Kromatografik yöntem; bir örnek içindeki maddelerin, biri hareketli ve diğeri sabit iki faz arasında dağılımlarına bağlı olarak, ayırma ortamını farklı za-manlarda terk etmelerini esas alarak kalitatif ve kantitatif analiz yapılmasına olanak sağlayan yöntemdir.
Rus botanikçi Tswett 1903'de bitki pigmentleri üzerine yaptığı çalışmada kromatografi tekniğini ilk kez uygulamış ve kromatografi yönteminin bulucu-su olarak tarihe geçmiştir. Tswett bitki yapraklarından ekstrakte ettiği kloro-filleri ve ksantokloro-filleri, içine toz kalsiyum karbonat doldurduğu cam kolondan petrol eteri ile geçirerek ayırmayı başarmıştır. Böylece ilk kromatogram elde edilmiştir. Tswett bu renk olayından esinlenerek Yunanca renk anlamına gelen “chroma” kelimesinden esinlenerek yönteme kromatografi adını ver-miştir. Yapılan bu ilk uygulama daha sonraları klasik kolon kromatografi ola-rak tanınmıştır [60].
17
Zamanımızda uygulanmakta olan kromatografi yönteminde renk fazla bir anlam ifade etmemekle beraber bu ad benimsenmiştir. Kromatografi olayı sonrasında, maddelerin birbirinden ayrılmış olarak elde edilen görüntüleri, kromatogram olarak adlandırılırken, ayırım ve daha sonra kalitatif ve kantita-tif analizin gerçekleştirildiği sistemin tümü kromatografi olarak isimlendiril-miştir. Yöntemi rutin analizler veya araştırma amacıyla kullananlara da, pek doğru bir yaklaşım olmamakla beraber, kromatografçı adı verilir.
Tswett tarafından yapılan ilk çalışmalar kolon kromatografi olarak adlandı-rılmıştır. Bu yöntemler sonraları adsorpsiyon kromatografi olarak tanımlan-mıştır. Tswett'in uyguladığı yöntemde, cam kolona katı adsorban doldurul-muş, üzerine klorofil karışımlarının konulmasından sonra petrol eteri sürekli olarak kolondan geçirilmiştir. Yani ayırma ortamı adını vereceğimiz bir ko-londa, katı madde (1. faz, adsorban) ve sıvı madde (2. faz) birlikte bulun-maktadır. Katı veya sıvı olabilen birinci faza zamanla adsorban, sabit faz, hareketsiz faz veya durgun faz, iyon değiştirici, moleküler elek gibi isimler verilmiştir. Maddelerin birbirinden ayrılarak sürüklenip cam kolonu terk ede-bilmeleri için verilen petrol eteri ise hareketli faz olarak adlandırılmıştır. Da-ha sonra geliştirilen kromatografik yöntemlerde gaz veya süperkritik sıvılar da kullanılmaktadır. Bunlara da çözücü, hareketli faz, mobil faz, yürütücü sıvı gibi adlar verilir.
Hareketli faz ile birlikte çıkan ayırma ortamını terk eden maddeler ya fraksi-yonlar halinde toplanıp ayrı ayrı kalitatif ve kantitatif tayin yapılır, ya da ha-reketli faz detektör adı verilen bir elektronik cihazdan geçirilir. Detektör sü-rekli olarak izlenirken hareketli faz özelliğine bağlı olarak sabit elektronik sinyal verir (temel çizgi, baseline). Hareketli faz içinde karışım içindeki mad-delerden birisinin gelmesi halinde detektör sinyali değişir. Her madde için ayrı oluşan bu değişik sinyal topluca kromatogram olarak adlandırılan şekli oluşturur (Şekil 1.4). Kromatogramda oluşan her bir sinyale ise pik adı veri-lir. Pikler, kromatografinin türüne göre farklı biçimlerde olabiveri-lir. Örneğin ince tabaka kromatografide renkli lekeler, klasik kolon kromatografide renkli bant-lar, gaz veya sıvı kromatografilerde Şekil 1.4'de görüldüğü gibi bir grafik
18
şeklinde olabilir. Pikler kalitatif ve kantitatif analizde kullanılır.
Şekil 1.4. Kromatogram
Bugün onlarca temel kromatografik yöntemlerden başka hemen her gün yeni katılımlarla kromatografik yöntem sayısı artmaktadır. Bu nedenle tek bir sınıflandırma ile kromatografik yöntemleri sıralamak gerçekçi olmayacaktır. Kromatografik yöntemler çeşitli şekillerde sınıflandırılabilir. Bu sınıflandırıl-malar:
a) Kromatografik ortamın fiziksel şekline göre,
b) Örneğin kromatografik ortama veriliş biçimine göre, c) Kromatografik ayırma mekanizmasına göre,
d) İki fazın polarlık durumlarına göre, e) İki fazın fiziksel haline göre,
yapılabilir.
Yukarıdaki sınıflandırmaların ötesinde pratikte kromatografik yöntemler de-nilince akla klasik olarak şu yöntemler ve sınıflandırma gelir:
1. Kâğıt kromatografi,
2. İnce tabaka kromatografi, 3. Kolon kromatografi,
Zaman, t Elektronik
sinyal
Enjeksiyon
Pikler
19 4. Gaz-sıvı kromatografi,
5. Yüksek basınç sıvı kromatografi
6. Süperkritik akışkan kromatografi [60-62].
Sıvı kromatografi sabit fazın, sıvı veya katı oluşuna göre sıvı-sıvı, sıvı-katı şeklinde ikiye ayrılabilir. Ancak, pratikte, sıvı kromatografik yöntemlerden konu edilirken şöyle bir sınıflandırma ile daha çok karşılaşılır.
Adsorpsiyon kromatografi, (Normal ve Ters Faz Kromatografi),
Sıvı-sıvı partisyon kromatografi,
İyon kromatografi,
Jel kromatografi,
Hareketli fazın sıvı, sabit fazın sıvı veya katı olduğu tüm kromatografik yön-temler sıvı kromatografi başlığı altında toplanabilir. Bu başlık altında klasik kolon kromatografi, kâğıt kromatografi, ince tabaka kromatografi yöntemleri de bulunmaktadır. Ancak, bu yöntemleri ayrı başlıklar veya bölümler altında toplamak ve günümüzde sıvı kromatografi denince yüksek basınç sıvı kromatografiyi anımsamak normal olmuştur. Klasik kolon kromatografisi şeklinde uygulanan yüksek basınç sıvı kromatografi (HPLC), günümüzde modern enstrümantal analitik tekniklerin en önemlilerinden birini oluşturur.
Çeşitli örneklere uygulanabilmesi ve hareketli faz yönünden çok alternatifli oluşu bu teknikte büyük ilerlemeler sağlanmasına yol açmıştır.
HPLC, sabit fazın polar, hareketli fazın apolar olması halinde normal faz- yüksek basınç sıvı kromatografi (NP–HPLC), sabit fazın apolar, hareketli fazın polar olması durumunda ise ters faz-yüksek basınç sıvı kromatografi (RP–HPLC) olarak isimlendirilir. Normal fazda alümina, silika, Si–CN, Si–
NH2 gibi polar katılar kullanılır. Ters fazda ise, apolar karakter gösteren alkil grupların bağlandığı silika, alumina kullanılır. Ancak normal faz ile ters faz arasında belki de en büyük fark, ters faz kromatografide hareketli faz içinde su kullanılmasıdır. Bol ve ucuz olan suyun kullanılabilmesi ters faz kromatografiye büyük avantajlar sağlamaktadır.
20
Yöntemin bu kadar yaygın olmasının sebepleri, duyarlığı, kalitatif ve kantita-tif tayinlere kolaylıkla uygulanabilir olması, uçucu olmayan türlerin veya sı-caklıkta kolayca bozunabilen türlerin ayrılmasına uygun olması ve hepsin-den de önemlisi sanayinin, birçok bilim dalının ve halkın birinci derecede ilgilendiği maddelere geniş bir şekilde uygulanabilirliğidir. Bu gibi maddelere örnek olarak aminoasitler, proteinler, nükleikasitler, hidrokarbonlar, karbon-hidratlar, ilaçlar, pestisitler, antibiyotikler ve çeşitli inorganik bileşikler sayıla-bilir. Bir HPLC sistemi, ana bölümler olarak, bir veya birkaç çözücü rezervu-arı, pompa, akış sistemleri, puls gidericiler, enjeksiyon vanası, ön kolon, analitik kolon, detektör ve sinyal kaydediciden meydana gelir. Şekil 1.5’de bir HPLC sisteminin blok şeması görülmektedir.
Şekil 1.5. Yüksek Basınç Sıvı Kromatograf Şeması
Çözücü rezervuarından alınan hareketli faz, sürekli akış sağlayan puls gide-ricilerden geçtikten sonra enjeksiyon bölmesine gelir ve burada enjekte edi-len örneği kolona sürükler. Kolondaki tutulma eğilimine bağlı olarak birbirle-rinden ayrılan maddeler, kolonu farklı zamanlarda terk eder ve detektöre ulaşır. Detektörde maddelerin oluşturduğu sinyaller bir yazıcıda veya integratörde kaydedilir ve buradan kalitatif ve kantitatif analiz yapılabilir.
Rezervuar
Pompa
Enjeksiyon Bölmesi
Ön Kolon
Kolon
Detektör
Sinyal Kaydedici
21