Western Blot

Sıvı nitrojende dondurulan uterus dokularına ait örnekler çözdürülüp protein izolasyonu yapılarak NICD1, NICD2, HEY1 ve HES5 proteinlerinin ekspresyon miktarlarını belirlemek ve erken gebelikteki ekspresyonlarını karşılaştırmak amacıyla Western Blot yöntemi kullanıldı.

3.3.1. Protein İzolasyonu Kullanılan Solüsyonlar:

 Lizis Tampon Solüsyonu (Lysis Buffer): 0,01 M Tris

0,6gr Tris (#1.08387.2500; Merck) 40 ml distile suda çözüldü. pH HCl ile 7,4’e ayarlandı. Son hacim distile su ile 50 ml’ye tamamlandı.

Sodyum-ortovanadate

0,184 gr Na-orthovanadate (#L4390; Sigma), 10 ml Tris (pH:10) (0,1M tris:0,6gr/50ml) ile ateş üzerinde çözüldü.

 Proteaz İnhibitör Kokteyli (#P8340; Sigma)

Uterus ve implantasyon bölgelerinin bulunduğu ependorf tüpleri -80o_C’den

çıkarılarak buz üzerine koyuldu. Dokular tartılarak cam tüpler içerisine alındı ve doku örnekleri, 0.2 gr dokuya 600l liziz tamponu ve 10l proteaz inhibitör kokteyli olacak şekilde inkübe edilerek sonikatör yardımı ile homojenize edildi. Tüm örnekler 15000 g’de +4o_{C’de 10 dakika santrifüj edilerek süpernatant kısımları alındı. Bu lizatların}

içerdiği protein miktarları BCA kiti kullanılarak tespit edildi.

3.3.2. SDS-Poliakrilamid Jel Elektroforezi Kullanılan Solüsyonlar:

 %30 Akrilamid-Bisakrilamid:

15,4 gr 37,5:1 oranındaki akrilamid-bisakrilamid(#161-01-25; Biorad) 40ml distile suda çözüldü.

 4X Tris-HCl/SDS pH=6,8:

6,05 gr Tris (#1.08387.2500; Merck) 40 ml distile su içerisinde çözüldü. pH HCl ile 6,8’e ayarlandı. Distile su ile toplam hacim 100 ml’ye tamamlandı. Üzerine 0,4 gr SDS (#161-0301; Biorad) eklendi.

 4X Tris-HCl/SDS pH=8,8:

18,15 gr Tris (#1.08387.2500; Merck) 40 ml distile su içerisinde çözüldü. pH HCl ile 8,8’e ayarlandı. Distile su ile toplam hacim 100 ml’ye tamamlandı. Üzerine 0,4 gr SDS eklendi.

 %10’luk Amonyum Persülfat (APS):

0,1 gr APS (#7727-54; Amresco) 1 ml distile su içerisinde çözüldü.

 N,N,N’’,N’’’-Tetramethylethylenediamidine(TEMED)(#T-7024; Sigma)

 5X Elektroforez Yürütme Solüsyonu:

9 gr Tris

43,2 gr Glisin (#5.00190.1000; Merck) 3 gr SDS

600 ml distile su içerisinde çözüldü. pH 8,3-8,6 olmalıdır. 1X Elektroforez Yürütme Solüsyonu

5X stok solüsyondan 180 ml alındı ve 720 ml distile su ile 900 ml’ye tamamlandı.

Jel elektroforezi için proteinlerin ağırlıklarına göre belirlenen yüzdede poliakrilamid jel hazırlandı.

 %10’luk Tris-HCl Jel

Ayrıştırıcı (Seperating)Jel:

5,00 ml %30 akrilamid-bisakrilamid 3,75 ml 4X tris-HCl/SDS, pH:8,8 6,25 ml distile su

 %15’lik Tris-HCl Jel

7,5 ml %30 akrilamid-bisakrilamid 3,75 ml 4X tris-HCl/SDS, pH:8,8 3,75 ml distile su

 %7,5’lik Tris-HCl Jel

Ayrıştırıcı (Seperating)Jel:

3,75 ml %30 akrilamid-bisakrilamid 3,75 ml 4X tris-HCl/SDS, pH:8,8 7,5 ml distile su

Hazırlanan solüsyonlar 15 ml’lik falkon tüp içerisinde yukarıdaki oranlarda karıştırıldı ve homojenizasyonu sağlandı. Daha sonra polimerizasyonu sağlayan %10’luk APS’den 0,05 ml, TEMED’ten 0,01 ml eklendi. Hızlı bir şekilde pipetleme yapılarak karıştırıldı iki cam arasına döküldü ve polimerizasyonu sağlandı.

Toplayıcı (Stacking) Jel:

650 µl %30 akrilamid-bisakrilamid 1250 µl 4X tris-HCl/SDS, pH:6,8 3030 µl distile su

Yukarıdaki solüsyonlar 15ml’lik falkon içerisinde karıştırıldı ve pipetleyerek karışım homojenize edildi. Daha sonra polimerizasyonu sağlayacak olan; 25 µl %10’luk Amonyum-persülfat (APS) ve5 µl TEMED solüsyonları eklendi. Seri bir şekilde pipetleme yapıldı ve jel karışımı cam plaka arasına döküldü. Yaklaşık 30 dakika oda ısısında donmaya bırakıldı.

Hazırlanan protein lizatları içerdikleri protein miktarına göre örnekler gerekli miktarda distile su ve lemli ile karıştırıldı ve 5 dakika boyunca 100o_{C’lik suda}

kaynatıldı.

Jeller Western Blot tankının içine yerleştirildi. Tanka elektroforez solusyonu eklenerek her kuyucuğa 10 µl örnek, protein miktarları eşit olacak şekilde konuldu. Tankın kapağı kapatılarak güç kaynağına bağlandı. 100 Volt, 50 miliamperde 80-100 dakika boyunca elektroforez gerçekleştirildi.

Elektroforez bitiminde öncelikle PVDF (polivinilidin diflorür) membran metanolde yaklaşık 30 saniye bekletildi. Daha sonra sırasıyla üst üste 1 adet sünger, 3 adet filtre kâğıdı, jel, 1 adet PVDF membran, 3 adet filtre kâğıdı ve 1 adet sünger olacak şekilde sandviç hazırlandı.

3.3.3. Blotlama

Kullanılan Solüsyonlar:

 Transfer Tampon Solüsyonu (Blotting Buffer):

3 gr Tris 4,3 gr Glisin

800 ml distile su içerisinde çözüldü. pH7,8-8 arsında olmalıdır. Solüsyona daha sonra 200 ml metanol (#1.06009.2500; Merck) eklendi. +4o_{C’de soğutularak}

 10X Tris Tamponlu Tuz (Tris Buffer Saline-TBS) Solüsyonu 60,55 gr Tris (#1.08387.2500; Merck)

87,66 gr Sodyum Klorür (NaCl )(#1.06400.1000; Merck) 800 ml distile su içerisinde çözüldü. pH 7,4’e ayarlandı. 1000 ml’ye distile su ile tamamlandı.

 1X Tris Tamponlu (Tris Buffer Saline-TBS)-Tween 20 Solüsyonu

100 ml 10X TBS solüsyonuna 900 ml distile su eklenerek 1X TBS hazırlandı. Daha sonra 1 litre 1X TBS’e 1 ml Tween-20 (#8.22184.0500; Merck) eklenerek TBS- T çalışma solüsyonu elde edildi.

 Bloklama Solüsyonu: %5’lik Bovine Serum Albumin (BSA)

5 gr BSA 100 ml TBS-T içerisinde çözülerek hazırlandı.

 Bloklama Solüsyonu: %5’lik Süt tozu

5 gr süt tozu 100 ml TBS-T içerisinde çözülerek hazırlandı.

 Chemiluminescent Solüsyonu

Sandviç Western Blot tankına koyularak, üzerine transfer solüsyonu eklendi ve tank güç kaynağına bağlanarak 32 voltta +4o_{C’de gece boyu proteinlerin membrana}

transfer olması sağlandı.

Ertesi gün membran, kullanılacak primer antikorun sulandırıldığı bloklama solüsyonuna göre %1 Tween-20 ilave edilmiş Tris tamponlu tuz solüsyonu (TBS) ile hazırlanan %5’lik yağsız kuru süt tozu ya da %5’lik BSA ile oda ısısında 1 saat çalkalayıcı üzerinde bloklandı. NICD1(1/250) ve NICD2(1/250) primer antikorları %5’lik BSA içinde Hey-1 (1/250) ve Hes-5(1/250) ise %5’lik yağsız kuru süt tozu içinde sulandırılarak membranlar üzerine koyuldu ve gece boyu karıştırıcı üzerinde +4 0_{C sıcaklıkta inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında TBS-T ile 30 dakika}

boyunca 10 dakikada bir TBS-T solüsyonu yenilenerek yıkama yapıldı. Membranlar, primer antikor için uygun olan bloklama solüsyonu ile sulandırılmış horseradish peroksidaz (HRP) konjuge sekonder antikorla Peroxidase labeled Anti Rabbit (1/2000) oda sıcaklığında karıştırıcı üzerinde 1 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında TBS- T ile 30 dakika boyunca 10 dakikada bir TBS-T solüsyonu yenilenerek yıkama yapıldı. Membran SuperSignal Chemiluminisans (CL)-HRP substrat sistemi ile 5 dakika inkübe edildi ve sonrasında karanlık oda içerisinde membranlardaki sinyaller hiperfilme aktarıldı. Film, geliştirici ve tespitten geçirildi ve distile su ile yıkanıp kurutuldu. Böylece, farelerde implantasyon ve desidualizasyon evrelerinde NICD-1 (aktif Notch-1), NICD-2 (aktif Notch-2), Hey-1 ve Hes-5 protein ekspresyon miktarları belirlendi ve kantitatif olarak protein seviyeleri karşılaştırıldı.

BULGULAR