3. GEREÇ VE YÖNTEMLER
3.2. Yöntem
3.2.7. Western Blot Yöntemi ile Sitokin Ölçümü
Deney sonunda toplanan ve filtre edilen medyumlar western blot çalışmasına kadar -80°C’de saklandı. -80°C’ de saklanan Ependorf tüpler içerisindeki hücre kültürü medyumları buz üzerine alınarak erimeleri beklendi.
Medyum içerisindeki proteinler santrifügal konsentratörler yardımıyla konsantre hale getirildi (40 dakika, oda sıcaklığında, 5 bin g’de). Floresan ölçüm yapabilen Qubit2.0 fluorometre cihazı ile medyumların ml’deki protein miktarı bulundu. Her grupta eşit miktarda total protein olacak şekilde proteinler 4:1 oranında örnek tamponuyla eşitlenerek vortekslenip, santrifüj edilerek tekrar buz üzerine konuldu. Daha sonra 5 dakika 95°C’de kaynatılarak tekrar vortekslenip, santrifüj edilerek buz üzerine yerleştirildi. Çalışılacak olan proteinin kilo dalton ağırlığı dikkate alınarak uygun yüzdelerde jeller hazır olarak alındı. Jel, elektroforez tankına yerleştirildi. Jelin her kuyucuğuna, başta 5 µl moleküler ağırlık işaretleyicisi olmak üzere, 20 µl protein içeren örnekler yüklendi. Örnekler kuyucuklardan inene kadar, ilk önce 100 V’ da, sonra 80 V’
da 1,5 saat, oda sıcaklığında jelin sonuna kadar yürütme tamponu içerisinde yürütüldü. Elektroforez işleminden sonra jeldeki proteinler membrana aktarıldı. Nitroselüloz membran TBS-T çözeltisiyle dolu küçük bir kapta, 10 dakika yatay karıştırıcı üzerinde yıkandı. Ardından membran 1 saat süre ile oda ısısında, yatay karıştırıcı üzerinde, TBS-T ile hazırlanan % 5’ lik BSA ile bloklandı. Bloklama işleminden sonra, membran bloklama tamponu ile sulandırılmış birincil antikorla bir gece soğuk ortamda (+4 °C), yatay karıştırıcı üzerinde, muamele edildi. Ertesi sabah membran birincil antikordan alınarak, TBS-T çözeltisiyle dolu kaba aktarılarak 4 kez 5’ er dakika yıkandı. Yıkama işleminden sonra membran bloklama tamponu ile sulandırılmış ikincil antikorla bir saat oda sıcaklığında, yatay çalkalayıcı üzerinde inkübasyonu yapıldı.
İnkübasyon sonrasında tekrar TBS-T ile 4 kez 5’ er dakika yıkandı. Ardından kemuluminisans madde ile 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edilip kemuluminisans görüntüleme yapan cihazla membrandaki protein bantlarının
34
resimleri çekildi. Western blot deneyi sonucunda elde edilen bantlar image studio Lite ver 5.2 programı kullanılarak ölçüldü.
3.2.8. Gerçek Zamanlı PCR Uygulaması ile VEGF mRNA Seviyesindeki Değişimin Saptanması
Gerçek zamanlı PCR çift iplik haline getirilmiş mRNA’ların floresan boyalar veya floresan işaretli problarla miktarını belirlememizi sağlayan bir yöntemdir. Floresan ışıma gerçek zamanlı olarak oluşan DNA miktarına bağlı olarak artmaktadır. Bu yöntemde özgül olmayan tüm çift iplikli DNA’ya bağlanan SYBR Green I gibi floresan boyalar ya da özgül olarak DNA’da belirli bölgelere bağlanabilen hibridizasyon probları kullanılır (Dorak, 2007). Bu çalışmada VEGF mRNA seviyesinin ölçülmesi sırasında her bir hücre grubundan standart yöntemle total RNA izolasyonu yapıldı. Çalışmada, her hücrede sabit miktarda eksprese olduğu bilinen GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gen ekspresyonu temel alınarak VEGF geninin kantitatif (niceliksel) ekspresyon düzeyleri belirlendi. mRNAların elde edilmesinde Qaigen RNeasy Plus RNA izolasyon kiti kullanılmış ve kit protokolü takip edildi.
Elde edilen RNA’dan reverse transkriptaz enzimi kullanılarak cDNA sentezlendi.
Her örnekten 1 μg RNA kullanılarak cDNA (complementer DNA, Tamamlayıcı DNA) sentezi gerçekleştirildi. Gene özgü olarak seçilen primerlerle, hücre örneklerinden elde edilen cDNA’lar amplifiye edilmiş ve referans gene (GAPDH) oranlanarak göreceli (relatif) olarak hedef genin (VEGF) miktarı saptandı.
Gerçek zamanlı PCR deneyleri planlanırken, DNA’ya özgül bağlanan primer probların kullanılmasına karar verildi ve primerler “non-specific” bağlanmayı engelleyecek şekilde dizayn edildi. Deneylerde kullanılan primer dizisi şu şekildedir;
VEGF Reverse 5’-CCAGGAAAGACTGATACAGAACG-3’
Forward 5’-GGTTTCTGGATTAAGGACTGTTC-3’
Deney sonuçlarının analizi sırasında göreceli miktar tayini yapılmıştır.
Göreceli miktar tayini hedefin (VEGF mRNA) konsantrasyonunun belli bir referansın (GAPDH mRNA) konsantrasyonuna oranı olarak ifade edilir. Bu yöntem ile hedef ve referans genin konsantrasyonlarını belirleyebilmek için her ikisine ait standart eğrilerin kullanımına ihtiyaç duyulur. Çalışmamızda gerçek zamanlı PCR sonuçlarımızı yorumlarken, hedef genlerimizin konsantrasyon
35
değerini referans genin konsantrasyon değerine oranlayarak elde ettiğimiz sonuçların diğer gruplara göre ne kadar değiştiği incelendi.
RNA izolasyonu
RNA izolasyonunda Qaigen RNeasy Plus RNA izolasyon kiti kullanıldı ve kit protokolü takip edildi.
Altı ayrı grup oluşturuldu ve deney süresince hücreler transwell sistemde tutuldu.
Deney bitiminde hücrelerin üzerindeki medyumlar sitokin tayini için toplandı.
Hücreler, PBS solüsyonu ve PBS-EDTA solüsyonu ile yıkanarak tripsin yardımı ile zeminden kaldırılmış ve santrifüj tüpüne toplanarak, 1250 rpm’de 5 dakika santrifüj edildi ve süpernatan uzaklaştırıldı.
Hücrelerin üzerine Buffer RTL plus + Beta merkaptoetanol karışımı konularak yavaş yavaş pipetlenmiş ve genomik DNA’yı tutan kolonlara konularak 10000 rpm’de 1,5 dakika santrifüj edildi. Böylece genomik DNA’nın kolonda kalması sağlandı.
Alttaki genomik DNA’nın bulunmadığı lizatın üzerine 350 μl %70’lik etanol eklenerek pipetlenmiş ve pembe renkli kolonlara konularak 10 bin rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
Altta kalan sıvı atılırak kolona 700 μl RW1 eklenmiş, 15 saniye 10 bin rpm de santrifüj edildi ve sıvı yine döküldü.
Pembe kolonların üzerine 500 μl Buffer RPE konuldu, 14 bin rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
Daha sonra pembe kolonlar yeni bir toplama tüpünün üzerine konuldu aynı işlem tekrarlanarak 14 bin rpm’de 3 dakika santrifüj edildi.
36
Kolon yeni bir toplama tüpüne konularak, hiçbir şey eklemeden kuruması için 14 bin rpm’de 1 dakika santrifüj edildi.
Kolon yeni temiz Ependorf tüpü içerisine yerleştirildikten sonra üzerine 40μl RNAz bulunmayan su tam orta kısıma gelecek şekilde dikkatlice eklendi ve 10 bin rpm’de 1,5 dakika santrifüj edildi.
Üstteki kolon atılarak, altta kalan RNA’lar nano dropta ölçüldü ve gerçek zamanlı PCR için işlem yapılana kadar -80oC’de saklandı.
RNA konsantrasyonunun hesaplanması
RNA’nın miktarı ve saflığını belirlemek amacıyla izole edilen RNA nanodrop cihazında ölçülerek 1 ngr DNA’ya ulaşacak şekilde DNAz ve RNAz bulunmayan su ile seyreltildi.
cDNA sentezi
cDNA sentezi için, toplam hacim 20 μl olacak şekilde reaksiyon hazırlandı ve cDNA sentez işlemi palm cycler cihazında yapıldı. cDNA sentezi için kullanılan karışım içeriği aşağıdaki şekildedir;
Elde edilen cDNA’lar rt-PCR’da kullanılıncaya kadar -20 oC’de saklandır.
Karışım Miktar( μl )
Quantiscript reverse transcriptase 1 Quantiscript reverse transcriptase Buffer 4 Reverse transcriptase primer mix 1
RNA 14
Toplam 20
37 Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR
Yukarıda anlatıldığı şekilde elde edilen cDNA’lar, PCR reaksiyonunun kurulmasında kullanıldı. VEGF ve GAPDH genleri için aşağıda belirtilen miktarları içeren temel karışım hazırlandı.
Elde edilen sonuçların istatistiksel değerlendirmelerinde SPSS statistics 21 programı kullanıldı. Verilerin analizinde elde edilen tüm sonuçların ortalamaları karşılaştırılmalı olarak değerlendirilmiştir.
3.2.9. İstatistiksel Analiz
İstatistiksel değerlendirmeler IBM SPSS Statistics 21 paket programı ile yapıldı. P<0,05 değeri anlamlılık düzeyi olarak kabul edildi. Verilerin normal dağılıma uygunluğu Shapiro-Wilk testi ile araştırıldı. Tüm deney verilerinin normal dağılım gösterdiği belirlendi ve parametrik testler uygulandı. İkiden fazla grup ortalamasının karşılaştırılmasında tek yönlü varyans analizi, bağımsız iki grubun karşılaştırılmasında ise bağımsız gruplar t-testi kullanıldı.
Varyansların homojenliği Levene testi ile ölçüldü. Varyansların homojen olduğu durumlarda da Tukey HSD çoklu karşılaştırma testi yapıldı.
Karışım Miktar( μl )
Primer prob 10
Master Mix 1
RNase Free Water 4
cDNA 5
Toplam 20
38
4. BULGULAR
4.1. Resveratrolün A549 Akciğer Kanser Hücreleri ve MKH’lerdeki Güvenli Dozunun MTT Testiyle Değerlendirilmesi
A549 hücreleri ve MKH’lerin canlılığı 72. saatte mitokondriyal dehidrogenaz aktivitesine dayalı MTT deneyi ile belirlendi. Sonuçlar Şekil 4.1 ve Şekil 4.2’de gösterilmektedir.
Şekil 4.1: Resveratrolün A549 kanser hücresi canlılığı üzerine etkisinin mitokondrial aktiviteye göre değerlendirilmesi. Ölçümler 72 saatlik deney süresince artan resveratrol konsantrasyonlarında büyütülen A549 kanser hücrelerinde yapılmıştır. Kontrol grubu 100 olarak kabul edilmiştir. 1 µM resveratrol 72 saatlik deney süresince A549 kanser hücrelerinde güvenli doz olarak bulunmuştur. = Güvenli doz. Güvenli doz canlılık oranının kontrol grubuna benzer olduğu gruptur.
39
Şekil 4.2: Resveratrolün MKH canlılığı üzerine etkisinin mitokondrial aktiviteye göre değerlendirilmesi. Ölçümler 72 saatlik deney süresince artan resveratrol konsantrasyonlarında büyütülen MKH’lerde yapılmıştır. Kontrol grubu 100 olarak kabul edilmiştir. 1 µM resveratrol 72 saatlik deney süresince MKH’de güvenli doz olarak bulunmuştur. = Güvenli doz. Güvenli doz canlılık oranının kontrol grubuna benzer olduğu gruptur.
Resveratrolün MKH ve A549 kanser hücresi üzerine sitotoksik etkisini belirlemek amacıyla yapılan MTT testine göre; 72 saatlik deney süresi sonunda artan dozla beraber resveratrolün A549 kanser hücrelerinde yüksek toksik etkilere sahip olduğu bulundu. Resveratrolün A549 kanser hücrelerinde 1,25 µM’dan itibaren toksisite gösterdiği, yüksek doz olarak belirlenen 30 µM’da canlılığın yaklaşık olarak % 49 oranında azaldığı gözlendi. 1 µM resveratrol uygulanan A549 kanser hücrelerinde canlılığın kontrol grubuna benzer olduğu, 1 µM resveratrolün 72 saatlik deney süresince A549 kanser hücreleri için güvenli doz olduğu bulundu (Şekil 4.1).
MKH ile yapılan MTT deneylerinde artan dozla beraber resveratrolün MKH’lerin proliferasyonunu 5 µM dozuna kadar arttırdığı, 5µM’dan sonra ise
40
resveratrolün 10,15,20,25,30 µM uygulanan hücrelerde doz artışıyla beraber sitotoksisite gösterdiği bulundu. Yüksek doz olarak belirlenen 30 µM’da canlılığın yaklaşık olarak % 42 oranında azaldığı gözlendi. Deneyimizde A549 kanser hücreleri ve MKH’ler transwell insert sistemiyle aynı ortamda ekileceğinden ikisi içinde ortak güvenli doz 1 µM resveratrol olarak belirlendi (Şekil 4.2).
4.2. Resveratrolün A549 Kanser Hücreleri ve MKH’lerdeki Güvenli Dozunun Lizozomal Aktiviteye Dayanan Nötral Kırmızı Up-Take Ölçüm Testiyle Değerlendirilmesi
A549 hücreleri ve MKH’lerin canlılığı 72. Saatte lizozomal aktiviteye dayanan Neutral Red Up-Take ölçüm testiyle belirlendi. Sonuçlar Şekil 4.3 ve Şekil 4.4’de gösterilmektedir.
Şekil 4.3: Resveratrolün A549 kanser hücresi canlılığı üzerine etkisinin lizozomal aktiviteye dayanan nötral kırmızı up take ölçüm testine göre değerlendirilmesi. Ölçümler 72 saatlik deney süresince artan resveratrol konsantrasyonlarında büyütülen A549 kanser hücrelerinde yapılmıştır. Kontrol grubu 100 olarak kabul edilmiştir. 1 µM resveratrol 72 saatlik deney süresince A549 kanser hücrelerinde güvenli doz olarak bulunmuştur. = Güvenli doz.
Güvenli doz canlılık oranının kontrol grubuna benzer olduğu gruptur.
41
Şekil 4.4: Resveratrolün MKH canlılığı üzerine etkisinin lizozomal aktiviteye dayanan nötral kırmızı up take ölçüm testine göre değerlendirilmesi. Ölçümler 72 saatlik deney süresince artan resveratrol konsantrasyonlarında büyütülen MKH’de yapılmıştır. Kontrol grubu 100 olarak kabul edilmiştir. 1 µM resveratrol 72 saatlik deney süresince MKH’de güvenli doz olarak bulunmuştur. = Güvenli doz. Güvenli doz canlılık oranının kontrol grubuna benzer olduğu gruptur.
Nötral kırmızı Up-take ölçüm testi lizozomal aktiviteye dayanan hücre canlılığını belirlemede kullanılan bir sitotoksisite testidir. Nötral red testine göre 72 saatlik deney süresi sonunda artan dozla beraber resveratrolün A549 kanser hücrelerinde yüksek toksik etkilere sahip olduğu bulundu. Neutral red sonuçları MTT deneyi ile paralellik gösterdi. Resveratrolün A549 kanser hücrelerinde 1,25 µM’dan itibaren toksisite gösterdiği yüksek doz olarak belirlenen 30 µM’da canlılığın yaklaşık olarak %38 oranında azaldığı gözlendi.
1 µM resveratrol uygulanan A549 kanser hücrelerinde canlılığın kontrol grubuna benzer olduğu, 1 µM resveratrolün 72 saatlik deney süresince A549 kanser hücreleri için güvenli doz olduğu bulundu (Şekil 4.3).
MKH ile yapılan nötral kırmızı deneylerinde artan dozla beraber resveratrolün MKH’lerin proliferasyonunu 5 µM dozuna kadar arttırdığı, 5µM dan sonra ise resveratrolün 10,15,20,25,30 µM uygulanan hücrelerde doz
42
artışıyla beraber sitotoksisite gösterdiği bulundu. Yüksek doz olarak belirlenen 30 µM’da canlılığın yaklaşık olarak %23 oranında azaldığı gözlendi.
Deneyimizde A549 hücreleri ve MKH’ler transwell insert sistemiyle aynı ortamda ekileceğinden ikisi içinde ortak güvenli doz 1 µM resveratrol olarak belirlendi (Şekil 4.4).
4.3. Resveratrolün ve MKH’lerin A549 Kanser Hücreleri Üzerine Apoptotik Etkilerinin DAPI Boyasıyla Belirlenmesi
Apoptotik etkinin belirlenmesi için DAPI floresan boyama yapıldı. DAPI adenin timin nükleotidlerinden zengin çift zincirli DNA’ya bağlanan floresan bir boyadır. DAPI boyama A549, A549+MKH, A549+MKH+resveratrol ve A549+resveratrol gruplarında yapıldı. Bu dört grupta A549 kanser hücreleri boyandı. Grupları temsil eden floresan mikroskop görüntüleri şekil 4.5’de gösterildi.
43
Şekil 4.5: Resveratrolün ve MKH’lerin A549 kanser hücreleri üzerine apoptotik etkilerinin DAPI boyasıyla belirlenmesi. Normal yapıda hücre çekirdekleri görülmektedir, apoptotik cisim oluşumu görülmemektedir (Bar= 100 μm, DAPI boyaması).
DAPI boyaması sonucu elde edilen verilere göre; A549, A549+MKH, A549+MKH+resveratrol ve A549+resveratrol gruplarında hücre çekirdek morfolojilerinin benzer olduğu, apoptotik cisim oluşumlarının gözlenmediği tespit edildi.
44
4.4. IL-6, VEGF, CCL5 ve SDF-1 Sitokinlerinin ELISA Yöntemiyle Değerlendirilmesi
Deney sonunda hücre kültüründen elde edilen medyumlar sitokin ölçümünde kullanıldı. Altı ayrı gruptan alınan medyumlarda IL-6, VEGF, CCL5 ve SDF-1 sitokinlerinin varlığı ve miktarı araştırıldı.
4.4.1. ELISA Yönteminden Elde Edilen IL-6 Sonuçları
Hücrelerin 3 gün sonunda kültür ortamına salgıladıkları sitokinler içerisinde IL-6 miktarına baktığımızda; istatiksel olarak her grubun birbirinden farklı olduğu bulundur. Bu gruplar içerisinde;
MKH grubunun, A549 grubuna göre daha fazla IL-6 sitokini salgıladığı, bunun da istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulundu (p<0,05).
MKH ve A549’un aynı ortama ekildiği grupta IL-6 miktarının, iki grubun ayrı ayrı salgıladıklarından daha fazla miktarda salgılandığı bulundu. Bu artış istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,05). Bu sonuç MKH ve A549 kanser hücresinin aynı ortamda bulunmasının, IL-6 salınımını ikisinin toplamından daha fazla oranda arttırdığını göstermektedir.
Sitotoksisite testleri sonucunda 1 µM resveratrol iki hücre hattı için de güvenli doz olarak bulundu. 1µM resveratrolün A549+MKH grubunun IL-6 salınımını istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde düşürdüğü gözlendi (p<0,05).
Yalnız MKH grubuna 1µM resveratrol verildiğinde bunun IL-6 miktarını anlamlı bir şekilde düşürdüğü saptandı (p<0,05).
Yalnız A549 grubuna 1µM resveratrol verildiğinde bunun da IL-6 miktarını anlamlı bir şekilde düşürdüğü bulundu (p<0,05).
Gruplar arası IL-6 miktar değişimleri Tablo 4.1 ve Şekil 4.6’ da verilmiştir.
IL-6 ELISA deneyinin standart grafiği Şekil 4.7’de verilmiştir.
45
Tablo 4.1: Gruplardan elde edilen medyumlardaki IL-6 miktarları (pg/mL).
Grup Ortalama ± Standart Sapma
A549 69±0,75
MKH 998 ± 0,78
A549+MKH 1591 ± 0,75
A549+MKH+Resveratrol 1550 ± 0,81
A546+Resveratrol 63 ± 0,56
MKH+Resveratrol 901 ± 0,21
Şekil 4.6: Gruplara göre IL-6 miktarları (pg/mL).
Şekil 4.7: IL-6 standart grafiği.
46
4.4.2. ELISA Yönteminden Elde Edilen VEGF Sonuçları
Hücrelerin 3 gün sonunda kültür ortamına salgıladıkları sitokinler içerisinde VEGF miktarına baktığımızda, VEGF miktar değişiminin IL-6 sitokinine benzer olduğu bulundu. İstatiksel olarak her grubun birbirinden farklı olduğu bulundu. Bu gruplar içerisinde;
MKH grubunun, A549 grubuna göre daha fazla VEGF sitokini salgıladığı, bunun da istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulundu (p<0,05).
MKH ve A549’un aynı ortama ekildiği grupta VEGF miktarının, iki grubun ayrı ayrı salgıladıklarından daha fazla miktarda salgılandığı bulundu. Bu artış istatistiksel olarak anlamlıydı (p<0,05). Bu sonuç MKH ve A549 kanser hücresinin aynı ortamda bulunmasının, VEGF salınımını ikisinin toplamından da fazla miktarda arttırdığını göstermektedir.
Sitotoksisite testleri sonucunda 1 µM resveratrol iki hücre hattı için de güvenli doz olarak bulunmuştur. 1µM resveratrolün A549+MKH grubunun VEGF salınımını istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde düşürdüğü saptandı (p<0,05).
Yalnız MKH grubuna 1µM resveratrol verildiğinde bunun VEGF miktarını anlamlı bir şekilde düşürdüğü gözlendi (p<0,05).
Yalnız A549 grubuna 1µM resveratrol verildiğinde bunun da VEGF miktarını anlamlı bir şekilde düşürdüğü bulundu (p<0,05).
Gruplara göre VEGF miktar değişimleri Tablo 4.2 ve Şekil 4.8’ de verilmiştir.
VEGF ELISA deneyinin standart grafiği Şekil 4.9’da verilmiştir.
47
Tablo 4.2: Gruplardan elde edilen medyumlardaki VEGF miktarları (pg/mL).
Şekil 4.8: Gruplara göre VEGF miktarları (pg/mL).
Grup Ortalama ± Standart Sapma
A549 42,27 ± 0,25
MKH 259,27 ± 0,49
A549+MKH 1059,40 ± 0,46
A549+MKH+Resveratrol 982,17 ± 0,47
A546+Resveratrol 35,27 ± 0,38
MKH+Resveratrol 127,23 ± 0,32
48 Şekil 4.9: VEGF standart grafiği.
4.4.3. ELISA Yönteminden Elde Edilen SDF-1 ve CCL5 Sonuçları Yapılan ELISA deneyleri sonucunda CCL-5 ve SDF-1 sitokinleri tespit edilemedi. ELISA deneyleri sonucunda sitokinlere ait kitten çıkan sitokin standartları pozitif reaksiyon verirken gruplarda reaksiyon görülmedi. Veriler Şekil 4.10- 4.13’de gösterilmiştir.
49
Şekil 4.10: SDF-1 standart grafiği. Şekil 4.11: SDF-1 ELISA plakası. 1. kolonda görünen azalan konsantrasyondaki SDF-1 standartıdır. Deney örneği yüklenen diğer kuyucuklarda reaksiyon gerçekleşmemiştir.
Şekil 4.12: CCL-5 standart grafiği. Şekil 4.13: CCL-5 ELISA plakası. 1. kolonda görünen azalan konsantrasyondaki CCL-5 standartıdır. Deney örneği yüklenen diğer kuyucuklarda reaksiyon gerçekleşmemiştir.
50
4.5. IL-6, VEGF, CCL5 ve SDF-1 Sitokinlerinin Western Blot Yöntemiyle Değerlendirilmesi
Deney sonunda kültür kaplarının alt yüzeyine yapışmış hücrelerin üzerinde bulunan medyumlar toplanmış, filtre edilmiş ve western blot çalışmaları için stoklanmıştı. Bu medyumlar kültürü yapılan hücrelerin çevrelerine salgıladıkları sitokinleri içermektedir. Bu medyunlar hem ELISA hem de western blot deneylerinde kullanıldı. Altı ayrı gruptan alınan medyumlarda IL-6, VEGF, CCL5 ve SDF-1 sitokinlerinin varlığı ve miktarı western blot yöntemiyle araştırıldı.
4.5.1. Western Blot Yönteminden Elde Edilen IL-6 Sonuçları
IL-6 sitokininin gruplara göre western blot sonuçlarına bakıldığında;
IL-6’nın MKH grubunda A549 grubuna göre 1,66 kat daha fazla salgılandığı saptandı.
A549 ve A549+MKH grupları karşılaştırıldığında ise IL-6’nın A549+MKH grubunda 2,69 kat daha fazla salgılandığı gözlendi.
MKH ve A549+MKH grupları karşılaştırıldığında ise IL-6’nın A549+MKH grubunda 1,62 kat daha fazla salgılandığı bulundu.
A549+MKH ve A549+MKH+resveratrol grupları karşılaştırıldığında resveratrolün IL-6 salınımını 1,33 kat azalttığı saptandı.
A549 ve A549+resveratrol gruplarında ise resveratrolün IL-6 salınımını 1,41 kat azalttığı gözlendi.
MKH ve MKH+resveratrol grupları karşılaştırıldığında resveratrolün IL-6 ifadesini 1,72 kat azalttığı bulundu.
Gruplar arası IL-6 miktar değişimleri Şekil 4.14’ de verilmiştir.
51
Şekil 4.14: Gruplara göre IL-6 miktarının cihaz renk birimine göre değişimi.
52
4.5.2. Western Blot Yönteminden Elde Edilen VEGF Sonuçları
VEGF sitokininin gruplar arası western blot sonuçlarına bakıldığında;
VEGF’nin MKH grubunda A549 grubuna göre 1,32 kat daha fazla salgılandığı bulundu.
A549 ve A549+MKH grupları karşılaştırıldığında ise VEGF’nin A549+MKH grubunda 3,02 kat daha fazla salgılandığı saptandı.
MKH ve A549+MKH grupları karşılaştırıldığında ise VEGF’nin A549+MKH grubunda 2,28 kat daha fazla salgılandığı gözlendi.
A549+MKH ve A549+MKH+resveratrol grupları karşılaştırıldığında resveratrolün VEGF’nin salınımını 1,44 kat azalttığı bulundu.
A549 ve A549+resveratrol gruplarında ise resveratrolün VEGF’nin salınımını 1,48 kat azalttığı saptandı.
MKH ve MKH+resveratrol grupları karşılaştırıldığında resveratrolün VEGF ifadesini 1,41 kat azalttığı gözlendi.
Gruplar arası VEGF miktar değişimleri Şekil 4.15’ de verilmiştir.
53
Şekil 4.15: Gruplara göre VEGF miktarının cihaz renk birimine göre değişimi.
54
4.5.3. Western Blot Yönteminden Elde Edilen SDF-1 ve CCL5 Sonuçları
ELISA yönteminden elde edilen verilere paralel bir şekilde western blot deneyinde de SDF-1 ve CCL-5 sitokinleri tespit edilememiştir.
4.6. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Uygulaması ile VEGF mRNA Seviyesindeki Değişimin Değerlendirilmesi
Üç gün süreyle 6’lı plakalarda büyütülen hücreler deney sonunda kaldırılarak ticari kitle total RNA izolasyonu ve ardından rt-PCR deneyi yapıldı.
Gruplar arası VEGF gen ekspresyon seviyesi ölçüldü. VEGF mRNA seviyesinin ELISA ve western blot deney sonuçlarıyla paralellik gösterdiği bulundu.
A549+MKH grubuna 3 gün süreyle 1µM resveratrol uygulandığında VEGF mRNA ifade miktarının azaldığı gözlendi.
Resveratrolün ayrı ayrı hem A549 hem de MKH gruplarında anlamlı bir şekilde VEGF mRNA ifade miktarını azalttığı saptandı.
MKH grubunun kanser grubuna kıyasla daha fazla VEGF mRNA ifade ettiği bulundu.
Gruplara göre VEGF mRNA miktar değişimleri Şekil 4.16’ da verilmiştir.
55
Grafik 4.16: VEGF mRNA seviyesindeki miktar değişimi.
56
5. TARTIŞMA
Kök hücreleri diğer hücrelerden ayıran en önemli özelliği farklılaşmadan kendilerini uzun yıllar yenilemeleri ve fizyolojik veya doğal koşullarda istenilen hücreye doğru farklanmalarının uyarılabilmesidir. Kök hücre çalışmalarında genelde iki tip kök hücre kullanılır bunlardan birincisi in vitro fertilizasyon çalışmalarında ihtiyaç duyulmayan ve sahipleri tarafından bilimsel çalışmalarda kullanılmak üzere bağışlanan embriyolardan izole edilenlerdir, ikincisi ise hem fötal hem de yetişkin dokudan izole edilebilen Mezenşimal kök hücrelerdir. Bu iki kök hücreye ilaveten son dönemlerde somatik hücreden oluşturulan uyarılmış pluripotent kök hücre de kök hücre çalışmalarında yerini almaktadır (Al‐Daccak & Charron, 2015).
Mezenşimal kök hücreler mezodermden köken alan multipotent kök hücrelerdir. Deneysel ve fizyolojik koşullarda birçok hücreye dönüştürülebilirler. MKH’ler yetişkin ve fötal kaynakların birçoğundan izole edilebilir. MKH’ler fibroblast benzeri hücre gövdesinden ince uzantılar çıkan ökromatik ve merkezde büyük bir çekirdeğe sahip hücrelerdir. İlk olarak kemik iliğinde bulunmuş ve 3 mezodermal kökenli dokuya (yağ, kıkırdak ve kemik) farklandığı gösterilmiştir. Daha sonraki çalışmalar bu multipotent hücrenin her dokuda (yağ, kordon kanı, plasenta, plasenta villusları, amniyon sıvısı, periferik kan ve karaciğer gibi) bulunabileceğini doku hasarı oluştuğunda doku yenilenmesinde görev aldığı ve kan dokuyla ihtiyaç duyulan alana göç ettiği gösterilmiştir (Bobis et al., 2007; Nicolay, Lopez Perez, Debus, & Huber, 2015).
Hücresel tedaviler rejeneratif tıbbın bir türüdür. Günümüzde hücresel tedavilerde en çok kullanılan kök hücre türü hematopoietik kök hücredir.
Hücresel tedavilerde en etkili tedavi gösteren kök hücre ise embriyonik kök hücredir. Embriyodan izolasyonu etik nedenlerle sorunlu olan bu hücrenin kullanımı sınırlıdır. Embriyonik kök hücrelerin teratoma oluşturma riski de oldukça fazladır. Embriyonik kök hücrelerin hücresel tedavilerdeki bu limitli kullanımı, etik ve teratomlar açısından herhangi bir riski bulunmaması mezenşimal kök hücreleri hücresel tedavilerde ilgi odağı haline getirmektedir (Trounson & McDonald, 2015; Wei et al., 2013).
MKH’lerle ilgili ilk klinik çalışma 1995 yılında yapılmış ve bundan sonra giderek artmıştır. 2015 Nisan ayı itibariyle http://clinicaltrials.gov adresine
57
girilmiş çeşitli faz basamaklarında (Faz I, Faz II ve Faz III) MKH’lerle ilgili 490
girilmiş çeşitli faz basamaklarında (Faz I, Faz II ve Faz III) MKH’lerle ilgili 490