4.1. Animais
Os experimentos foram realizados em ratos Wistar machos, com peso oscilando entre 180 220g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará – UFC, e mantidos na sala de experimentação do Núcleo de Estudos em Microscopia e Processamento de Imagens – NEMPI em gaiolas de polipropileno recebendo água e comida ad libitum, em sala climatizada, com exaustão de gases e redução de ruídos. Os protocolos experimentais estão de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA). O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFC através do protocolo 35/15 (Anexo A). 4.2. Indução da artrite experimental
Os animais foram sensibilizados com 500 µg de mBSA em 200 µL de uma emulsão contendo 100 µL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 100 µL de CFA administrado por injeção subcutânea no dorso. As injeções de reforço de mBSA dissolvido em IFA foram administradas 7 e 14 dias após a primeira imunização, em diferentes locais no dorso do animal. Vinte e um dias após a injeção inicial, os animais foram anestesiados com quetamina 2% (100 mg/Kg) e xilazina 10% (10 mg/Kg), por via intraperitoneal, e a artrite na ATM esquerda foi induzida nos animais imunizados por injeção intraarticular de mBSA (10 µg/articulação) dissolvido em 10 µl de PBS. Injeções de reforço na ATM foram dadas nos dias 28 e 35. Os animais foram eutanasiados 7 dias após a primeira indução, 24 horas após a segunda e a terceira indução e 7 dias após a segunda e terceira indução. 4.3. Grupos Experimentais • Grupo Controle: Grupo constituído por 6 animais não submetidos a indução da AR. • Grupo mBSA (1) 7d: Grupo constituído por 6 animais submetidos à indução da AR com 1 injeção intraarticular de mBSA na ATM esquerda (10
µg/articulação) no dia 21. Esse grupo foi eutanasiado 7 dias após a injeção de mBSA na ATM.
• Grupo mBSA (2) 24h: Grupo constituído por 6 animais submetidos à indução da AR por mBSA na ATM esquerda (10 µg/articulação) e solução salina 0,9% na ATM direita (10 µl/articulação), nos dias 21 e 28 (após a primeira sensibilização subcutânea com CFA). Esse grupo foi eutanasiado 24 horas após a segunda injeção de mBSA na ATM.
• Grupo mBSA (2) 7d: Grupo constituído por 6 animais submetidos à indução da AR por mBSA na ATM esquerda (10 µg/articulação), que receberam duas injeções intraarticulares nos dias 21 e 28 (após a primeira sensibilização subcutânea com CFA). Esse grupo foi eutanasiado 7 dias após a segunda injeção de mBSA na ATM.
• Grupo mBSA (3) 24h: Grupo constituído por 6 animais submetidos à indução da AR por mBSA na ATM esquerda (10 µg/articulação) e solução salina 0,9% na ATM direita (10 µl/articulação), nos dias 21, 28 e 35 (após a primeira sensibilização subcutânea com CFA). Esse grupo foi eutanasiado 24 horas após a terceira injeção de mBSA na ATM.
• Grupo mBSA (3) 7d: Grupo constituído por 6 animais submetidos à indução da AR por mBSA na ATM esquerda (10 µg/articulação), nos dias 21, 28 e 35 (após a primeira sensibilização subcutânea com CFA). Esse grupo foi eutanasiado 7 dias após a terceira injeção de mBSA na ATM.
O protocolo experimental de indução da AR por mBSA na ATM pode ser observado na figura 4 abaixo:
Figura 4 – Protocolo de indução da AR por mBSA na ATM de ratos Fonte: Próprio autor. 4.4. Parâmetros avaliados 4.4.1. Hipernocicepção mecânica (teste nociceptivo) O limiar de nocicepção do animal foi obtido através do registro da intensidade de força aplicada na região da ATM, através de uma resposta reflexa (movimento de retirada da cabeça). Para isso, o aparelho Von Frey eletrônico (Analgesímetro Digital, Insight, São Paulo, Brasil), que é um transdutor de força que mede o limiar de nocicepção em gramas (g), foi aplicado perpendicularmente na região avaliada.
Os animais foram submetidos a sessões de condicionamento ao teste de hipernocicepção mecânica durante os 5 dias que antecediam a realização do experimento. Os animais foram mantidos durante 20 min em caixas plásticas e submetidos a aplicação do aparelho Von Frey na região da ATM esquerda (Gondim et al., 2012).
Um observador foi treinado para a aplicação gradual de pressão na região da ATM do animal. O aparelho era automaticamente removido e o registro da pressão obtido assim que o animal realizasse o movimento de retirada da cabeça. É importante ressaltar que o observador não teve conhecimento do tipo de tratamento que os animais receberam (Gondim et al., 2012).
No sexto dia, antes do início da avaliação da hipernocicepção, os animais foram tricotomizados na região ao redor da ATM esquerda e mantidos em repouso durante
20 min em caixas plásticas. Os testes foram realizados nos dias 0, 1, 3, 6, 8, 11, 13, 15, 18 e 20 após a indução subcutânea de mBSA e Adjuvante de Freund, e nos dias 20, 21, 24, 28, 31, 35 e 42 após a injeção intraarticular de mBSA. 4.4.2. Coleta da ATM, líquido sinovial e tecidos periarticulares Para a coleta da ATM, líquido sinovial e tecidos periarticulares, os ratos foram eutanasiados por uma alta dosagem de anestésico e relaxante muscular (quetamina 300 mg/kg e xilazina 70mg/kg). A pele ao redor das ATMs foi retirada e o músculo temporal cuidadosamente dissecado. Uma agulha de calibre 30 foi inserida através da região posterior da membrana sinovial e a cavidade articular lavada por injeção e imediata aspiração de 10μl de um tampão fosfatosalino (PBS) adicionado a 10mM de ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA). O procedimento de lavagem foi executado por duas vezes e 20 µl do líquido sinovial foi coletado para a contagem de células. (DenadaiSouza et al., 2009).
As ATMs e tecidos periarticulares foram removidos e fixados em solução de formol tamponado a 10% durante 24 h e desmineralizados em solução de EDTA a 10% por 40 dias. Após a desmineralização, as peças foram desidratadas e parafinizadas para posterior realização de analise histopatológica e imunoistoquímica (Gondim et al., 2012). 4.4.3. Análise histopatológica da ATM Secções de 4 μm, que incluíam o côndilo, cartilagem articular, disco articular, membrana sinovial e tecido periarticular foram examinados através da microscopia de luz (microscópio Leica DM 2000). Os espécimes foram corados por hematoxilina eosina (HE) e os cortes foram avaliados por um examinador que desconhecia os grupos experimentais. Escores foram dados de maneira semiquantitativa para os parâmetros avaliados: infiltrado inflamatório da membrana sinovial, espessamento da membrana sinovial e destruição da cartilagem articular. As secções foram classificadas numa escala de 03 para infiltrado inflamatório, onde: 0 = sem infiltrado; 1 = infiltração leve na sinóvia; 2 = infiltrado sinovial moderado; 3 = intensa infiltração
sinovial. Para espessamento da membrana sinovial, uma escala de 03, onde: 0 = sem espessamento; 1 = discreto espessamento da membrana sinovial; 2 = moderado espessamento sinovial; 3 = intenso espessamento da membrana sinovial. Já para destruição articular, uma escala de 0 a 2, onde: 0 = sem destruição; 1 = discreta destruição articular; 2 = destruição articular moderada a intensa (Williams et al., 1996).
As células inflamatórias na membrana sinovial (macrófagos, linfócitos e plasmócitos) foram analisadas quantitativamente em 10 campos de magnitude 1000x e em 6 animais por grupo, no mesmo microscópio. Foi feita análise histopatológica da ATM esquerda, que recebeu as induções por mBSA (v. intraarticular; 10 µg/articulação), bem como da ATM direita que recebeu injeção salina a 0,9% (v. intraarticular; 10 µl/articulação). 4.4.4. Imunoistoquímica para TNFα, IL1β e IL6
Imunoistoquímica para TNFα, IL1β e IL6 foi realizada pelo método de streptavidinabiotinaperoxidase em cortes de parafina. O tecido extraído e parafinizado foi cortado em secções de 4 μm de espessura e montados em lâminas para microscopia revestidas em poliLlisina. Os cortes foram desparafinizados com xileno, reidratados com gradações decrescentes de etanol e depois água. Após recuperação antigênica, com tampão de citrato (pH 6,0, tempo: 30 min.) a 75º C, a peroxidase endógena foi bloqueada uma vez (20 min) com 3% (v/v) de peróxido de hidrogênio e em seguida lavadas em PBS. As secções foram incubadas overnight (4º C) com os seguintes anticorpos primários feitos em coelho: antiTNFα, anti IL1β, de rato e com o anticorpo primário feito em cabra: anti IL6 de rato (Santacruz Biotechnology, Califórnia, Estados Unidos) na diluição 1:100 em PBS acrescido de soro diluente (Dako).
As lâminas foram lavadas em PBS e incubadas durante 30 min com os anticorpos biotinilados antiIgG de coelho ou de cabra (Santacruz Biotechnology, Califórnia, Estados Unidos), na diluição de 1:400 em soro diluente (Dako). Após lavagem, as lâminas foram incubadas durante 30 min com complexo ABC, um conjugado de avidinaperoxidase (Strep ABC complex, Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, USA), de acordo com as instruções do fabricante. A imunocoloração foi visualizada com o cromógeno 3, 3’diaminobenzadina (DAB) (DAKOEUA) com
peróxido de hidrogênio. Foi realizado a contracoloração com hematoxilina de Mayer, e em seguida os cortes foram desidratados em uma série graduada de álcool, diafanizados em xilol e cobertos com lamínula. Secções de controle negativo também foram realizadas simultaneamente, de acordo com o protocolo descrito, porém com o anticorpo primário substituído por soro diluente (Dako) (Gondim et al., 2012).
A análise imunoistoquímica consistiu da marcação positiva para TNFα, IL1β e IL6 determinada pela coloração marrom ao nível do citoplasma das células. Cada grupo foi composto por 6 animais. Os cortes foram avaliados por examinador que desconhecia os grupos experimentais. Escores de 04 foram dados de maneira semi quantitativa, de acordo com a marcação na camada de sinoviócitos, membrana sinovial e tecido cartilaginoso: 0 ausência de marcação; 1 discreta marcação; 2 fraca marcação; 3 moderada marcação; 4 intensa marcação.
4.4.5. Avaliação da migração de células para a cavidade articular (contagem de células) Para contagem de células, 20 μl do lavado articular foi coletado e diluído em 380 μl de solução de Turk. O número total de leucócitos foi determinado através de um hemocitômetro (câmara de Neubauer). O lavado articular coletado foi previamente descongelado, e em seguida, diluído em solução fosfato (pH 6,0) contendo brometo de hexadeciltrimetilamônio e centrifugado em 12,000 x g durante 2 min. (Gondim et al., 2012).