4 -
Matérias e métodos4.1-Caracterização da amostra
Selecionaram-se 2 grupos amostrais, obtidos nas clinicas de graduação e pós- graduação na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Minas Gerais, apresentando as seguintes características:
Grupo controle (Dentes sem estímulo pulpar)
Neste grupo coletaram-se o tecido pulpar de terceiros molares, totalmente
inclusos, indicados para exodontia. Foram incluídos neste estudo aqueles dentes que se encontravam totalmente intra-ósseos, ou aqueles cuja coroa apresentava completamente coberta por tecido gengival. Foram descartados os elementos dentais que sofreram fratura durante o procedimento cirúrgico de remoção.
Grupo caso (Dentes com estímulo pulpar)
Neste grupo coletaram-se o tecido pulpar de elementos dentais erupcionados cariados e /ou restaurados que haviam sido indicados para a exodontia ou tratamento endodôntico. Foram incluídos neste grupo aqueles dentes que responderam positivamente aos testes de vitalidade pulpar e não apresentaram exposição do tecido pulpar à cavidade oral.
4.2-Aspectos éticos
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais (COEP/UFMG), parecer n°. ETIC 390/08 (Anexo II).
O paciente e/ou responsável foram esclarecidos sobre os objetivos da pesquisa e aqueles que voluntariamente se dispuseram a participar desta pesquisa assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo I).
4.3-Coleta e processamento do material para a análise
Amostras coletadas a partir de dentes indicados para a exodontia.
Após os procedimentos cirúrgicos, os dentes foram imersos em hipoclorito de sódio a 2,5% por 5 minutos para remoção do tecido aderido a sua superfície externa, seguido da imersão em soro fisiológico, por 5 minutos, para a neutralização do hipoclorito. Após esses procedimentos, os dentes foram friccionados com gaze úmida para remoção dos tecidos remanescentes.
Um sulco longitudinal foi realizado ao redor de todo o dente, sem atingir a cavidade pulpar, com disco diamantado montado em peça de mão. Um instrumento metálico estéril foi então introduzido no sulco induzindo-se a fratura . O tecido pulpar foi removido, armazenado em Tissue-Tek e congelado a -80°C.
Amostras coletadas durante o tratamento endodôntico
Após remoção do tecido cariado e a constatação clínica de que o tecido pulpar
não foi exposto, os dentes foram submetidos a isolamento absoluto e à desinfecção por polivinilpirrolidona-iodo (PVPI) a 5%, seguido por hipoclorito de sódio a 2,5%. A cavidade de acesso endodôntico foi então realizada e a polpa dental removida com colher de dentina estéril. O tecido pulpar foi removido, armazenado em Tissue-Tek e congelado a -80°C.
4.4-Análise Histológica
Cortes histológicos de 5µm, das amostras congeladas foram confeccionados e corados com hematoxilina para avaliação histológica. Os cortes foram submetidos à contagem de células inflamatórias, com um aumento de 400x, e o número total de células inflamatórias obtido para cada amostra.
4.5-Extração do DNA
Extraiu-se o DNA presente no tecido pulpar utilizando-se o QIAamp DNA Tissue Mini Kit (Qiagen 51106), obedecendo-se as instruções do fabricante. O DNA obtido foi diluído em água, estocado a -20°C, e posteriormente utilizado para amplificação das regiões de interesse pela técnica de PCR (MSP) e através do seqüenciamento gênico.
4.6-Tratamento com Bissulfito de Sódio
O padrão de metilação foi avaliado através da técnica de PCR específica para metilação - (MSP). Essa técnica distingue os alelos metilados dos não-metilados de um gene, baseando-se na mudança induzida no DNA pelo tratamento com o bissulfito de sódio. Este tratamento converte as citosinas não metiladas em uracila, enquanto as citocinas metiladas são protegidas dessa conversão.
Fez-se a conversão por bissulfito de acordo com Goldenberg et al. (2004). Em resumo, 1μg de DNA foi desnaturado por incubação em 2 µl de NaOH 3M, por 20 minutos, a 50°C. Seguiu-se o tratamento com o bisulfito de sódio (2.5M) e a hidroquinona (1M), por 3 horas, a 70°C. As amostras, de DNA modificado foram purificadas pelo Wizard DNA Purification Resin, de acordo com as recomendações do fabricante (Promega, Madison, WI, USA), seguido pela eluição em água MilliQ. Posteriormente, adicionou-se NaOH (3M), para completa modificação e precipitação por etanol. Os pellets foram resuspendidos em 25 µl de TE e congelados a -20°C.
4.7 MSP (Reação em Cadeia de Polimerase Metilação Específica) para análise da metilação de IFN-gama
O DNA tratado pelo bissulfito de sódio foi amplificado utilizando-se os primers abaixo relacionados para se identificar os alelos metilados e não metilados, utilizando-se a técnica de MSP para avaliação do gene IFN-gama.
Os primers utilizados em cada reação foram: Não-Metilados F –
5`GTGATAATGGGTTTGTTTTATT3` e R-
GTGGGTATAATGGGTTTGTTTTATC3` e R- 5`AATTAAAATC TCCTAAAAATTACGTA3` (Bonilla-Henao et al. 2005).
A reação de PCR foi realizada apresentando em um volume final de 25µl, 10XPCR buffer, 5 µl dNTP-mix (1mM de cada), 0,75µl magnésio (50mM), 0,5µl de cada primer (20pmol/µl), 0,5µl de Taq Platinum DNA Polimerase (Invitrogen Life Tecnologies, Calsbad, CA, USA) e 200 ng de DNA. As condições de amplificação consistiram de 940C por 4 min, seguidos de 30 ciclos de 940C por 1 min, 480C por 1 min e 720C por 1 min, e uma extensão final de 7 min a 720C. A reação foi realizada no termociclador Eppendof AG, Germany. Foram utilizados como controle positivo da reação metilada, DNA tratado com a enzima SssI metilase (New England Biolabs, Ipswich, Mass, USA) e para a reação não metilada DNA de células mononucleares de sangue periférico (CMSP) (Kowng et al., 2005; Brakensiek et al. 2005).
Os produtos do MSP foram verificados pela eletroforese em gel de poliacrilamida. Foram aplicados 2ml de cada produto juntamente com 2ml de gel loading buffer (GLB) no gel a 6,5%. A corrida foi realizada em tampão TBE 1x, a 160V, durante aproximadamente 40 minutos, utilizando-se cuba específica (mini vertical gel electrophoresis unit, Sigma). Posteriormente, cada gel foi corado pela prata para verificação e análise do material amplificado. Como controle negativo, realizou-se a reação com ausência de DNA. Controles positivos e negativos foram utilizados em todos os experimentos.
4.8 - Sequenciamento de DNA para avaliação da metilação do gene IL-10
O DNA tratado com bissulfito foi amplificado pela técnica de PCR, utilizando-se os primers : F - 5`-GGTAGGGGTTATGGTGAGTATTATTTGA-3 e R –
5`CCTAAACTAACCCTCCACCCAATC 3, previamente descritos (Szalmas, 2008). Os produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 6,5% e corado por prata. Para a reação de PCR foram incluídos 2,5µl de 10XPCR buffer, 5 µl dNTP-mix (1mM de cada), 0,75µl magnésio (50mM), 0,5µl de cada primer (20pmol/µl), 0,5µl de Taq Platinum DNA Polimerase (Invitrogen Life Tecnologies, Calsbad, CA, USA) e 200 ng de DNA, constituindo um volume final de 25µl. Neste caso as condições para amplificação consistiram de 940C por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de 940C por 1 min, 600C por 30s e 720C por 1 min, e uma extensão final de 10 min a 720C. A reação foi realizada no termociclador Eppendof AG, Germany. Os produtos foram analisados em gel de alcrilamida 6,5% corados pela prata, e em seguida purificados pelo GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), segundo instruções do fabricante.
Posteriormente, os produtos de PCR purificados foram submetidos à reação de seqüenciamento. Cada reação para seqüenciamento consistiu de um volume final de 20µl, por adição de 2µl de Big DyeTM,3µl de tampão, 1µl do primer diluído (1:5,25) e 400ng de produto de PCR, colocados no termociclador Eppendof AG, Germany. Os produtos da reação de sequenciamento foram precipitados de acordo e sequenciados no ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os CGs analisados no gene da IL-10 foram -634, -599, -373, -352, -350, -320, -185, -110.
Este último procedimento permitiu que se confirmasse a efetividade do tratamento por bissulfito ao demonstrar que as citosinas presentes fora das ilhas CpG eram lidas como timina, demonstrando a conversão.
4.9 - Análise dos resultados
Foi feita análise estatística usando o teste de Mann-Whitney pelo programa BioEstat 4.0 (Belém, Brasil). Um valor de p < 0.05 foi considerado significante.
5 - Resultados
5.1 - Análise Histológica
Observaram-se ao se analisar os cortes histológicos que, no grupo controle a média do número de células foi de 10, variando de 2 a 75 células. No grupo caso a média foi de 61, variando de 23 a 180 células (p=0.0025).
Apenas duas amostras no grupo caso mostraram predominância de polimorfonucleares neutrófilos, enquanto nos demais cortes houve um predomínio de células mononucleares.
Figura 1 : Microfotografia representativa dos cortes histológicos do grupo Caso
Figura 2 : Microfotografia representativa dos cortes histológicos do grupo
5.2 - MSP para o IFN-γ
A Tabela 1 ilustra os dados representativos do MSP para o gene do IFN- (Anexo III- Artigo). Todas as amostras do grupo caso mostraram-se positivas para a seqüência não-metilada. Por sua vez, a maioria das amostras mostraram-se positivas para a seqüência metilada, o que demonstra a ocorrência de uma metilação parcial (Tabela 1). No grupo controle, 44.5% das amostras mostraram-se negativas para a seqüência não-metilada. Entretanto, neste grupo, todas se mostraram positivas para a seqüência metilada, correspondendo a uma metilação total do gene IFN- (Tabela 1).
Amostra IFN- gene
Grupo Caso M U 1 + + 2 + + 3 + + 4 + + 5 + + 6 + + 7 + + 8 - + 9 + + 10 + + % de positivo 90% 100% Grupo Controle 11 + + 12 + + 13 + - 14 + + 15 + - 16 + - 17 + + 18 + - 19 + + % de positivo 100% 55.5%
Tabela 1 – Resultado do MSP para o gene de IFN- , onde M representa
5.3 - Análise do seqüenciamento do gene da IL-10
Para a análise do seqüenciamento do gene da IL-10 foram avaliadas 10 amostras, sendo 5 provenientes do grupo caso e 5 do grupo controle. Foi observado através do programa BiQ Analyser v2.00 uma taxa de conversão de 100% em todas as amostras após o tratamento com bissulfito de sódio, em ambos os grupos. Cada CpG foi analisado quanto ao padrão de metilação, quando observaram-se, de um modo geral, em ambos os grupos, que os CpGs localizados nas posições -634, -599, -373, -353, - 350, -320, -185, da região promotora apresentaram metilação total, enquanto o CpG -110 mostrou metilação parcial. A figura 3 ilustra um eletroferograma representativo dos resultados obtidos. As figura 4 (grupo controle) e 5 (grupo caso) ilustram os resultados obtidos no
seqüenciamento das amostras avaliadas.
Figura 3- Eletroferograma representativo do sequenciamento do gene IL-10 em uma amostra do grupo Controle. CpGs totalmente metilados.
Figura 4- Resultados do sequenciamento do gene IL-10 do Grupo Controle. Metilado ( apenas a presença do C no CpG), Não-metilado ( apenas a presença de T no CpG), Metilação parcial ( presença de C e T simultaneamente), Ausente ( não foi possível fazer a leitura)
Figura 5- Resultados do sequenciamento do gene IL-10 do Grupo Caso. Metilado ( apenas a presença do C no CpG), Não-metilado ( apenas a presença de T no CpG), Metilação parcial ( presença de C e T simultaneamente), Ausente ( não foi possível fazer a leitura)
Este estudo procurou avaliar o padrão de metilação do DNA em genes relacionados a duas citocinas envolvidas na modulação da resposta imune. As características anatômicas da polpa dental, que se encontra confinada em paredes rígidas que a mantêm distante da microbiota presente na cavidade oral, permitem que se estude este tecido em condições de presença ou ausência de um processo inflamatório. Neste estudo os espécimes clínicos foram obtidos a partir de dentes inclusos (sem inflamação) ou dentes portadores de lesões cariosas, indicados para o tratamento endodôntico (com inflamação).
A metilação total observada no grupo controle e a metilação parcial observada no grupo caso sugerem que a inflamação pulpar pode alterar o padrão de metilação, levando a uma hipometilação do gene do IFN- Kersh e colaboradores, em 2006, osbservaram que a ausência de metilação na região promotora está associada a uma expressão aumentada dos níveis de mRNA de IFN- , principalmente em células T CD8+ efetoras. A perda da metilação do gene do IFN- em polpa dental inflamada talvez represente um mecanismo modulador da resposta inflamatória nesse tecido. Anteriormente, foi demonstrado por Hahn et al. (2000) que ocorre uma elevada prevalência de mRNA-IFN- nos estágios inicias da inflamação pulpar. Da mesma maneira, Kim & Lim (2002) detectaram uma maior expressão de IFN- em polpas estimuladas com Porphyromonas endodontalis quanto comparadas ao controle, sem estímulo.
A região promotora do IFN- possui seis ilhas CpG localizadas nas posições -205, -190, -170, -52, -45 e -34 (Jones & Chen 2006). O primer utilizado neste estudo permitiu avaliar as ilhas localizadas nas posições -170 e -52. Anteriormente, Jones & Chen (2006) observaram que a posição -52 é a principal controladora da expressão gênica associada à metilação. Observaram ainda que a expressão do IFN- estava
associado à hipometilação nessa posição, quando se comparou células Th1 com linfócitos T naive. Entretanto, a expressão de IFN- pode também ser modulada por fatores de transcrição específicos e pela estrutura da cromatina (Kersh, et al.,2006).
O padrão de metilação do gene IFN- observado neste estudo demonstrou uma hipometilação que difere dos resultados do estudo que analisou a metilação do genoma em tecidos com inflamação crônica, onde uma hipermetilação foi detectada (Stenvinkel et al., 2007). Essa contradição provavelmente se justifica pelo fato de que, neste estudo, analisaram-se genes específicos e não o padrão de metilaçao do genoma. Segundo Backdahl et al. (2009) o estresse oxidativo gerado em processos inflamatórios crônicos pode ser um fator que promova a redução geral no padrão de metilação.
Durante uma inflamação pulpar ocorre uma expressão aumentada de citocinas pró-inflamatórias (Hahn, et al., 2000). A hipometilação do gene do IFN- , observada neste estudo, no grupo caso, sugere uma maior expressão desta citocina, como demonstrado em estudos anteriores (Hahn, 2000; Kim & Lim 2002). Dong et al., (2007) encontraram uma associação entre o padrão de metilação da região promotora do gene IFN- e a sua transcrição, observando uma hipometilação em células produtoras. Por sua vez, Kwon et al. (2008), ao avaliarem ilhas CpG na região promotora do IFN- , não encontraram relação entre a expressão gênica é o padrão de metilação. Ao analisar o padrão de metilação do gene do IFN- e o perfil de células T, Young et al. (1994) observaram que em células Th1 (produtoras de IFN- ) a região promotora estava completa ou parcialmente hipometilada, ao passo que em celulas Th2 a região promotora encontrava-se hipermetilada.
No que diz respeito ao IFN- , o mecanismo epigenético que estaria envolvido na modulação da resposta inflamatória no tecido pulpar seria a demetilação do DNA. Este processo poderia ocorrer pela inibição da metilação das novas fitas de DNA formadas
durante a replicação celular, como resultado de uma demetilação oxidativa, ou devido à possível ação de uma enzima, que induz a demetilação diretamente, removendo o radical metil da citosina (Kersh et al., 2006).
Neste estudo avaliaram-se também o padrão de metilação em oito CpGs localizadas nas posições -634, -599, -373, -352, -350, -320, -185, -110 da região promotora do gene da IL-10. De um modo geral, os CpGs, totalmente e parcialmente metilados, foram observados tanto no grupo caso quanto no controle. Uma alta freqüência de metilação total foi observada nas ilhas CpGs -373, -352, -350, -320 e -185 em ambos os grupos, sugerindo que a metilação destas regiões é um evento comum na polpa dental.
Apesar de uma menor freqüência de metilação total ter sido observada nas posições -634 e -599, principalmente no grupo controle. Szalmas et al. (2008) relataram que o padrão de metilação da região promotora proximal (-110) é a principal determinante do silenciamento transcricional da expressão da IL-10 humana em células epiteliais normais e neoplásicas. Estes autores detectaram a não metilação da posição -110 em células produtoras da IL-10, enquanto a presença de metilação determinou o silenciamento, uma vez que esta região associa-se à ligação de um importante fator de transcrição, o STAT3. Diante disto, como não se observaram diferenças nesta posição, a alteração no padrão de metilação entre os grupos avaliados neste estudo não permite sugerir diferença na expressão desta citocina.
Dong et al. (2007) não observaram, em células T recuperadas em sangue periférico humano, uma associação entre um padrão de metilação e a expressão de IL- 10, diferentemente do observado com o IFN- . Estes autores concluíram que o padrão de metilação desse gene não é fator decisivo em sua transcrição. Segundo outros pesquisadores (Bonilla-Henao, 2005; Johnson & Belshaw, 2008) embora seja
reconhecido o papel da metilação do DNA no controle de muitos processos imunes, o grau do silenciamento transcricional depende da quantidade de citosinas metiladas nos CpG e suas posições dentro da seqüência.
A presença de inflamação crônica, infecção bacteriana ou estresse oxidativo podem também promover a demetilação do DNA. Especula-se que a inflamação persistente pode levar à metilação do DNA via inativação de citocinas sinalizadoras supressoras e via compostos halogênios (Backdahl et al., 2009). Torna-se relevante assim, definir se os mecanismos epigenéticos que ocorrem em tecidos infectados, tais como aquele de polpas de dentes portadores de uma lesão cariosa ativa, são o resultado do contato microbiano direto ou são conseqüência da resposta inflamatória gerada por eles (Bobetsis et al., 2007). Apesar de o presente estudo ser um passo importante no entendimento da interação metilação-processo inflamatório no tecido pulpar, estudos posteriores são necessários para se definir a ação de fatores epigenéticos na modulação da resposta inflamatória neste tecido. Para tanto seria interessante comparar o padrão de metilação com a expressão de mRNA e a produção de proteínas. Assim, avaliar-se-ia não só os fatores relacionados à transcrição, mas também à tradução.
- A presença de metilação é um evento observado no tecido pulpar na presença e ou ausência de inflamação;
- A hipometilação do gene IFN- foi observada em polpa dental inflamada; - Não se observou diferença na alteração do padrão de metilação do gene da IL- 10 na posição -110, na presença e ou na ausência de inflamação. Os CpGs -634 e -599 necessitam de estudos adicionais para se definir sua influencia em processos inflamatórios.