No presente estudo, foram efetuadas contagem celular e quantificação da liberação de sustâncias intracelulares em suspensões de culturas submetidas à irradiação por microondas e em suspensões tomadas como controle. Quanto ao controle, supõe-se corresponder o índice máximo de contagem celular e o mínimo de liberação de substâncias. As contagens celulares e as quantificações da
Método
liberação de substâncias foram sempre realizadas em duplicata e as médias dessas duplicatas foram utilizadas na análise estatística.
De acordo com a metodologia empregada, as culturas experimentais e controle forneceram resultados considerados pareados. Assim, empregaram-se procedimentos estatísticos apropriados para esses dados. Foi utilizado o teste t de Student, ao nível de 5% de significância, para a comparação das médias de dados pareados. O teste t exige a normalidade, pelo menos aproximada, das diferenças entre as determinações realizadas nas amostras do grupo controle e nas amostras do grupo experimental. A quantidade de dados empregados não foi suficiente para testar essa pressuposição e, então, quando colocada em dúvida, foi empregado para a comparação das médias o teste não-paramétrico de Wilcoxon, também ao nível de 5% de significância.
O coeficiente de correlação de Pearson (ou por postos de Spearman, no caso de não-paramétrico) foi calculado para medir o grau de associação linear entre as variáveis: determinações na suspensão controle e determinações na suspensão experimental. A correlação linear forte permitiu a determinação de uma equação de regressão linear pela qual se pode prever valores de uma variável a partir de valores da outra.
5.1 Contagem celular
O número de células íntegras e não-íntegras de C. albicans por mL de cada duplicata, para as suspensões controle e experimental, cuja contagem foi realizada pelo método da câmara de Neubauer, foi calculado, e os valores originais das médias das duplicatas estão descritos na Tabela A1 do apêndice. Devido à presença de zeros nos resultados, foi acrescentada uma unidade a cada valor de contagem possibilitando o cálculo de logaritmo. As contagens foram transformadas para logaritmo na base dez, e os resultados estão apresentados na Tabela 1. Em relação à contagem celular na suspensão controle, os resultados apresentados na Tabela 1 demonstram que, em todas as médias das duplicatas, foram encontradas concentrações de células íntegras da ordem de 108 células/mL. Foi observado, ainda, que não houve células não-íntegras contáveis para nenhuma das repetições dessa suspensão. Em relação à contagem celular na suspensão experimental, os resultados apresentados na Tabela 1 demonstram que, em todas as médias das duplicatas, foram encontradas concentrações de células não íntegras da ordem de 108 células/mL. Além disso, pode ser observado que não houve células íntegras contáveis para nenhuma das repetições dessa suspensão. Considerando esses resultados, não houve necessidade de aplicação de teste estatístico para avaliar a diferença entre as médias de células íntegras e não- íntegras em uma mesma suspensão.
O número de células viáveis por mL de cada duplicata, determinado pela contagem de ufc de C. albicans após semeadura em ASD, para a suspensões controle e experimental, foi calculado, e os valores originais das médias das duplicatas estão descritos na Tabela A2 do apêndice. A transformação logarítmica também foi aplicada sobre as médias das duplicatas de ufc/mL, e os resultados estão apresentados na Tabela 1. Em relação à contagem celular em número de ufc de C. albicans por mL, os resultados apresentados na Tabela 1 demonstram que não houve colônias contáveis para nenhuma das repetições na suspensão
experimental, enquanto para a suspensão controle, em todas as placas de ASD, foram encontradas concentrações de ufc da ordem de 108 ufc/mL. Assim, não houve necessidade de aplicação de teste estatístico para avaliar a diferença de células viáveis entre as suspensões.
Na Tabela 1, juntamente com as médias logarítmicas das repetições (n=8) e desvios padrão, estão apresentados os coeficientes de correlação de Pearson (r) e a estatística do teste t de Student para a comparação das médias de dados pareados.
De acordo com a Tabela 1, não houve evidência de correlação linear significativa entre os logaritmos dos números de células íntegras da suspensão controle e das células não-íntegras da suspensão experimental determinados pelo método de Neubauer (P=0,083). Além disso, não houve evidência de diferença significativa entre as médias desses logaritmos de contagens (P=0,312). Os resultados obtidos para os logaritmos podem ser estendidos para os dados originais de contagem de células.
Para verificar se o número de células íntegras, avaliado pelo método de Neubaeuer, correspondia ao número de células viáveis em ufc/mL, obtidos pelo método de semeadura, também foi aplicado o coeficiente de correlação de Pearson (r). De acordo com os resultados, houve evidência de correlação linear significativa entre o número de células íntegras da suspensão controle determinadas pelo método de Neubauer e o número de células viáveis em ufc/mL (p=0,841). Além disso, não houve evidência de diferença significativa entre as médias dessas contagens (P=0,885), sendo todas da ordem de 108.
Tabela 1 – Médias e desvios padrão (DP) dos logaritmos de contagem de células íntegras e não íntegras de C. albicans (número de células/mL), pelo método de Neubauer e de células viáveis (ufc/mL), pelo método de semeadura. Coeficiente de correlação r e teste t de Student para comparação de médias de dados pareados
Controle Experimental Células viáveis/mL Repetiçã
o Íntegras Não-íntegras Íntegras Não-íntegras Controle Experimental
1 8,36 0,00 0,00 8,43 8,68 0,00 2 8,48 0,00 0,00 8,44 8,39 0,00 3 8,42 0,00 0,00 8,64 8,35 0,00 4 8,65 0,00 0,00 8,61 8,47 0,00 5 8,90 0,00 0,00 8,90 8,20 0,00 6 8,00 0,00 0,00 8,53 8,30 0,00 7 8,27 0,00 0,00 8,17 8,30 0,00 8 8,47 0,00 0,00 8,48 8,73 0,00 Média 8,45 0,000 0,000 8,52 8,43 0,000 DP 0,26 0,000 0,000 0,21 0,19 0,000 r 0,647 (P=0,083) -0,085 (P =0,841) t 1,089* (P=0,312) 0,150** (P =0,885) * Comparação entre células íntegras (controle do método de Neubauer) e não-íntegras (experimental do método de Neubauer)
** Comparação entre suspensão controle (método de Neubauer) e suspensão controle (contagem de ufc/mL)
As médias e os desvios padrão das leituras de densidade óptica (DO) a 550 nm para as suspensões controle e experimental podem ser visualizados na Tabela 2.
Tabela 2 – Médias e desvios padrão (DP) de densidade óptica (DO) a 550 nm para as suspensões controle e experimental. Coeficiente de correlação r e teste t de Student para comparação de médias de dados pareados
Repetição Controle Experimental 1 1,810 1,780 2 1,747 1,730 3 1,452 1,454 4 1,428 1,348 5 1,360 1,137 6 1,710 1,730 7 1,137 1,161 8 1,313 1,335 Média 1,495 1,459 Desvio padrão 0,237 0,259 r 0,947 (P<0,001) t 1,194 (P=0,272)
A análise dos resultados do teste t de Student não apontou diferença significativa entre as médias de DO (P=0,272) da suspensão controle e a da suspensão experimental. O coeficiente de correlação entre as medidas de DO para essas duas suspensões resultou em um valor próximo de um, indicando forte correlação linear entre essas medidas. O gráfico de dispersão da Figura 22 sugere que uma regressão linear é adequada para descrever os dados. A equação de regressão linear indicou que o valor obtido na suspensão controle para uma amostra praticamente se repete na suspensão experimental.
FIGURA 22- Diagrama de dispersão de D.O. a 550 nm para as suspensões controle e experimental.