Verimlilik Açısından Değerlendirilmesi

La souche utilisée est Pseudomonas aeruginosa PAO1 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France). La conservation, l’entretien, l’identification et les dénombrements des UFC sont réalisés selon les indications du chapitre II.

VI-2-Lignée cellulaire

VI-2-1-Origine

La lignée cellulaire utilisée pour les tests de cytotoxicité et d’adhésion bactérienne aux cellules est la lignée MRC-5 (ATCC-CCL-171 : lot 3929229). Elle a été obtenue auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC). Il s’agit d’une lignée de fibroblastes pulmonaires humains d’origine cancéreuse.

VI-2-2-Entretien

VI-2-2-1-Milieux et réactifs

- Acides Aminés Non Essentiels (NEAA Lonza®) - Bleu trypan (Sigma®)

- Diméthylsulfoxide (Sigma®)

- DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – Lonza®) - L-glutamine (Lonza®)

- PBS (Tampon Phosphate à 0,0067M en PO42-, Lonza®) - Sérum de veau fœtal (SVF) (Lonza®)

- Sodium Dodecyl Sulfate (Sigma®)

- Trypsine-EDTA (Trypsine-Ethylenediaminetetraacetic acid, Lonza®)

VI-2-2-2-Méthode

La lignée de cellules pulmonaires est conservée à –195°C dans l’azote liquide dans un mélange contenant du sérum de veau fœtal (SVF) décomplémenté (concentration finale 90%) et du Diméthylsulfoxyde (DMSO) (concentration finale 10%) à raison d’une concentration cellulaire comprise entre 5.106 et 1.107 cellules/mL. Avant chaque essai, les cellules sont mises à incuber à 37°C sous 5% de CO2 dans du milieu de culture DMEM supplémenté avec une solution d’acides aminés non essentiels (concentration finale à 1%), de la L-glutamine (concentration finale à 2mM/mL) et un mélange pénicilline-streptomycine (concentration finale à 10 unités internationales/mL) et du SVF décomplémenté (concentration finale 10%).

Après 48 heures de culture en flacon, les cellules deviennent confluentes et forment un tapis cellulaire en monocouche. Le milieu de culture est éliminé et le tapis cellulaire est lavé une fois avec du tampon phosphate avant d’ajouter 5mL de trypsine-EDTA (enzyme protéolytique) afin de décoller les cellules du flacon. La culture est mise à incuber 5 minutes à 37°C jusqu’à ce que le tapis commence à se détacher du flacon. Les cellules sont mises en suspension dans 10mL de milieu de culture complet (10% SVF) et centrifugées à 1600 rpm pendant 5 minutes à 20°C. Le culot cellulaire obtenu est récupéré et mis en suspension dans 1 mL de milieu de culture complet.

Après un test de viabilité cellulaire au bleu trypan en cellule de Malassez:

♦ une partie de la suspension cellulaire est ajustée à 1.105 cellules/mL dans 20mL de milieu DMEM supplémenté avec 10% SVF pour le repiquage cellulaire en flacon de culture,

♦ l’autre partie est ajustée à 2.105 cellules /mL dans un volume suffisant pour déposer 100µL dans chaque puits d’une plaque de 96 puits pour le test de cytotoxicité ou 500µL dans chaque puits d’une plaque de 24 puits pour le test d’adhésion.

Les flacons de culture cellulaire ainsi que les plaques de test sont incubés à 37°C sous 5% de CO2 dans une atmosphère humide.

VI-3-Matériels et réactifs

- Adénine tritiée (Sigma®) - Centrifugeuse (Hereaus®)

- Compteur béta (appareil de lecture de la radioactivité émise par les échantillons) - Flacons à scintillation

- Formazan (Merck®)

- Liquide de scintillation (Ready safe, Beckman Coulter) - Microspectrophotomètre Multiskan (à 450 nm) (Titretek®) - Poste de Sécurité Microbiologique de classe II (PSM)

- Qoezyme Q

- Sodium 3,3’-[1-[(phénylamino) carbonyl]-3,4-trétrazolium]-bis (4-méthoxy-6-nitro)] benzène sulfonic acid hydrate (XTT, Merck) ou en français: sel de sodium de l’acide 3,3-[1-[(phénylamino) carbonyl]-3,4-trétrazolium] bis (4-méthoxy-6-nitro)] benzène sulfonique hydraté.

- Sodium dodecyl sulfate (SDS) (Sigma®)

VI-4-Produits testés

Les deux essais ont été réalisés avec le composé sélectionné (composé 11) versus la furanone.

Dans le cas du test de cytotoxicité, une référence positive, le phénol (10 mg/mL), est évaluée en parallèle, permettant la validation de chaque série d’expérimentations.

VI-5-Test de cytotoxicité

La cytotoxicité du composé 11 et de la furanone sur la lignée MRC-5 (ATCC-CCL- 171 : lot 3929229) a été étudiée selon le test du XTT.

Le principe du test est basé sur la transformation enzymatique d’un sel de tétrazolium3,3-[1-[(phénylamino) carbonyl]-3,4-trétrazolium] bis (4-méthoxy-6-nitro)] benzène sulfonique hydratésoit XTT, en un produit coloré, le formazan.

Le XTT est réduit par les déshydrogénases mithochondriales des cellules vivantes en présence d’un agent couplant d’électrons, le coenzyme Q, en un composé hydrosoluble jaune/orangé, le formazan, dosable par spectrophotométrie à 450 nm.

VI-5-1-Méthode

Les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171 : lot 3929229) sont conservées dans l’azote liquide. Après amplification en milieu de culture DMEM, la suspension est ajustée à 2.105 cellules par mL par numération en cellule de Malassez.

Avant chaque essai, une microplaque de 96 puits à fond plat est ensemencée sous un volume de 100µL + 100 µL de milieu de culture enrichi par 10% de SVF.

Après incubation à 37°C sous 5% de CO2 pendant 18 à 24 h, le milieu est éliminé et l’ensemble de la microplaque est rincé avec 100 µL de PBS par puits. Le PBS est éliminé.

En parallèle, des dilutions des produits à tester, la furanone (à partir de 5.10-5M), le composé 11 (à partir de 5.10-4M) et le phénol (10 mg/mL) (référence positive de la cytotoxicité) sont réalisées en milieu de culture (DMEM sans SVF) sur une seconde microplaque de 96 puits.

Les dilutions de produit sont transférées sur le tapis cellulaire lavé, à l’exception de la colonne 12 (témoin cellules non traitées).

Nombre d’essais lors d’une expérimentation (8).

Après incubation à 37°C sous 5% de CO2 pendant 2h ou 24 h, les puits de la microplaque sont rincés avec 100 µL de PBS.

Après élimination du PBS, 50 µL d’une solution de XTT (0,5 mg/mL) et de Coenzyme Q (40 µg/mL) sont ajoutés à chaque puits.

VI-5-1-1-Lecture

Après une incubation à 37°C pendant 3 heures, 100 µL d’une solution aqueuse à 10% de SDS (Merck) sont ajoutés à chaque puits et la densité optique est immédiatement lue à 450 nm au microspectrophotomètre Multiskan®.

VI-5-1-2-Interprétation

La densité optique relevée est proportionnelle à la population cellulaire.

Ce test nous permet donc d’analyser à partir d’une densité optique correspondant au témoin, une toxicité cellulaire lorsque la densité optique est inférieure à celle du lot témoin.

Le pourcentage de viabilité est calculé de la façon suivante:

% de viabilité = [(DO Témoin - DO Traité)/DO Témoin] x 100

Si le pourcentage de viabilité est inférieur ou égal à -30%, le produit est considéré comme significativement cytotoxique (valeur définie lors d’essais intra-laboratoire).

Entre -30% et +30%, le composé est considéré comme non toxique; au delà de +30%, il est considéré comme prolifératif.

VI-5-2-Résultats des tests de cytotoxicité de la furanone

Les résultats des tests de cytotoxicité de la furanone, pour des temps de contact de 2h et 24h, sont rapportés dans les tableaux 1 et 2.

[Furanone] 5.10-5 M 2,5.10-5 M 1,25.10-5 M 6,25.10-6 M 3,125.10-6 M 1,156.10-6 M 7,8.10-7 M 3,9.10-7 M 1,95.10-7 M Ph 1mg Témoin DO Moyenne 1,110 1,130 0,938 0,842 0,835 0,765 0,719 0,720 0,700 0,001 0,680 Ecart type 0,018 0,106 0,101 0,082 0,110 0,099 0,084 0,057 0,032 0,013 0,062 % de viabilité 63,21 66,15 37,93 23,81 22,68 12,42 5,62 5,88 2,83 -99,85

Tableau 1. Cytotoxicité de la furanone après 2h de contact avec les cellules MMRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph).Concentration maximale testée en furanone =5.10-5 M

[Furanone] 5.10-5 M 2,5.10-5 M 1,25.10-5 M 6,25.10-6 M 3,125.10-6 M 1,156.10-6 M 7,8.10-7 M 3,9.10-7 M 1,95.10-7 M Ph 1mg Témoin DO Moyenne 0,551 0,548 0,886 0,809 0,648 0,684 0,640 0,725 0,805 -0,010 0,697 Ecart type 0,164 0,094 0,125 0,112 0,092 0,061 0,041 0,026 0,052 0,008 0,092 % de viabilité -20,85 -21,32 27,17 16,12 -6,93 -1,76 -8,18 4,09 15,58 -101,44

Tableau 2. Cytotoxicité de la furanone après 24h de contact avec les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph). Concentration maximale testée en furanone =5.10-5 M

Les tableaux indiquent les valeurs moyennes de DO ± écart-type observées sur 3 essais indépendants, respectivement pour des temps de contact furanone/cellules de 2 heures et 24 heures.

Les pourcentages de viabilité cellulaire calculés à partir de ces données sont supérieurs à -30% quelles que soient les conditions d’essai (temps de contact – concentration en furanone).

Ces résultats indiquent donc une absence d’activité cytotoxique significative de la furanone dans ces conditions (concentration ≤ 5.10-5M).

Cependant, pour un temps de contact cellules/furanone de 2 heures, nous notons une activité dite proliférative (augmentation d’activité) aux plus fortes concentrations testées (5.10-5 M à 1,25.10-5M).

Après 24 heures de contact, cet effet disparaît. Des valeurs inférieures à -20% sont alors notées aux plus fortes concentrations (5.10-5 M et 2,5.10-5 M).

VI-5-3-Résultats des tests de cytotoxicité du Composé 11

Les résultats des tests de cytotoxicité du composé 11, pour des temps de contact de 2h et 24h, sont rapportés dans les tableaux 3 et 4.

[Composé 11] 5.10-4 M 2,5.10-4 M 1,25.10-4 M 6,25.10-5 M 3,125.10-5 M 1,156.10-5 M 7,8.10-6 M 3,9.10-6 M 1,95.10-6 M Ph 1mg Témoin DO Moyenne 0,798 1,073 0,948 0,836 0,780 0,817 0,750 0,660 0,645 0,001 0,603 Ecart type 0,067 0,063 0,044 0,041 0,048 0,055 0,033 0,037 0,040 0,013 0,021 % de viabilité 32,38 77,86 57,21 38,60 29,39 35,49 24,34 9,45 6,88 -99,83

Tableau 3. Cytotoxicité du composé 11 après 2h de contact avec les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph). Concentration maximale testée en composé 11=5.10-4 M

[Composé 11] 5.10-4 M 2,5.10-4 M 1,25.10-4 M 6,25.10-5 M 3,125.10-5 M 1,156.10-5 M 7,8.10-6 M 3,9.10-6 M 1,95.10-6 M Ph 1mg Témoin DO Moyenne 0,724 0,670 1,192 1,147 1,088 0,966 1,029 0,944 0,914 -0,010 0,836 Ecart type 0,088 0,076 0,065 0,058 0,071 0,064 0,075 0,048 0,036 0,008 0,024 % de viabilité -13,42 -19,91 42,48 37,19 30,04 15,49 23,05 12,83 9,24 -101,2

Tableau 4. Cytotoxicité du composé 11 après 24h de contact avec les cellules MRC-5 (ATCC-CCL-171, lot: 3929229). Résultats exprimés en pourcentages de viabilité par rapport au témoin sur la base de la moyenne des DO ± écart-type (n= 3). Référence positive phénol (Ph). Concentration maximale testée en composé 11=5.10-4 M

Les tableaux indiquent les valeurs moyennes de DO ± écart-type observées sur 3 essais indépendants, respectivement pour des temps de contact composé 11 / cellules de 2 heures et 24 heures.

Les pourcentages de viabilité cellulaire calculés à partir de ces données sont supérieurs à -30% quelles que soient les conditions d’essai (temps de contact – concentration en composé 11).

Ces résultats indiquent donc une absence d’activité cytotoxique du composé 11 dans ces conditions (concentration ≤ 5.10-4 M).

Par ailleurs, pour un temps de contact C11/cellules de 2 heures, nous notons une activité dite proliférative (augmentation d’activité) aux plus fortes concentrations testées (5.10-4 M à 1,156.10-5M).

Après 24 heures de contact, cet effet disparaît aux plus fortes concentrations et reste encore notable aux concentrations 1,25.10-4M à 3,125.10-5M.

Pour les deux produits (furanone et composé 11), les concentrations maximales testées sans effet cytotoxique sont inférieures aux valeurs de CMI et CMB déterminées antérieurement. Ces valeurs constituent donc les concentrations limites à prendre en compte pour les tests d’inhibition d’adhésion sur la lignée cellulaire MRC-5 (ATCC- CCL-171 : lot 3929229) ; soit, une concentration finale en furanone de 5.10-5 M et en

composé 11 de 5.10-4 M pour 2 heures de contact avec les cellules.