Yapılacak Yeni Araştırmalara İlişkin Öneriler

contra E. hirae

Para verificação da interferência das peptonas na atividade antimicrobiana da gramicidina foram preparados quatro diferentes meios: antibiótico no3 sem peptona (extrato de carne – 1,5g; extrato de levedura – 1,5; glicose – 1,0 g; cloreto de sódio – 3,5 g; fosfato de potássio monobásico – 3,68 g e fosfato de potássio dibásico – 1,32 g); lactalbumina; triptona e casamino, cuja composição foi a mesma do antibiótico no3 sem peptona de carne acrescido de 5,0 g de peptona (lactalbumina, triptona e casamino, respectivamente).

Soluções de gramicidina a 0,01; 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,32; 0,64; 1,28 e 2,56 µg/ml, em álcool etílico a 95%, foram preparadas e adicionadas (100 µl), em tubos de ensaio contendo 9,0 ml de meio inoculado. Quatro séries de tubos foram

preparadas, sendo uma para cada meio de cultura. Os tubos foram submetidos às condições de ensaio descritas em A de 5.10.

As leituras de absorvância foram transformadas em porcentagem de inibição para construção das curvas concentração-resposta.

5.14 Cálculos estatísticos

Para realização dos cálculos estatísticos foram utilizados os programas MINITAB® Release 14.1 Statistical software, GraphPad Prism® versão 4.00 e Microsoft Office Excel® 2003.

A ANOVA fator duplo foi utilizada para avaliar os resultados obtidos com as diferentes condições testadas no método de difusão em ágar, como a seleção do microrganismo teste, os diferentes inóculos ensaiados, a variação do tempo de pré- difusão, o emprego de tampões, como diluente, com diferentes concentrações de polissorbato 80. A ANOVA fator único foi empregada para determinação do limite de detecção, para os métodos de difusão em ágar e turbidimétrico, através da comparação das respostas (diâmetro do halo de inibição ou absorvância) obtidas com as diferentes concentrações de antimicrobiano. A ANOVA fator único também foi utilizada para verificar se a gramicidina apresentou atividade antimicrobiana nas condições farmacopéicas testadas para o método turbidimétrico. Quando a diferença entre os tratamentos testados por ANOVA fator duplo ou único foi significativa, empregou-se o Teste de Boniferroni para identificar os tratamentos diferentes. Para se aplicar a ANOVA assume-se que as variáveis são normalmente distribuídas e que a variância entre os grupos é homogênea (Burke, 2005). Para isso foram empregados os testes de Ryan Joiner e o de Bartlet para comprovação respectivamente da normalidade e da homoscedasticidade dos dados.

A análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados ordinais foi utilizada para verificar se as diferentes faixas de concentração empregadas, tanto no método de difusão em ágar quanto no turbidimétrico, produziram um efeito graduado proporcional à concentração do antibiótico. Para utilização do método dos mínimos quadrados ordinais foi necessário comprovar as premissas de homoscedasticidade, independência e normalidade dos resíduos. Assim, a homoscedasticidade foi

verificada pelo teste de Levene modificado por Brown e Forsythe e pelo gráfico de valor ajustado pelo modelo versus resíduos, cuja distribuição dos pontos deve ser a mais aleatória possível; a normalidade dos resíduos foi verificada pelo teste de Ryan-Joiner e a independência foi verificada por meio do teste de Durbin-Watson. Além disso, a ANOVA foi utilizada para avaliação da significância da regressão e do desvio de linearidade (MONTGOMERY et al, 2001; SOUZA e JUNQUEIRA, 2005).

No método turbidimétrico, quando se estudou a relação da resposta (absorvância ou porcentagem de inibição) com o logaritmo de uma ampla faixa de concentração empregou-se o modelo sigmoidal. No entanto, quando a relação foi com a concentração do antibiótico o modelo polinomial quadrático foi utilizado. Este também foi empregado para análise dos dados em que diferentes condições foram testadas para o aumento do diâmetro dos halos de inibição nos experimentos com placas.

A comparação entre as curvas obtidas em diferentes condições (dias, meio de cultura com diferentes composições e valores de pH, diferentes concentrações de inóculo, diluentes empregados no preparo das soluções de gramicidina, tempo de incubação e idade da cepa do microrganismo teste) foi realizada por meio da análise de covariância (ANCOVA). No entanto, para emprego deste teste estatístico foi necessário comprovar a homoscedasticidade. Assim, utilizou-se o teste de Bartlet, cuja premissa de normalidade dos dados foi verificada pelo teste de Ryan-Joiner (SNEDECOR e COCHRAN, 1996).

O cálculo de potência relativa e intervalo de confiança a 95% foi realizado para o método de difusão em placas empregando as equações do ANEXO A e para o turbidimétrico o ANEXO B. O intervalo de confiança a 95% para a potência foi utilizado para avaliação da precisão do ensaio. Devido à variação na medida do diâmetro do halo de inibição em decorrência de serem pequenos, foi considerada como precisão adequada uma variação máxima de 10% no intervalo de confiança. Tal critério também foi utilizado para o método turbidimétrico.

A precisão dos métodos desenvolvidos foi avaliada pelo cálculo do desvio padrão relativo. A precisão dos diferentes delineamentos bem como a precisão entre os diferentes métodos foi comparada por meio do teste de F (bilateral).

A veracidade (presença de erros sistemáticos) foi feita por análise de regressão linear entre os resultados de potência obtidos experimentalmente e os valores teóricos.

Para cálculo do β-intervalo de tolerância utilizaram-se as fórmulas descritas nos trabalhos de Hubert, et al (2007 a- b), Rozet, et al (2007); Boyer e colaboradores (1995).

Valores aberrantes (outliers) foram identificados pelo cálculo do resíduo

studentizado deletado, cujo valor maior que três foi considerado como um outlier

(MONTGOMERY et al, 2001). No caso de ensaios com placas por se tratar de um delineamento blocos ao acaso, quando um outlier foi encontrado, o valor foi retirado e não reposto. Para o método turbidimétrico, cujo delineamento é completamente casualizado, os valores aberrantes foram substituídos pela média das réplicas de mesma concentração. Tal procedimento faz com que o grau de liberdade do resíduo da análise de variância seja subtraído de uma unidade para cada valor reposto (THE UNITED..., 2008). Considerou-se que no máximo 2/9 dos dados poderiam ser eliminados (SOUZA e JUNQUEIRA, 2005).

Para todos os ensaios estatísticos utilizados, empregou-se um nível de confiança de 95% (α = 0,05), exceto no caso do teste de Ryan-Joiner, cujo nível de confiança foi de 90% (α = 0,1).

6 RESULTADOS E DISCUSSÃO