Yarıiletkenlerin elektronik özellikleri

A planificação do protocolo experimental destinado à amplificação dos fragmentos específicos a partir de amostras clínicas foi realizada tendo em conta as temperaturas de hibridação optimizadas com base na utilização de amostras de referência (Tabela 3.4, secção 3.3.3). Esta etapa surgiu na sequência da análise dos resultados apresentados na secção anterior. Assim, após terem sido amplificados os fragmentos universais internos para todas as regiões do genoma das diferentes estirpes de HIV-1 presentes nas amostras clínicas em estudo, estes foram diluídos na razão de 1:1000 (relativamente à sua concentração original nas reacções do segundo passo de amplificação contendo fragmentos universais internos gerados por nested-PCR), sendo que 1µl foi usado como matriz para as reacções de amplificação específica.

Tal como até agora descrito, alíquotas de todas as reacções de amplificação específicas foram analisadas por electroforese em gel de agarose de forma a verificar a amplificação específica desejada e/ou a ocorrência de amplificações inespecíficas. Os resultados obtidos revelaram, de uma forma geral, que os primers específicos originavam amplificações indiscriminadas para todas a regiões excepto para a região de Gag. Para esta região foi possível obter um perfil de amplificação discriminatório para 39 das 50 amostras (78%), 5 amostras revelaram um perfil de amplificação duplo (amplificação heteróloga a partir de dois dos primers específicos utilizados) e as restantes apresentavam amplificações indiscriminadas como consequência da utilização dos 3 primers específicos utilizados. Para as restantes regiões analisadas, e a partir de um conjunto de amostras biológicas seleccionadas aleatoriamente de entre o total em estudo, procedeu-se a uma nova optimização das reacções de amplificação específica. Para tal foram efectuados incrementos sucessivos (1°C) na temperatura de hibridação referente a cada um dos protocolos de PCR de modo a que o resultado permitisse uma situação de compromisso entre o número máximo de amplificações específicas e o número mínimo de resultados nulos, isto é, amplificações limitadas pelas elevadas temperaturas de hibridação utilizadas. Face aos resultados obtidos foi possível definir um novo conjunto de temperaturas de hibridação para cada região analisada. As temperaturas estão representadas na Tabela 3.5.

Tese de Mestrado – Ferdinando De Freitas 79

Tabela 3.5 – Temperaturas de hibridação utilizadas na amplificação por PCR de sequências virais específicas, re-optimizadas com base nos resultados de amplificação obtidos para amostras clínicas. Estão ainda representados os tamanhos dos fragmentos esperados de acordo com o primers subtipo/CRF específicos utilizados e respectiva região do genoma.

Região alvo Primer específico Tamanho (≈pb) Temperatura (°C)

Gag B/_02/G 150 69 Pr B/G 150 63 Rt B/_02/G 130 61 Rev B/G 170 63 B-2/B-3 400/400 66 Gp120 _02-2/_02-3 350/360 66 G-2/G-3 450/460 66 Gp41 B 100 68 G 100 68

A análise dos produtos amplificados referentes às regiões Pr, RT, Rev, Gp120 e Gp41 revelou para a maioria das amostras, perfis de amplificação específicos exclusivamente para um dos primers de amplificação específica por cada região (primer específico para o subtipo B, G ou CRF02_AG quando aplicável, ver 3.3, secção 3.2). Para a região Pr, 36 das 50 amostras (72%) apresentaram um resultado de amplificação exclusiva para um dos primers (subtipo B ou G), sendo que as restantes apresentaram um perfil duplo de amplificação, apesar de se terem verificado, em algumas situações, variações significativas na quantidade de produto amplificado. A Figura 3.8 representa um perfil de amplificação característico dos ensaios realizados para esta região.

Tese de Mestrado – Ferdinando De Freitas 80

Figura 3.8 – Amplificação dos fragmentos específicos referentes a um conjunto de amostras clínicas para a região codificante de parte da protease viral. Estes ensaios foram realizados à temperatura de hibridação de 63°C, neste conjunto em particular apenas uma amostra (983) apresenta um perfil duplo de amplificação. N - Controlo negativo; M - marcador de massa molecular.

Para a região RT os resultados das amplificações específicas revelaram que um conjunto de 40 amostras (80%) foi possível obter fragmentos visíveis apenas para um dos primers específicos utilizados, 7 amostras com resultado duplo e para as restantes 3 amostras não foi detectado qualquer produto amplificado independente do primer específico. Para a região Rev, 40 amostras (80%) apresentaram um perfil de amplificação discriminatório, 6 amostras apresentaram um perfil de amplificação duplo, e para as restantes amostras não foi observado em gel de agarose qualquer produto de amplificação para qualquer um dos primers específicos. Para a região Gp120, a análise dos produtos resultantes de amplificações específica efectuadas com base na utilização do segundo conjunto de primers desenhados revelou, para 34 das amostras clínicas em estudo (68%), um perfil de amplificação exclusivo com um único primer de amplificação específica, 7 apresentavam um perfil de amplificação duplo, 3 apresentavam um perfil de amplificação indiscriminado originado pela amplificação a partir de todos os primers específicos (resultado triplo), enquanto que, 5 apresentavam um perfil inespecífico, traduzido pela presença em simultâneo de vários amplicões de dimensões não esperadas. Finalmente, para uma única amostra, não foram detectados quaisquer produtos de amplificação. Tendo em conta estes resultados, optámos por reanalisar esta mesma região do genoma viral, testando a capacidade que o terceiro conjunto de primers específicos teria em dar origem aos amplicões desejados. A análise efectuada demonstrou que das 50 amostras analisadas, 36 permitiram a verificação de amplificações correspondentes ao fragmento de tamanho aproximadamente ao esperado

B G B G B G B G B G B G B G B G B G M

Tese de Mestrado – Ferdinando De Freitas 81 exclusivas com um dos primers, 7 apresentavam amplificação dupla ou tripla, 5 apresentavam produtos amplificados inespecíficos (fragmentos de dimensões não esperadas), enquanto que para duas amostras não foi detectado qualquer produto de amplificação. No entanto, para todas as combinações foram ainda detectadas amplificações inespecíficas, reveladas pela presença de fragmentos de DNA de dimensões diferentes às esperadas para esta região (Tabela 3.4). Para a região Gp41 foram identificadas 39 amostras (78%) caracterizadas pela presença de um fragmento específico e exclusivo para apenas um dos primers utilizados (específico para o subtipo B ou G), duas amostras apresentaram um resultado duplo e para as restantes não foi detectado produto amplificado. Os resultados das amplificações específicas para cada região e amostra estão resumidos na Tabela 3.6.

Tabela 3.6 – Resumo dos resultados obtidos para as amplificações específicas a partir das amostras clínicas ao longo das regiões analisadas. Os dados estão representados pela frequência de amplificação específica (apenas para um dos primers subtipo/CRF específico) e respectiva percentagem sobre o total de amostras analisadas. Estão também representados para cada região a frequência de reacções inespecíficas (amplificação por dois ou três primers subtipo/CRF específicos) e reacções para as quais não foram detectados produtos amplificados.

Amplificações

Região Específicas (%) Inespecíficas Não detectadas Total

Gag 39 78 11 0 50 Pr 36 72 14 0 50 Rt 40 86 7 3 50 Rev 40 80 6 4 50 Gp120-2 34 68 15 1 50 Gp120-3 36 72 12 2 50 Gp41 39 78 2 9 50

Tese de Mestrado – Ferdinando De Freitas 82

3.4.3 Utilização do PCR em tempo-real para amplificação específica de sequências