3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.2. Yöntem
3.2.3. Yapay Tohumlama Uygulamaları
Tohumlama gününün erken saatlerinde her genotipin damızlık erkek arı bakıcı kolonisindeki boyalı erkek arılar, 4X10X15 cm ölçülerindeki bir kafese toplanmıştır. Ekipman hazırlanıncaya kadar bu kafesler kovan içinde tutulmuştur.
3.2.3.2. Ekipmanın Hazırlanması
Bu çalışmada ana arıların yapay tohumlanmasında Schley marka yapay tohumlama seti kullanılmıştır (Şekil 3.2). Tohumlamanın yapıldığı laboratuarın öncelikle temiz olmasına dikkat edilmiştir. Ekipman hazırlanırken aletin bulunduğu masa ve aletin tüm metal aksamları % 96’lık etil alkol ile silinmiştir.
Şekil 3.2. Yapay tohumlama ekipmanı
3.2.3.3. Mikroşırınganın Hazırlanması
Mikroşırınga parçaları takıldıktan sonra şırıngaya fizyolojik sıvı (NaCl: 0,85 gr; damıtık su:100 ml) çekilmiştir. Mikroşırınga, tampon ve sıvı piston görevi yapan fizyolojik solüsyon ile hiç hava kalmayacak şekilde doldurulduktan sonra piston kolu, gövde içindeki silindire sokularak vidalanmıştır. Ardından silikon hortum, mikroşırınga ucu ve kapağı takılarak kullanıma hazır hale getirilmiştir. Cam uçtan fizyolojik sıvının bir kısmı semen alımı için boşaltılmış ve mikroşırınga yapay tohumlama aletine yerleştirilerek, mikroşırınga ucu mikroskop görüntü alanında (10-15X) ayarlanmıştır.
3.2.3.4. Erkek Arıların Eversiyonu ve Semen Toplama
Erkek arı damızlık kolonilerinde bir kafes içinde depolanan erkek arılar yapay tohumlama odasına alınmıştır. Erkek arılar kafesten tek tek alınarak eversiyon için fiziksel olarak uyarılmıştır. Bunun için; erkek arı bir elin baş ve işaret parmağı ile alt tarafı yukarıda olacak şekilde göğüs bölgesinden tutulmuş, baş ve göğsün ön kısmına baş ve işaret parmağı ile baskı uygulanmıştır. Semen çıkmadığı zaman semen boşaltılana kadar yanlardan baskı yapılmıştır. Başarılı bir eversiyon sonunda krem renkli semen ve beyaz renkli mukus penis üzerinde görülmüştür. Semen mukus üzerinde ince bir tabaka halinde dağıldığından, vakit geçirmeden mikroşırıngaya çekilmiştir (Mackensen ve Tucker, 1970).
Ejekülasyon yapmış erkek arı sol elin işaret ve baş parmağı ile göğsünden tutularak mikro şırınga ucuna yaklaştırılmıştır. Mikroşırınga ucunda semenin solüsyon ile karışmasını önlemek için biraz hava boşluğu bırakıldıktan sonra, mikroşırınganın ucu semene dokundurularak yavaşça çekilmiştir. Bir erkek arıdan semenin tamamı toplandıktan sonra bir sonraki erkek arının semeni çekilinceye kadar mikroşırınga ucunda hava boşluğu oluşturulmuştur. Bir sonraki erkek arının semeni mikro şırınga ucuna çekileceği zaman hava boşluğu atılmış ve penis üzerindeki semen aynı yöntemle alınmıştır. Mikro şırıngada 8 µl semen oluncaya kadar erkek arılardan semen alımına devam edilmiştir. En son olarak semenin kurumaması için mikroşırınga ucuna biraz solüsyon çekilmiştir.
3.2.3.5. Ana Arının İğne Odasının Açılması ve Enjeksiyon
Çiftleştirme kutusundan alınan 7–10 gün yaştaki ana arı, ana arı kafesi ile tohumlama odasına getirilmiştir. Daha sonra gerileme tüpüne alınan ana arı kapalı uca ilerlerken ana arı tutucusunun tutucu borusu gerileme tüpü ile birleştirilerek ana arının karın segmentlerinin tutucu borudan çıkması sağlanmıştır. Ana arının bacaklarının içerde kalmasına özen gösterilmiştir. Ana arı doğru konumda yerleştirildikten sonra CO2
tüpünün vanası açılmıştır. CO2 ayarı yapıldıktan sonra CO2 gazını ileten borunun ucu ana arı tutucusundaki gaz yoluna sokulmuştur.
Ana arı hareketsizleşince mikroskop altında önce iğne kancasının deliğine iğne geçirilmiş bu esnada da karın kancası ana arının ventral kısmına tutturularak hafifçe ters yöne doğru çekilmiştir. Mikroskop altındaki görüntünün simetrik olmasına ve dokuların fazla gerilmemesine özen gösterilmiştir. Bu işlemden sonra mikro şırınganın ucu vagina girişinin biraz üzerine ayarlanmıştır. Mikroşırınganın ucu ½ mm kadar vaginaya sokulduktan sonra hafifçe sola doğru hareket ettirilerek, çok az da geri çekilerek 1.5 mm kadar ileri itilmiştir. Bazı ana arılarda ½ mm ilerledikten sonra hafif sol yapılarak 1.5 mm ilerledikten sonra çok rahat olarak ana yumurta kanalına ulaşılmıştır. Daha sonra 8 µl semen yumurta kanallarına enjekte edilmiştir.
Mikroşırınga geri çekilerek ana arı kancalardan kurtarılmıştır. Narkoz kapatıldıktan sonra ana arı sıkıştırılmadan göğsünden tutulmuş ve sağ kanadının 1/3’ü kesilerek göğsü boyanmıştır. Kafesine geri konan ana arı ayıldıktan sonra çiftleştirme kutusuna geri verilmiş, yaklaşık yarım saat sonra da ana arının kafesi açılmıştır. Düzenli olarak her gün ana arı kontrolleri yapılmıştır.
Bu çalışmada EXE, EXK, KXK, KXE, İXE ve İXİ genotip grupları oluşturulmuştur.. Nisan-Mayıs ayları boyunca tohumlamalar sürmüş sonuçta EXE, EXK, KXK, KXE, İXE genotip gruplarından 5’er adet İXİ genotipinden ise 3 adet ana arı elde edilmiştir. Çizelge 3.2’de deneme planı ve süresi verilmiştir.
Çizelge 3.2. Deneme planı ve süresi Tarih Uygulama
Haziran 2004 10 adet Kafkas ana arısı satın alınmıştır.
Eylül-Ekim 2004 Ege ve Kafkas damızlık kolonilerin sonbahar bakım ve beslemesi yapılarak, kışlamaya sokulmuştur.
Şubat–Mart 2005 Damızlık kolonilerin ilkbahar bakım ve beslemeleri yapılmıştır.
Nisan-2005 İsrail’den İtalyan arısı (6 adet) getirilerek, kolonilere kabul ettirilmiştir.
Nisan-Mayıs 2005 Ana arılar yetiştirilerek tohumlama uygulamalarına başlanmıştır.
Temmuz-Ağustos 2005 Yapay Tohumlama uygulamalarına devam edilmiştir. Eylül-Ekim 2005 Damızlık kolonilerin sonbahar bakımları yapılarak kışlamaya
sokulmuştur.
Şubat–2006 Damızlık kolonilerin ilkbahar bakım ve beslemeleri yapılmıştır.
Nisan-Mayıs 2006 Her hafta Kafkas, Ege, İtalyan damızlık kolonilerinden (10 adet larva) ana arılar yetiştirilerek haftada dört gün tohumlama çalışmaları sürdürülmüştür.
Haziran 2006 Tohumlama sonrası yumurtlayan ana arılar eşit güçteki kolonilere kabul ettirilmişlerdir.
Temmuz-Ağustos 2006 Yapay tohumlanmış ana arılı tüm kolonilere bakım besleme uygulanmıştır.
Eylül-Kasım 2006 Tüm koloniler eşitlenerek kışlamaya sokulmuştur. Şubat-2007 Kışlama sonrası tüm deneme kolonilerinin arılı çerçeve
sayıları belirlenerek bakım ve besleme yapılmıştır. Mart-Eylül 2007 21 gün ara ile yavru alanı, arılı çerçeve sayıları ve uçuş
etkinlikleri belirlenmiştir. Ayrıca kolonilerin bal verimi ve bazı davranış özellikleri saptanmıştır.