A interação planta-patógeno tem sido extensivamente estudada ao longo dos últimos anos, envolvendo tanto o ponto de vista do hospedeiro como do parasita. Com o aumento dos estudos genômicos e pós-genômicos, uma grande quantidade de informação está disponível (RENSINK e BUELL, 2005; VARSHNEY et al., 2009; MOCHIDA e SHINOZAKI, 2010) e avanços foram conseguidos no entendimento dos mecanismos de defesa das plantas, bem como, nas estratégias de patogenicidade empregadas por microrganismos (MEHTA et al., 2008).
Contudo, é possível constatar que os dados de expressão genética por si só não revelam a completa complexidade de respostas moleculares a perturbações, tal como o ataque de patógenos e, desse modo, o nível da expressão dos transcritos nem sempre é correlacionada com o padrão celular das proteínas expressas (PIQUES et al., 2009; BAERENFALLER et al., 2012). Tal perspectiva é justificada pelo fato de que alterações no comportamento celular podem ser reguladas por proteínas pré-existentes, que são modificadas pós-traducionalmente ou são degradadas, além disso, a possibilidade de variações no processamento do RNAm, por splicing alternativo, permite a expressão de proteínas divergentes a partir de uma mesma sequência gênica (QUIRINO et al., 2010). Levando em consideração que a interação planta- patógeno envolve mecanismos moleculares associados a eventos de sinalização celular, que culminam com cascatas de síntese, degradação e fosforilação de proteínas (DÓCZI et al., 2007; JONES et al., 2006), a identificação de proteínas expressas pela planta após o desafio de patógenos pode fornecer uma continuidade experimental com a informação contida no genoma, permitindo a compreensão dos detalhes sobre as cascatas de sinalização envolvidas na interação entre hospedeiros e fitopatógenos (MEHTA et al., 2008; QUIRINO et al., 2010).
O termo proteoma é definido como o conjunto de protéinas expressas pelo genoma de uma célula, sob condições específicas. E a proteômica, conjunto de metodologias utilizadas para caracterizar um proteoma, permite determinações qualitativas ou quantitativas de um grande número de proteínas envolvidas no metabolismo celular (CAO et al., 2008; ELVIRA et al., 2008). Nos últimos anos, a proteômica tem desempenhado um papel fundamental na identificação de alterações nos níveis de proteínas em plantas hospedeiras sob infecção por organismos patogênicos, e na caracterização de fatores celulares e extracelulares de virulência produzidos por patógenos (LODHA et al., 2013).
Estudos proteômicos são iniciados com a preparação da amostra, por meio da extração de proteínas do conteúdo celular. Em plantas, este processo é particularmente desafiador, uma vez que células vegetais são ricas em constituintes, tais como polissacarídeos da parede celular e polifenóis, além de proteases e enzimas oxidativas, cuja atividade pode interferir na integridade do extrato protéico (ISAACSON et al., 2006; QUIRINO et al., 2010). A dominância de certas proteínas, como a rubisco (ribulose-1,5-bifosfato carboxilase-oxigenase) em folhas ou proteínas de armazenagem em sementes, pode comprometer a resolução de proteínas de baixa abundância (JONES et al., 2004; CHEN e HARMON, 2006).
O aperfeiçoamento dos métodos de extração de proteínas do tecido vegetal tem sido baseado no uso de diferentes passos, incluindo inicialmente, a escolha de diferentes tampões de extração para amostras específicas, seguida de precipitação para concentrar proteínas e eliminar compostos interferentes e, por fim, uma etapa de solubilização (ROCHA et al., 2005; PAVOKOVIĆ et al., 2012). Muito dos protocolos, frequentemente empregados com sucesso, utilizam para este fim a extração com ácido tricloroacético (TCA)/acetona e fenol-Tris, seguido por precipitação com acetato de amônio/metanol (SARAVANAN e ROSE, 2004; WANG et al., 2006; FAUROBERT et al, 2007; PAVOKOVIĆ et al., 2012). Como nenhum único protocolo de extração de proteínas pode capturar o proteoma completo, protocolos têm sido otimizados para determinados tecidos, e conforme objetivos da pesquisa (MALDONADO et al., 2008).
A eletroforese bidimensional (2D-PAGE) é atualmente um dos métodos mais comumente utilizados em estudos proteômicos (QUIRINO et al., 2010; GAUCI et al., 2013). Nesta técnica, as proteínas da amostra de interesse são inicialmente separadas pelo seu ponto isoelétrico (pI), na primeira dimensão, por meio da focalização isoelétrica, e posteriormente, pela sua massa molecular na segunda dimensão (SDS-PAGE). A combinação dessas duas etapas possibilita a separação de milhares de proteínas, culminando com a construção de ricos mapas protéicos (ANDRADE, 2006).
Na 2D-PAGE, proteínas podem ser visualizadas em baixas concentrações por spot, e esta visualização direta permite o controle da qualidade e reprodutibilidade do processo de preparação da amostra (SMITH, 2009). Contudo, a principal razão da popularidade da eletroforese bidimensional reside na facilidade da análise quantitativa de proteínas intactas. Por quantificar a expressão das proteínas na imagem de gel 2D, é possível realizar experimentos comparativos, por exemplo, detectando diferenças quantitativas e qualitativas
entre proteínas expressas em diferentes condições, amostras saudáveis versus doentes (ROGOWSKA-WRZESINSKA et al., 2013) e, mais especificamente, no contexto da defesa, plantas infectadas ou não com determinado invasor, a fim de entender a complexidade de interações planta-patógeno (LODHA et al., 2013).
Para uma maior confiabilidade dos dados gerados em experimentos proteômicos, amostras biológicas, bem como, repetições técnicas são comparadas usando vários programas computacionais (por exemplo, PDQuest, BioNumerics, ImageMaster etc). Spots proteicos no gel, considerados diferencialmente expressos com base na análise estatística dos géis, são excisadas e processados para identificação por análise de espectrometria de massas (QUIRINO et al., 2010).
A habilidade de uso de dados de espectrometria de massas (MS), inerentes a peptídeos, para identificação de proteínas em bancos de dados é considerada uma das forças que impulsiona a análise de proteomas (CANTÚ et al., 2008a). A MS é uma técnica sensível e rápida, capaz de determinar a massa de moléculas, a partir da relação entre a massa e a carga (m/z) de espécies ionizadas em fase gasosa (AEBERSOLD e MANN, 2003; CUNHA et al., 2006). O espectrômetro de massas é um instrumento formado por uma fonte de íons, um analisador de massas, um detector e um sistema de aquisição de dados. Atualmente, analisadores de massas podem ser acoplados entre si, permitindo a ocorrência de experimentos em sequência (MS/MS), sendo possível detectar determinado peptídeo e, em seguida, submetê-lo a uma etapa de fragmentação, com consequente determinação da sequência de aminoácidos (CANTÚ et al., 2008a).
Dados referentes à massa molecular dos peptídeos originados da digestão enzimática (Peptide Mass Fingerprint - PMF), assim como, a informação referente à sequência de aminoácidos dos peptídeos fragmentados (MS/MS), são comparados por bioinformática com um banco de dados contendo sequências de proteínas conhecidas ou o genoma do organismo (CHAMRAD et al., 2004; ELIAS et al., 2005). Isto é alcançado, por meio de programas, tais como, MASCOT, Phenyx e OMSSA. Estes programas tem a capacidade de simular as sequências primárias potenciais das proteínas, baseados na suposta predição da informação contida em bancos de genes, e posteriormente, clivam teoricamente estas supostas proteínas em peptídeos, calculando a massa absoluta dos peptídeos a partir de cada proteína. Portanto, eles comparam massas de peptídeos da proteína alvo de estudo, desconhecida, à massa teórica
de peptídeos da proteína depositada em cada base de dados (CANTÚ et al., 2008a; QUIRINO et al., 2010).
Recentes revisões têm demostrado à contribuição de estudos proteômicos na revelação de detalhes sobre cascatas de sinalização e mecanismos moleculares envolvidos na interação de plantas e patógenos (CURTIS, 2007; CHENG et al., 2010; BHADAURIA et al., 2010; FERNÁNDEZ et al., 2010). Em algumas das pesquisas, a complexidade da amostra proteica tem sido reduzida pelo uso da proteômica subcelular, baseada em estudos de proteínas presentes em certos compartimentos celulares, tais como cloroplastos (Arai et al., 2008), mitocôndrias (BRUGIERE et al., 2004), núcleo (PANDEY et al., 2008), vacúolo (JAQUINOD et al., 2007) e parede celular (JAMET et al., 2008). A presença de certas proteínas, como β-glicosidases e mirosinases, cuja localização nos peroxissomos de folhas era anteriormente desconhecida, permitiu inferir o proposto papel destas organelas na defesa contra patógenos e herbívoros (REUMANN et al., 2007).
Os dados de estudos proteômicos aliados às análises de validação funcional, podem fornecer importantes contribuições na compreensão dos mecanismos complexos da interação planta-patógeno. De acordo com esta perspectiva, o primeiro passo no entendimento da incompatibilidade à doença está associado com identificação das proteínas expressas, durante as interações planta-patógeno, seguindo, passos subsequentes de determinação de quais proteínas conferem suscetibilidade ou resistência à doença, e os mecanismos atrelados a este condicionamento (MEHTA et al., 2008). Todo este processo é bastante complexo e, em virtude disto, alguns bons exemplos dessas informações podem ser integrados em estratégias de melhoramento de culturas (VANDERSCHUREN et al., 2013).