Elaine V. Camarinha Marcos Ana Carla Pereira Latini Fabiana Covolo de Souza Santana
Não é recente a ideia de que fatores genéticos humanos devam interferir com a susceptibilidade às doenças infecciosas e seus diversos fenótipos biológicos e clínicos. Doenças como tuberculose e hanseníase já eram relacionadas com fatores hereditários desde a Idade Média.
A descoberta do Mycobacterium leprae em 1873 suscitou o questionamento acerca da teoria da hereditariedade desta moléstia, que era defendida por importantes estudiosos do século XIX. Em 1897, durante a I Conferência Internacional sobre lepra em Berlim, contagionistas e anticontagionistas discutiram as teorias infecciosa e hereditária como se fossem excludentes. No entanto, Robert Koch, cientista contemporâneo de Hansen, ao formular seus postulados, criou um entrave para a comprovação científica da hanseníase como doença contagiosa. Apesar de ser uma das primeiras doenças a ter um agente etio- lógico microbiano descrito, a hanseníase não atende a estes postulados. Somaram-se a este fato as observações obtidas a partir de experimentos in anima nobile que sugeriam a existência de resistência natural para a doença, indicando que a infecção pelo bacilo não era suficiente para a ocorrência da doença. Assim, a descoberta do bacilo não foi suficien- te para derrubar a ideia da hereditariedade e, apesar de criar pontos de embate entre os entusiastas de cada uma destas teorias, acabou também por estabelecer pontos de conver- gência entre elas (revisto por Beiguelman, 2002)1. Com o decorrer do tempo, tornou-se
clara a ideia de que o M. leprae é necessário, porém, não suficiente, para causar a doença que, hoje, é compreendida como de caráter complexo, a saber, multigênica e multifatorial. Já em 1.937, Abraão Rotberg defendeu a existência de um componente genético controlando a resistência natural para a doença relacionado à resposta à reação de Mitsu- da, denominado Fator N de Rotberg1.
A partir da década de 1960, geneticistas deram início à investigação sistemática sobre a contribuição dos fatores genéticos humanos na susceptibilidade da hanseníase. Os primeiros estudos abordaram a agregação familial da doença, incluindo análises de segregação complexa e os estudos com gêmeos2,12.
As análises de segregação complexa em hanseníase confirmam a importância do componente genético e fazem referência à existência de um gene principal (major gene),
de maior importância, porém, não suficiente para determinar a susceptibilidade genética para a doença por si só, havendo a contribuição de outros genes4-12. No entanto, ainda não
há um consenso sobre o modo de herança, sendo que os modelos recessivos e codominan- tes já foram relatados para a doença.
Os estudos familiares mostram que há maior chance de adoecimento da forma multibacilar de acordo com a consanguinidade com um paciente desta mesma forma clí- nica. Isoladamente, esses resultados não são suficientes para a comprovação da existência de um componente genético para a doença, já que nesse tipo de desenho pode haver fato- res de confundimento entre genética e ambiente1.
Os estudos com gêmeos em hanseníase foram conduzidos na década de 60 e 70 e têm como base uma análise de concordância de fenótipos entre gêmeos monozigóticos e dizigóticos2,3. Estes estudos não contrariaram a hipótese de que os elementos dos pares
monozigóticos são mais propensos a manifestar a mesma forma da doença, corroborando com a ideia da participação de um componente genético no risco da doença e formas clínicas.
Os avanços do conhecimento na biologia molecular e na epidemiologia genética trouxeram consigo a possibilidade de identificação precisa dos genes e marcadores envol- vidos com a susceptibilidade para a hanseníase. Dessa forma, os estudos mais recentes têm sido amplamente dedicados à elucidação das bases moleculares da susceptibilidade para a doença.
Não menos importante do que para a hanseníase per se é a identificação dos com- ponentes genéticos envolvidos com outros fenótipos associados à doença, como formas clínicas e reações tipo I e tipo II.
Desenhos de Estudos em Epidemiologia Genética
Empregando-se marcadores moleculares, é possível identificar genes e variações dentro destes que estão implicadas com o risco para doenças. Diferentes abordagens podem ser utilizadas, resultando em resoluções distintas, e, de forma clássica, estas são complemen- tares e compõem uma sequência dentro do mapeamento de fatores de risco genéticos.
Estudos de ligação são conduzidos com pedigrees contendo indivíduos afetados e têm como objetivo localizar regiões cromossômicas envolvidas a partir da análise de cossegregação entre o locus da doença e marcadores de local conhecido. O resultado de um estudo de ligação é mais comumente expresso pelo dado de LOD score (significado de LOD). Regiões cromossômicas cujos marcadores têm resultados de LOD score maior que três apresentam evidências de ligação e devem albergar um loci de susceptibilidade. Tais estudos são poderosos no mapeamento de genes com efeitos moderados a intensos. No entanto, este desenho não tem poder de resolução capaz de implicar o gene responsável.
Os estudos de associação podem ser utilizados como desdobramento dos estudos de ligação, já que aumentam a resolução do mapeamento de fatores de risco genéticos. Estes apresentam alto poder de detecção de efeitos genéticos de moderado a fraco, sendo capazes de identificar com precisão o gene responsável pelo efeito detectado.
Os desenhos de associação podem ser baseados em amostragens familiares ou po- pulacionais. Estudos baseados em populações adotam mais comumente o desenho caso- controle, já os baseados em famílias são conduzidos a partir da análise de trios.
O teste de desequilíbrio ou distorção de transmissão (TDT) é empregado na aná- lise de associação baseada em famílias e compara os números de transmissões dos alelos do loci testado dos pais heterozigotos para o filho afetado. Se algum dos alelos é mais ou menos transmitido do que o esperado, pode-se concluir que este está associado com sus- ceptibilidade ou resistência para a doença, respectivamente. Neste tipo de análise, é pos- sível medir a significância estatística da associação do marcador com a doença. Porém, o teste não determina a magnitude desta associação. É uma estratégia eficaz em situações de alta heterogeneidade genética, penetrância diminuída e expressividade variável. De acor- do com o seu princípio, o TDT requer a composição de trios chamados informativos, for- mados por um ou mais filhos afetados e pais heterozigotos para o marcador a ser testado.
O desenho de associação caso-controle compara as frequências do marcador em estudo em indivíduos afetados e não afetados. Como resultado pode ser observado uma frequência aumentada de um determinado alelo entre os afetados caracterizando suscep- tibilidade, ou entre controles caracterizando resistência. Nesse caso, as análises emprega- das informam significância estatística e tamanho do efeito pela medida de odds ratio (OR). O genoma humano contém variações que são usadas como marcadores nos estu- dos genéticos. Uma destas variações são os microssatélites que são pequenas sequências repetidas no genoma [por exemplo, repetições CA (significado)], e já foram largamente utilizadas em estudos de ligação. Outra categoria de variações genômicas, amplamente empregada como marcadores, é a de polimorfismos de base única (SNPs – Single Nucleoti- de Polymorphisms), que são mudanças de um único nucleotídeo que ocorrem em uma fre- quência maior que 1% na população e estão abundantemente distribuídas pelo genoma. A importância desses marcadores para o mapeamento de fatores de risco genéticos para doenças pode ser observada pelo crescente número de SNPs, que vêm sendo associados às doenças complexas, como as infecciosas e as autoimunes. Outro tipo de variação, cujo uso na epidemiologia genética é mais recente, são os polimorfismos designados CNVs (Copy Number Variations). Estas são variações no número de cópias de grandes segmentos genô- micos, e podem ser constituídas de deleções, inserções ou duplicações.
As estratégias de estudo nessa área compreendem, ainda, a distribuição dos marca- dores a serem testados. Os estudos de varredura do genoma, denominados genome wide, investigam uma grande quantidade de marcadores moleculares distribuídos por todo o genoma. Esta abordagem é reconhecida como geradora de hipóteses, desde que não parta de nenhuma premissa acerca dos loci possivelmente envolvidos com a doença. O avanço tecnológico atual permite a genotipagem de SNPs em larga escala e, até mesmo, o sequen- ciamento de um genoma completo em curto tempo. Nesse cenário, estudos nominados GWAS (Genome Wide Association Studies) têm se tornado comum em epidemiologia ge- nética. Esses interrogam milhares de SNPs por todo o genoma em um grande número
de indivíduos, e, portanto, possuem grande poder para a detecção de novos marcadores genéticos associados com a doença em questão.
Alternativamente, há a abordagem de genes candidatos, que são aqueles cujos pro- dutos participam claramente da interação parasito-hospedeiro. Estes estudos, portanto, já partem de uma hipótese previamente constituída. Classicamente, estes genes são os en- volvidos com a resposta imune, como os das citocinas, que têm sido bastante explorados devido à atuação no controle da natureza, intensidade e duração da resposta do hospedei- ro contra o agente infeccioso.
Há que se considerar ainda a influência que algumas covariáveis exercem nos re- sultados destes estudos. Um dos efeitos mais discutidos é o da etnia, visto que dados de genes e/ou marcadores nem sempre são replicados em diferentes populações. Outra cova- riável que pode ter efeito de confundimento é a idade de manifestação da doença, de for- ma que o efeito que alguns genes exercem no risco depende da faixa etária dos indivíduos acometidos estudados.
Os tipos de estudos ora citados têm sido largamente empregados na investigação das atribuições da genética humana na hanseníase. A baixa variabilidade genética do baci- lo e a evolução redutiva que o tornou adaptado ao hospedeiro, somadas à exuberância dos fenótipos das formas clínicas da doença determinadas pela resposta imune do hospedeiro, têm tornado a hanseníase modelo para estudos de epidemiologia genética em doenças infecciosas. Por fim, a impossibilidade de cultivo do bacilo em laboratório e as dificulda- des em se alcançar um modelo experimental satisfatório para a doença tornam a genética humana uma importante ferramenta no estudo da sua fisiopatologia.
Baseados nos dados da literatura, alguns autores propõem um modelo de dois es- tágios para a susceptibilidade genética para a hanseníase. Neste, um primeiro grupo de genes seria determinante da manifestação ou não da doença (hanseníase per se) após a in- fecção pelo bacilo, e um segundo grupo determinaria a manifestação das formas clínicas13.
Em síntese, os diversos desenhos de estudo são complementares e, aliados à in- terpretação e análise criteriosa de seus resultados, constroem o conhecimento acerca da susceptibilidade genética para a doença. A seguir, compilamos dados sobre os principais marcadores genéticos já descritos para a doença per se, formas clínicas e reações.
Genética Molecular da Hanseníase
Estudos de ligação e seus desdobramentos
O primeiro estudo de varredura genômica de ligação em hanseníase foi realizado com a população indiana e evidenciou um pico de ligação na região cromossômica 10p13 para hanseníase per se14. Posteriormente, estudo com a população vietnamita mostrou
que, devido a um viés de amostragem no estudo indiano, este pico de ligação estava na verdade implicado com a forma clínica paucibacilar15. O gene localizado nesta região já
sinônimos, isto é, que geram alteração na sequência de aminoácidos na proteína, foram associados com hanseníase paucibacilar16. O alelo A, que codifica para o aminoácido se-
rina, do SNP não-sinônimo G396S, foi associado com resistência para hanseníase per se e para a forma multibacilar em um estudo familiar do Vietnam (580 famílias). De forma concordante, o alelo G deste SNP, que codifica para glicina, foi associado com susceptibili- dade para hanseníase per se e forma multibacilar na população brasileira. No entanto, dois outros SNPs não-sinônimos, que não eram loci polimórficos na população do Vietnam, também contribuem para o efeito do G396S na população brasileira17. Na população chi-
nesa, outros dois SNPs neste gene foram associados com hanseníase paucibacilar18. Assim,
ainda que os marcadores não sejam os mesmos, o que deve ser explicado pela diversidade étnica entre estas populações, a participação do gene MRC1 no risco da doença e de suas formas clínicas tem sido confirmada pelos diferentes estudos.
O segundo grupo a conduzir este tipo de estudo de ligação o fez com a população do Vietnam e identificou um pico na região cromossômica 6q25-q2615. Um estudo de
associação, incluindo 43 genes desta região, localizou SNPs em uma região compartilhada pelos genes PARK2 e PACRG (PARK2 corregulado) associados com hanseníase nas po- pulações vietnamita e brasileira19. Em um estudo de replicação, associação modesta para
apenas um destes polimorfismos na população indiana foi relatada20. Posteriormente, foi
demonstrado que o efeito de alguns destes marcadores em vietnamitas e indianos é de- pendente da idade de manifestação da doença, e que a manifestação mais tardia na popu- lação indiana, bem como diferenças genéticas entre as duas populações devem explicar esses dados controversos21.
O gene PARK2 codifica uma proteína denominada parkina, uma E3-ubiquitina ligase envolvida com a sinalização para a degradação de proteínas no complexo proteossô- mico. Mutações neste gene estão associadas à doença de Parkinson. De maior importância para doenças infeciosas, a parkina está relacionada à autofagia e à modulação da expressão das citocinas IL-6 e CCL2 em células de Schwann e macrófagos estimulados com M. le- prae22,23. Polimorfismos no PARK2 associados com hanseníase na população do Vietnam
e da Índia apresentaram influência sobre este efeito na produção de citocinas, melhor elucidando a associação deste gene com a doença21,23.
Interessante relatar aqui que um estudo comparando frequências dos alelos dos dois polimorfismos de PARK2 e PACRG, associados com hanseníase no estudo com a população do Vietnam, em três ilhas da Croácia, sendo uma delas um antigo local de quarentena para pacientes com hanseníase, comprovou que a doença levou à seleção dos alelos de proteção na população desta ilha24.
Estes estudos de ligação têm recorrentemente relatado picos de ligação na região cromossômica 6p2115,25. Esta região alberga os genes do complexo HLA (Human Leukocyte
Antigen), cujas associações com hanseníase e suas formas também são recorrentes na literatura.
Os genes do HLA de classe III, TNF e LTA, têm sido associados à hanseníase per se e os dados replicados em diversas populações. O polimorfismo do gene TNF, que co-
difica a citocina pro-inflamatória fator de necrose tumoral, mais estudado é o da região promotora do gene denominado -308A>G. Apesar de a associação deste polimorfismo com hanseníase e suas formas clínicas se repetir em diferentes estudos, o alelo e o senti- do da associação (isto é, resistência ou susceptibilidade) são controversos. O alelo -308A tem sido associado com resistência para hanseníase per se na população brasileira, mas com susceptibilidade em outras populações26-31. No entanto, um estudo de meta-análise
reafirmou o papel de proteção conferido pelo alelo A deste polimorfismo para hanse- níase per se, e este efeito foi mais pronunciado na população brasileira32. Alguns estudos
que exploraram a região interrogando maior número de SNPs confirmam a associação de marcadores neste gene com a doença33,34.
O gene LTA, que codifica para a linfotoxina alfa (previamente chamada de TNF beta), está muito próximo ao gene TNF. Na população brasileira, um haplótipo composto pelos SNPs LTA+252 e TNF-308 foi associado com hanseníase per se9. Um marcador de
microssatélite no gene LTA foi associado com a doença na população do Malaui35. Em des-
dobramento do estudo de ligação conduzido no Vietnam, Alcais et al. (2007) encontraram que a associação do marcador LTA+80, presente na população vietnamita, era dependente da idade de manifestação da doença. Em populações com idade de manifestação mais tardia, como Índia e Brasil, o efeito não era detectado e, em análise estratificando a po- pulação por idade, os autores comprovaram esta dependência36. Esse estudo exemplifica
a importância de se considerar nas análises os diversos fatores implicados no risco de doenças complexas.
Os estudos de ligação relatam ainda picos em regiões do cromossomo 20 (20p12 e 20p13)15,25,37. No entanto, nenhum estudo de mapeamento fino na região já foi publicado
com a finalidade de identificar os genes responsáveis por esta ligação.
Na população brasileira, um pico de ligação na banda cromossômica 17q22 tam- bém foi detectado38. Importante ressaltar que vários genes candidatos estão localizados
nessa região do cromossomo 17, como NOS2A, genes de quimiocinas e de fatores de transcrição. No entanto, nenhum destes já foi associado com a doença.
GWAS e seus desdobramentos
Um GWAS em hanseníase, feito com a população chinesa e publicado em 2009, encontrou sinais de associação para sete genes, a saber: CCDC122, LACC1 (C13orf31), NOD2, TNFSF15, HLA-DR, RIPK2 e LRRK2 (este último associado à forma clínica mul- tibacilar)39. A maioria destes genes está relacionada com vias da imunidade inata. Logo
após a publicação destes dados, um estudo de replicação com as populações da África e Índia detectou associação apenas para os marcadores nos genes CCDC122 e LACC140. Na
população do Vietnam, apenas LRRK2 e TNFSF15 não tiveram as associações replicadas41.
Dentre os genes supracitados, o NOD2, que codifica um receptor intracelular que reconhece componentes da parede micobacteriana tendo papel importante na resposta
imune inata, tem sido bastante explorado. Na população do Nepal, 32 SNPs foram inves- tigados nesse gene e nos seus arredores, sendo encontrados marcadores associados com a doença per se e estados reacionais42.
Uma expansão do GWAS de 2009 relatou ainda a associação de mais dois genes com hanseníase: RAB32 e IL23R 43. O gene RAB32 está envolvido com autofagia, e esta
associação deve resultar em incremento nos conhecimentos sobre o envolvimento destes processos com a doença. O gene IL23R codifica um receptor da IL-23 e, portanto, faz parte da via IL-12/IL-23/interferon-gama, de grande importância para a resposta imune contra micobactérias.
As publicações destes estudos evidenciaram uma similaridade entre os fatores de risco genéticos para hanseníase e doença de Crohn, levando à retomada da discussão sobre a infecção micobacteriana como causa desta doença autoimune44,45. Dentre estes
genes, TNFSF15, NOD2, HLA-DR, LACC1, LRRK2 e IL23R já foram associados com as duas doenças46,47. Além disso, os estudos de ligação abordando estas doenças têm sugerido
picos próximos em região do braço longo do cromossomo 13 15,48.
Genes candidatos
TLRs (Toll Like Receptors)
Toll-like, assim como NOD2, compõem uma classe de receptores denominada re- ceptores de reconhecimento de padrões (PRRs), que reconhecem diferentes moléculas de patógenos já nos primeiros estágios da infecção, disparando eventos inflamatórios e da imunidade inata. Assim, variações nesses genes são fortes candidatas à susceptibilidade para doenças infecciosas, desde que possam afetar esse reconhecimento, bem como alte- rar a entrada do patógeno na célula.
Estudos genéticos e imunológicos têm apontado para a relevância do polimorfis- mo I602S (T1805G) no gene TLR1. Este loci parece influenciar a produção de citocinas pro-inflamatórias em PBMCs estimulados com M. leprae, bem como a expressão do re- ceptor na superfície celular49,50. O alelo 602S (1805G) foi associado com resistência para
hanseníase50,51. Esse dado foi replicado por um estudo de associação com genotipagem
em larga escala, que investigou 2.092 genes, de forma bastante significativa40. Este ale-
lo foi associado também com a ocorrência de estados reacionais com efeito de proteção para reação tipo I49. Autores têm relatado que a diferença substancial na frequência destes
alelos de TLR1 entre populações distintas pode gerar alguns dados conflitantes quanto à associação destes com hanseníase40,43.
Outro polimorfismo não sinônimo no gene TLR1, denominado N248S, foi asso- ciado com hanseníase per se e com eritema nodoso hansênico na população de Bangla- desh52. Estudos no Brasil mostram que esse polimorfismo também está associado com
a doença per se, sendo informativo do envolvimento desse gene com a doença na nossa população (dados ainda não publicados).
Na população da Etiópia, polimorfismos no gene TLR2 foram associados com rea- ção tipo I, e do TLR4 com hanseníase per se 51,53.
IL10
A IL-10 é uma citocina anti-inflamatória que está presente em altos níveis nos pa- cientes multibacilares. Uma baixa correlação TNF/IL-10 está associada com a progressão da doença54. O gene IL10, que codifica esta interleucina, está localizado no região cromos-
sômica 1q31-q32, próximo a um pico de ligação para hanseníase detectado na população do Vietnam15. SNPs na região promotora do gene IL10 têm sido alvos de estudos de as-