Yapılacak AraĢtırmalara Yönelik Öneriler

A condução de pesquisas dentro dessa linha e concepção justifica-se devido à elevada incidência de neoplasias mamárias malignas em cadelas (GORMAN & DOBSON, 1995; KITCHELL, 1995; OGILVIE & MOORE, 1995; MORRISON, 1998; PEREZ-ALENZA, 1998; ZUCCARI, 2001). Além disto, os tumores que acometem os cães são modelos apropriados para o estudo da biologia do câncer, assim como para testar novos agentes terapêuticos no tratamento das neoplasias, pois os animais de estimação têm tumores com comportamento semelhante aos tumores que acometem o homem (MacEWEN, 1990; MOTTOLLESSE et al., 1994; PELETEIRO, 1994; ZUCCARI, 2001).

De maneira semelhante ao constatado por SONNENSCHEIN et al. (1991) e RUTTEMAN et al. (2001), as neoplasias mamárias, neste estudo, prevaleceram em pacientes com sete a 12 anos de idade. O estadiamento dos tumores mamários realizado de acordo com o sistema TNM (Tumor/ Nódulo ou Linfonodo/ Metástase) proposto pela Organização Mundial da Saúde (MOULTON, 1990) foi fundamental para avaliar, neste ensaio, a possibilidade de progressão do tumor para os principais locais de ocorrência de metástases, como os linfonodos e os pulmões (KITCHELL, 1995).

Dados em relação ao histórico das pacientes, como tipo de alimentação, número de gestações, freqüência da administração de anticoncepcionais, ocorrência de pseudogestações e realização da ovariossalpingohisterectomia, foram levantados nos grupos dos adenomas, carcinomas com prognóstico bom e carcinomas com prognóstico ruim. Futuramente, com o aumento do número de

casos, estes dados serão analisados e correlacionados com a expressão da ciclooxigenase-2 nas neoplasias mamárias de cadelas.

Os resultados encontrados, no presente experimento, evidenciam a importância do estudo de marcadores celulares nas neoplasias mamárias pela técnica de imunoistoquímica, semelhante ao relatado por ZUCCARI (2001), pois foi possível determinar a presença, bem como quantificar a expressão da enzima COX-2; que normalmente só é encontrada em resposta a estímulos inflamatórios (SOUZA et al., 2000). A utilização da técnica da estreptoavidina-biotina- peroxidase, bem como a recuperação antigênica em banho-maria, juntamente com a diluição do anticorpo monoclonal (clone CX-294, M3617, Dako) na proporção de 1:50 foi adequada para realizar a imunomarcação das células neoplásicas. A marcação positiva foi identificada pela coloração marrom - acastanhada granular citoplasmática das células neoplásicas. Além disto, foi observado variação na intensidade de coloração, como reportado por DORÉ et al. (2003) e HELLER et al. (2005).

A técnica de imunoistoquímica tem grande importância na pesquisa diagnóstica das neoplasias, em virtude da especificidade deste exame (ZUCCARI, 1999). Esta técnica proporciona dados menos subjetivos na graduação histopatológica das neoplasias mamárias, e, com estudos prospectivos é possível correlacioná-las como prognóstico e sobrevida dos animais.

O exame histopatológico é o método de eleição para identificar as características de uma neoplasia (LIMA & MARTINS, 1992; MISDORP et al., 1999; MOTA & OLIVEIRA, 1999). Com relação à classificação histopatológica das neoplasias mamárias adotou-se a descrita por MISDORP et al. (1999). Houve

correlação significativa (P<0,05) da imunorreatividade para a COX-2 em relação ao prognóstico das neoplasias mamárias, levando-se em consideração a classificação e as características histopatológicas desta afecção.

A expressão de COX-2 foi superior nas neoplasias malignas em relação às benignas; além disto, a intensidade de imunorreatividade também foi maior nas lesões neoplásicas malignas, semelhante ao encontrado por DORÉ et al. (2003).

A expressão da COX-2 tem relação com o prognóstico nos carcinomas mamários de mulheres (COSTA et al., 2002), provavelmente o mesmo acontece em cadelas, haja vista a diferença significativa (P<0,05) que foi observada entre o grupo de pacientes com carcinoma de prognóstico bom e o grupo com carcinoma de prognóstico ruim. Em humanos, a expressão da ciclooxigenase-2 nos carcinomas gástricos (SHI et al., 2003) e carcinomas pulmonares (KHURI et al., 2001) é conhecida como marcador prognóstico destas afecções.

A expressão para a ciclooxigenase-2 se restringiu ao componente epitelial da glândula mamária. Nenhuma imunomarcação foi observada no componente mesenquimal, representado pelas células contráteis de natureza mioepitelial.

Semelhante ao constatado por DORÉ et al. (2003), não foi observado diferença estatística, em relação a imunoexpressão da COX-2, entre os três sub- tipos de carcinoma (sólido, complexo e túbulo-papilífero). Este resultado ressalta a importância de realizar pesquisas avaliando principalmente o prognóstico dos animais. Em relação ao estadiamento das neoplasias verificou-se maior imunorreatividade para a ciclooxigenase-2 nos tumores em estágio III (P<0,05), relacionando a expressão desta enzima com a progressão do tumor, corroborando com os resultados encontrados por HELLER et al. (2005).

Diferentemente do esperado, evidenciou-se 35% de imunomarcação para a COX-2 nos carcinomas inflamatórios. A expectativa era encontrar um elevado número de células marcadas para a ciclooxigenase-2 neste tipo de carcinoma, devido ao comportamento extremamente agressivo que este tumor apresenta (BRODEY et al., 1983; RUTTEMAN et al., 2001). Este resultado pode ser conseqüência da intensa anaplasia que as células desta neoplasia apresentam. No processo de progressão tumoral é possível que as células percam a capacidade de sintetizar a ciclooxigenase-2, assim como acontece, com a perda dos receptores de estrógeno e progesterona nos carcinoma mamários de prognóstico ruim (PELETEIRO, 1994). Na mesma linha de raciocínio, constatação semelhante foi feita por GERARDI (2005), este pesquisador observou redução na expressão da glicoproteína-P nos mastocitomas grau III em cães, quando comparado ao grau I.

A atividade catalítica da COX-2 resulta em produção e potencialização de danos do DNA por radicais livres. A combinação desses efeitos contribui para permanente dano ao DNA genômico e a transformação celular (KUKARNI et al., 2001; ZHA et al., 2001; DONG et al., 2003). A iniciação ocorre geralmente a partir de uma única célula progenitora que sofre a ação de diversas mutações (RAW & MORO, 1999; COTRAN et al., 2000; RUTTEMAN et al., 2001), sendo que os genes supressores de tumor, como o p53, constituem os principais alvos destas mutações (COTRAN et al., 2000; RUTTEMAN et al., 2001; ZUCCARI, 2001).

Presente nas células normais na forma “wild” ou não-mutante, o gene p53 tem a função de bloquear a divisão celular através de uma proteína por ele produzida, atuando como mediador da apoptose quando da ocorrência de

alterações no genoma (LOWE et al., 1994). Quando este gene torna-se mutante, ocorre perda do controle do ciclo celular e, como conseqüência, pode ser observado distúrbios na indução da apoptose (MAY e MAY, 1999).

Associou-se a mutação do gene p53 com a malignidade das neoplasias mamárias, pois a expressão para a proteína P53 em todos os casos de carcinoma (carcinoma com prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim, carcinoma primário metastático, metástase pulmonar e carcinoma inflamatório) foi maior (P<0,01) que o grupo dos adenomas. Além disto, semelhante ao encontrado por LEE et al. (2004), houve diferença significativa (P<0,05) entre o grupo de carcinomas com prognóstico bom e o grupo de carcinomas com prognóstico ruim, sugerindo um possível envolvimento da mutação do p53 com a agressividade das neoplasias mamárias.

A imunomarcação da P53 foi predominantemente nuclear, no entanto, em algumas lâminas visibilizou-se imunorreatividade citoplasmática. Observou-se expressão da proteína P53 em todos os casos estudados. Provavelmente a utilização do anticorpo policlonal P53 conferiu maior expressão e menor especificidade, justificando a marcação de todos os tumores analisados, corroborando com os achados de ZUCCARI et al. (2005).

Nos casos de carcinoma com prognóstico ruim, em 70% dos pacientes a sobrevida após a mastectomia foi menor que 24 meses, confirmando os achados feitos por SCHMITT et al. (1998), segundo os quais as mutações no p53 estão associadas à baixa sobrevida de pacientes portadores de câncer e seu estudo como marcador prognóstico pode prever o comportamento clínico e a resposta à terapia no câncer de mama.

A atividade da COX-2 no câncer de mama pode estar envolvida com a transformação do Bcl proto-oncogene em Bcl oncogene, inibindo assim, os sinais de apoptose, permitindo desta forma maior tempo para o acúmulo de lesões genéticas múltiplas, resultando em transformação neoplásica (TSUJII et al., 1995; SURH et al., 2001; BOL et al., 2002).

A mutação do proto-oncogene Bcl2 pode ter contribuído para a redução da taxa de apoptose, avaliada pela expressão da Caspase-3, no grupo dos adenoma, carcinoma com prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim e carcinoma inflamatório. Os distúrbios apoptóticos, permitem que células malignas tenham maior sobrevida, contribuindo para que ocorra a expansão neoplásica (DEVERAUX et al., 2001; OHASHI et al., 2006). O aumento da ocorrência de apoptose nos carcinomas primários metastáticos e nas metástases pulmonares pode ser resultado da evolução clínica do tumor, desencadeando mecanismos que ainda não são bem conhecidos.

Futuras investigações devem ser realizadas para determinar a ação do oncogene Bcl-2 na indução da resistência aos sinais de apoptose, correlacionado estes resultados com a expressão da COX-2 nos tumores mamários de cadelas.

O aumento da população celular é dependente da fração de células que estão se dividindo. A detecção e quantificação das células em proliferação constituem parâmetros importantes no prognóstico de diferentes tumores (ZUCOLOTO, 1992; BACCHI & GOWN, 1993; RABENHORST et al., 1994).

Houve correlação da COX-2 com o índice de proliferação celular avaliado pela expressão do Ki-67 (clone MIB-1) no grupo dos adenomas, metástases pulmonares e carcinomas inflamatórios. Estes resultados são semelhantes aos

descritos na literatura onde a expressão de COX-2 está relacionada a fatores fisiológicos do crescimento celular, desenvolvimento das neoplasias e progressão neoplásica (DUBOIS et al., 1996; KHAN et al., 2000; KUKARNI et al., 2001; ZHA et al., 2001; BREYER & HARYS, 2001; DONG et al., 2003; KRAUS, 2003). Esta correlação não foi evidenciada para os grupos de carcinomas (carcinoma com prognóstico bom, carcinoma com prognóstico ruim e carcinoma primário metastático). Dentro desta linha de pesquisa é importante que outros marcadores de proliferação celular como o PCNA (antígeno nuclear de células proliferativa) e o AgNOR (regiões organizadoras nucleolares) sejam avaliados, para tentar estabelecer a verdadeira relação da ciclooxigenase-2 com a divisão das células neoplásicas.

O alto índice de proliferação celular (45%) detectado nos carcinoma inflamatórios corrobora com as constatações feitas BRODEY et al. (1983) e RUTTEMAN et al. (2001), os quais apontam o carcinoma inflamatório, como um tumor que apresenta alta velocidade de crescimento.

Em contrapartida, as metástases pulmonares apresentaram baixo índice de proliferação celular (5%). Provavelmente este resultado seja decorrente da localização anatômica deste tumor, ou seja, na ocorrência de metástases o organismo emite sinais para frear o seu desenvolvimento.

SIMOES et al. (1994) observaram que o índice mitótico mostra diferença significativa entre os mastocitomas recorrentes e não recorrentes; apesar de serem outras neoplasias, esta constatação não foi observada neste experimento, quando foi realizada a comparação entre os carcinomas com prognóstico bom e os carcinomas com prognóstico ruim (P>0,05).

Outro achado importante foi à identificação de forte marcação de COX-2 em células neoplásicas presentes em vasos linfáticos (êmbolo neoplásico), nos casos de carcinoma primário metastático. Assim como existe uma relação positiva entre a expressão da COX-2 e a capacidade de invasão tecidual pelas células tumorais, principalmente nos tumores de cólon e mama em humanos (SURH et al., 2001; BOL et al., 2002; CAO & PRESCOTT, 2002; DONG et al., 2003; WANG & DUBOIS, 2004), sugere-se que ação semelhante possa acontecer com os carcinomas primários metastáticos em cadelas, haja vista, o grande potencial de infiltração e metástases que estes tumores apresentam.

As metástases pulmonares podem ter sido facilitadas pela habilidade da COX-2 em regular a angiogênese, favorecendo o aporte sangüíneo necessário para a da disseminação das células neoplásicas (TSUJII et al., 1998; BAKHLE, 2001). Estudos futuros poderão correlacionar a expressão do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) com a ciclooxigenase-2 nos tumores mamários de cadelas.

A atividade da COX-2 nos tumores de mama sugere que possa estar acontecendo alta produção de PGE2e conseqüentemente a supressão do sistema

imune, contribuindo desta forma para a progressão do processo neoplásico, pois, como já foi constado por WANG & DUBOIS (2004) esta prostaglandina está envolvida com o desenvolvimento do câncer.

Futuras investigações devem ser realizadas para avaliar a existência de associação da expressão da COX-2 e a presença dos receptores de estrógeno e progesterona no tecido mamário em relação ao prognóstico do câncer de mama em cadelas, pois estes hormônios influenciam a carcinogênese mamária, segundo

MacEWEN et al. (1992); SARTIN (1992); MORRISON (1998); FONSECA (1999) e ZUCCARI (1999).

De acordo com trabalhos propostos por BAKHLE (2001), BEAM et al. (2003) e WANG & DUBOIS (2004), pode-se especular que o desenvolvimento da carcinogênese mamária está ligado à atividade da ciclooxigenase-2, porém a exata implicação desta enzima nas neoplasias mamárias permanece desconhecida. Alguns estudos epidemiológicos em cães revelaram que o uso prolongado de antiinflamatórios não esteróides, responsáveis por inibir a COX-2, pode diminuir a incidência de carcinoma de células escamosas oral e carcinoma de células transicionais da bexiga (BEAM et al., 2003), no entanto, esta ação ainda não foi avaliada em cadelas com neoplasias mamárias.

Como os protocolos com fármacos antineoplásicos e/ou radioterapia, geralmente, são pouco efetivos (RUTTEMAN et al., 2001) os inibidores seletivos COX-2 podem ser mais uma alternativa no tratamento de neoplasias mamárias em cadelas.

Os coxibes, inibidores seletivos da COX-2 (JONES & BUDSBERG, 2000; BURLEIGH, 2002), devem ser investigados quanto ao uso na quimioprevenção e tratamento dos tumores de mama, pois resultados positivos já foram descritos por GIARDIELLO et al. (1995), SHENG et al. (1997), WILLIAMS et al. (1997), SHENG et al. (1998), KAWAMORI et al. (1998), ALMEIDA et al. (2001), SURH et al. (2001) no tratamento de outras neoplasias utilizando antiinflamatórios não esteróides.