Yöntem

Laboratuara getirilen tüm örnekler toz haline gelinceye kadar öğütülmüş, paçal usulü bölünerek homojen edilmiş ve ekstraksiyon işlemine hazır hale getirilmiştir. Zearalenon analizleri Fazekas ve Tar (2001)’ın analiz metoduna göre HPLC ile yapılmıştır. Lakin bahsedilen metot incelendiginde ve uygulanmaya calisildiginda HPLC ile tespit edilebilen en düşük ZEA miktarı yasal limitler ile uyumlu olmamakta ve arzu edilen değerlere inilememekteydi. Bu sebep ile aşağıda belirtilen modifikasyonlar yapılmıştır.

Fazekas ve Tar (2001)’ın uyguladıkları metotta 20 gram numune alınıp 2 gram tuz ilave edilerek 50 ml ekstraksiyon çözeltisi ile 1 saat çalkalama yapılmakta, takiben filtrasyon uygulanmakta ve filtrattan 10 ml alınarak 30 ml su ile seyreltilmekte ve tekrar filtre edilmektedir. Daha sonra elde edilen ikinci filtrattan 10 ml (0,8 gram numune temsili olmaktadır) alınır ve immuno affinite kolondan geçirilir. Kolonda tutunan ZEA 1,5 ml metanol ile elue edilir ve tam kuruluğa kadar azot gazı akışı atkında uçurulur. Kurumuş kalıntı 200 µl enjeksiyon çözletisinde çözündürülerek 20 µl HPLC’ye enjekte edilir. Bu sistem sonucunda HPLC analitik kolonundan geçen temsili numune miktarı 0,08 gram olmakta 1 gramda ng madde miktarının ifadesi olan ppb olarak sonuç alınabilmesi için 12,5 çarpan faktörü kullanılmaktadır. Benzer şekilde hazırlanan kalibrasyon tablosunda Fazekas ve Tar

Doğrusallık denklemi: y=mx+ b m = 1,1676 b = -3,365 RSD: 2,98124 Korelâsyon katsayısı: 0,9998

(2001) beş noktalı eğri (0,025 - 0,25 - 0,50 - 1,00 - 1,25 µg/ml) oluşturmuşlar, bu eğrinin aralığı hasaplanırsa örneklerde gözlemlenebilir değer aralığının 62,5 – 3125 µg/kg (ppb) olduğu görülmüştür. Özellikle bebek maması örneklerinde yasal limit değerinin 20 µg/kg olduğu düşünülürse yapılan analizlerin bir anlamı olmamaktadır. Benzer şekilde Fazekas ve Tar (2001)’ın metotlarında son aşamada kurumuş kalıntının çözündürüldüğü 200 µl sıvı miktarı analizlerin yapılacağı laboratuar şartlarında uygulaması zor bir miktar olduğu gözlemlenmiştir.

Bu durumlar göz önüne alınarak aşağıda belirtilen modifikasyonlar yapılmıştır;  Analize alınan numune miktarı arttırılarak 50 gram yapılmıştır.

 Kullanılan ekstraksiyon çözeltisi arttırılarak 100 ml yapılmıştır.

 İlk süzüntüden alınan miktar 25 ml’ye ve seyreltmede kullanılan su miktarı 75 ml’ye arttrılmıştır.

 İmmuno affinite kolondan geçirilen ikinci süzüntü miktarı 10 ml’den 50 ml’ye çıkarılmıştır.

 Kurumuş kalıntının çözüntürüldüğü enjeksiyon çözeltisi miktarı 1 ml olarak uygulanmıştır.

 Kalibrasyon eğrisinde kullanılan nokta sayısı arttırılmış ve 7 noktalı (0,05 - 0,10 - 0,20 - 0,50 - 1,00 - 2,00 - 5,00 µg/ml)olarak uygulanmıştır.

Bu modifikasyonların neticesinde HPLC analitik kolonundan geçen temsili örnek miktarı 0,625 grama yükseltilmiş, dolayısı ile 1 gramda ng madde miktarının ifadesi olan ppb olarak sonuç alınabilmesi için gerekli çarpan faktörü 12,5 tan 1,6 ya düşürülmüştür. Bu bağlamda kalibrasyon eğrisinden elde edilebilen örneklerde gözlemlenebilir değer aralığı 8 – 800 µg/kg (ppb) düşmüştür. Teşhis limiti çalışmaları yapılmış ve en düşük sinyal/gürültü oranını sağlayan sinyalin karşılığı olan teşhis limiti değeri 2 ppb (µg/kg) olarak bulunmuştur.

Fazekas ve Tar (2001)’ın uyguladıkalrı metot katı örnekler ile denenmiş fakat bizim örneklerimiz içerisinde yer alan mısırözü yağı gibi sıvı numunler için uygulanmamıştır. Bu nedenle metot içerisinde yapılan değişikliklere ilaveten sıvı numuneler için aynı birimlerde ve oranlarda ekstraksiyon işlemi uygulanmıştır. Bu işlem için ayırma hunisi kullanılmıştır. Süzüntüden alınan miktar ile ayırma hunisinde ayrım sonrasında ekstraksiyon çözeltisi

kısmından alınan miktarlar eşitlenmiş ve böylelikle takip eden işlemlerde değişiklik yapılmadan aynı çarpan değerine ulaşılmıştır.

Yapılan bu değişiklikler neticesinde metodun çalışıp çalışmadığının kontrolü olan validasyon işlemlerinden doğruluk ve kesinlik tespiti yüzde geri kazanım ve referans madde çalışmaları ile yapılmıştır. Buna göre çalışmalar sırasında 50 µg/kg ve 150 µg/kg düşük ve yüksek düzey geri kazanım sonuçları sırası ile %89 ve %90 olmuştur. Hesaplamalar sonucunda tekrarlanabilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDr) ve yeniden yapılabilirlik koşulları altında elde edilen sonuçlardan hesaplanan nispi standart sapma (RSDR) değerleri sırası ile düşük konsantrasyonlar için %2,40 ve %4,29 yüksek konsantrasyon için % 1,43 ve %3,85 olmuştur. Bu değerler Çizelge 3.2.’de verilen TGK Tebliğ 200/21 Ek-11 zearalenon metotları için performans kriterleri tablosundaki değerler ile kıyaslanmış ve geçerli olduğu tespit edilmiştir.

Çizelge 3.2. ZEA için metot performans kriterleri

Seviye (µg/kg) Zearalenon

RSDr(%) RSDR(%) Geri Kazanım (%)

<50 <40 <50 60-120

>50 <25 <40 70-120

Geçerliği sağlanan metot ile analizler yapılmıştır. Erlen içerisine katı numunelerden 50 g tartım, sıvı numunelerden 50 ml ölçüm ile koyulmuştur. Üzerlerine 2 şer gram NaCl tartılmıştır. Her erlen içerisine 100 ml ekstraksiyon çözeltisi ilave edilmiştir. Çalkalayıcıda 60 dakika süre ile çalkalanarak numunelerde aradığımız analit olan ZEA, ektraksiyon çözeltisi içerisine geçmesi sağlanmıştır. Süre sonunda ekstrakt kaba filtre kâğıdı üzerinden bir erlene süzülmüştür. Sıvı numuneler ile yapılan ekstraksiyonda süre sonunda tüm ekstrakt ayırma hunisinde alınmış, faz ayrılması beklenmiştir. Faz ayrımı gerçekleşmesini takiben ekstraksiyon çözeltisi fazından bir pipet ve puar yardımı ile 25 ml, benzer şekilde katı numune ekstraksiyonundan elde edilen süzüntüden 25 ml bir behere pipetlenmiştir. Üzerilerine 75 ml ultra saf su ilave edilerek seyreltilmiştir. Seyreltilmiş ekstrakt iyice karıştırılarak cam filtre kâğıdı üzerinden bir balon içerisine süzülmüştür ve berrak ekstrakt elde edilmiştir. Elde edilen bu berrak ekstraktın 50 ml daha önceden hazırlanmış olan immunoaffiniti kolon şırınga düzeneği içerisine şırınga haznesine koyulmuştur. Saniyede 1-2 damla sabit hızla immunoaffiniti kolondan vakum manifoldu yardımı ile geçirilmiştir. Bu aşamada immunokolondan geçen numune miktarı 50 ml filtrat = 6,25 g örneği temsil etmektedir. Tüm

berrak filtrat kolondan geçtikten sonra kolon yaklaşık 1–2 damla/saniye sabit hızla 10 ml ultra saf su geçirilerek yıkanmış ve böylelikle kolonda tutunması muhtemel ancak suda çözünüp uzaklaşabilen yabancı maddeler uzaklaştırılmıştır. Kolonda tutunan ZEA, kolonun altına vial yerleştirildikten sonra kolondan haznesine pipetlenen 2 ml HPLC dereceli asetonitril ile yaklaşık 1–2 damla/saniye sabit hızla kolondan geçirilmesi sureti ile viale alınmıştır. Viale alınan asetonitril içerisindeki ZEA, azot gazı altında asetonitrilin tam kuruluğa kadar uçurulması ile vial iç yüzeyinde kristal forma geçirilmiştir. Kurumuş kalıntı üzerine önceden hazırlanan 1 ml (3+7) (Asetonitril +Su )(v/v) pipetlenmiştir. Vial yaklaşık 30 saniye süre ile vortekslenerek kurumuş kalıntının tekrar çözünmesi sağlanmıştır. Elde edilen eluat 2 ml amber HPLC vialleri içerisine alınmış ve 100 μl HPLC’ye enjeksiyon yapılmıştır.

3.2.1. Zearalenon Miktarının Hesaplanması

HPLC okumaları ile elde edilen alan değerleri çizilmiş olan kalibrasyon tablosu ile ng/g (ppb)’a çevrilerek rapor alınmıştır. Lakin hesaplanan bu değer ekstraksiyon kısmından gelen seyreltme faktörü ile çarpılması gerekmektedir. Seyreltme faktörü aşağıda verilen formülde uygulamada kullanılan miktarlar yerine yazılarak bulunmuştur.

V1 V3 V5 1 WZEA(ng/g) = Ma × --- × --- × --- × ---

V2 V4 V6 Ms

Ma = HPLC’de okunan kromatogram sonucu (ng) V1 = Ekstraksiyon solventinin hacmi (100 ml) V2 = Filtrattan seyrelmek için alınan miktar (25ml) V3 = Toplam seyreltme hacmi (100ml)

V4 = İmmunoafinite kolonundan geçirilen numune süzüntüsünün hacmi (50 ml) V5 = Test çözeltisi (1 ml=1000 µl)

V6 = HPLC enjeksiyon hacmi (100µl) Ms = Numune miktarı (50 g veya 50 ml)

Yukarıdaki formülde değerler yerine yazıldığında;

Bu çalışmada analizi yapılan tüm örnekler iki tekerrürlü çalışılmıştır. Tekerrürlerin HPLC okuma ortalamaları alındıktan sonra mısır içerikli katı numunelerin ortalamaları aynı zaman dilimlerinde temiz mısır unu numunesinde 50 µg/kg düzeyinde yapılan geri kazanım çalışması sonucunda elde edilmiş olan % 89 geri kazanım ortalaması ile düzeltilmiştir.

Mısırözü yağı numuneleri ise ortalamaları alındıktan sonra aynı zaman dilimlerinde temiz mısırözü yağı numunesinde 100 µg/kg düzeyinde yapılan geri kazanım çalışması sonucunda elde edilmiş % 94’lük geri kazanım ortalaması ile düzeltilmiştir. Geri kazanım ile düzeltilmiş değerler aşağıdaki formül ile hesaplanmıştır.

Düzeltilmiş değer(ng/g) = HLPC okuma ortalaması Geri kazanım oranı

4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA