de -mercaptoetanol (zimograma). Após a corrida eletroforética, o gel ficou em contato com o tampão de renaturação (acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0, contendo 1% de Triton X-100) durante 12 h, em banho-maria a 45 C e foi revelado após tratamento do gel com calcoflúor, sendo a visualização das bandas feita sob luz ultravioleta. Raia 1 – quitinase de Streptomyces griseus e Raia 2 – SYTX.

de proteases aspárticas, a de Coix lochryma jobi, capaz de inibir α-amilase e a de Brassica juncea, que possui atividade hemaglutinante (COLLINGE et al., 1993; GUEVARA et al., 2001; CHYE et al., 2005). Dessa forma, A SYTX não corresponde uma exceção, tendo apresentado atividade quitinolítica e toxicidade aguda para camundongos e ratos. Em relação às outras atividades avaliadas, a SYTX não foi capaz de inibir tripsina e nem de aglutinar eritrócitos.

6 – CONCLUSÕES

A presença de DTT 0,005 M foi de grande importância para a purificação da toxina, tendo promovido um índice de purificação de 125,1 vezes e um rendimento da atividade tóxica de 65,2%. Esses valores foram 1,1 e 1,4 vezes mais elevados do que aqueles obtidos anteriormente por Vasconcelos et al. (1994), possibilitando o seu acúmulo para os estudos de caracterização físico- química, bioquímica e estrutural da proteína, bem como para aqueles relacionados aos seus mecanismos de ação e papel fisiológico.

Dentre as diferentes propriedades apresentadas pela toxina aqui isolada, devem ser ressaltadas a massa molecular aparente de 28,0 kDa, obtida por PAGE-SDS, diferindo daquela anteriormente obtida que foi 21,0 kDa, a atividade quitinolítica e a identidade de 75% observada entre a sua seqüência NH2-terminal e aquela de uma endoquitinase acídica da classe III de sementes

de soja. É possível que tais proteínas sejam produtos de genes relacionados, que sofreram algumas mutações divergentes em regiões não selecionadas com o sítio quitinolítico, e/ou alterações pós-traducionais diferenciadas, que levaram à expressão de isoformas de quitinases.

Por fim, deve ser ressaltado que este trabalho se trata do primeiro relato