Verilerin değerlendirilmesi

3.9.1 DNA Dizi Analizi ve Analiz Sonuçlarının Değerlendirilmesi

PCR reaksiyonu sonrasında oluşan ürünlerin ilk dizi analizi yalnızca ileri primerler kullanılarak otomatize sekans cihazı 3730 XL (ABI) ile gerçekleştirildi (Macrogen Inc). İlk dizi analizi sonucuna göre mutasyon veya SNP saptanan bireyler için tekrar PCR reaksiyonu kurularak ileri ve geri primerler ile dizi analizi yapıldı. DNA dizi sekans sonuçları ab1, scf, pdf, txt ve elektrogram dosya formatları olarak elde edilmiştir. Nöroblastom olgularında PHOX2B geni ekzonlarında olası meydana gelen nükleotid değişimlerinin saptanması için "Chromas Pro 1.5" ve "Mutation Surveyor V3.30" programları kullanılmıştır. "Chromas Pro 1.5" ile ab1 uzantılı veri dosyası kullanılarak sekans sonucunun, NCBI/blast.cgi veri tabanında kayıtlı olarak bulunan PHOX2B geni (Annotation: Chromosome 4, NC_000004.11, Pubmed/gene) dizisi ile karşılaştırılması için kullanılmıştır. Bu programla karşılaştırma analizi nükleotid dizisi düzeyinde yapılmıştır. Bununla birlikte her değişim bu metod ile bulunamamaktadır. "Chromas Pro 1.5" yazılımı ile ön analiz yapıldıktan sonra her olgunun üç ekzonu için mutasyon analizi "Mutation Surveyor V3.30" programı ile gerçekleştirildi. Program NCBI veri tabanı üzerinden PHOX2B gen sekans dizisininin .gbk uzantılı verisi ile sekanslama sonucunda elde edilen ab1 uzantılı verinin pik alanı üzerindeki değişimini değerlendirmektedir. Mutation Surveyor yazılımında pik değişimi değeri 0.3 - 0.5 ise heterozigot değişimleri, 1.0 ise homozigot nükleotid değişimini göstermektedir.

3.9.2 QPCR Sonuçlarının Değerlendirilmesi ve Veri Analizi

PHOX2B gen kopya sayısının saptanması için QBASE plus 2 yazılımı kullanılmıştır. Veri analizinin QBASE plus 2 ile gerçekleştirilebilmesi için reaksiyon sonunda elde edilen Ct değerlerinin RDML uzantılı dosya formatına dönüştürülmesi gerekmektedir (www.rdml.org). Kopya sayısının saptanmasında kullanılan QBASE plus 2 veri analizini ∆∆Ct formülü üzerinden E değerini kullanarak yapmaktadır (83, 84). ∆∆Ct formülü aşağıda belirtilen şekilde tanımlanmıştır.

Bir numaralı formül exponansiyel PCR amplifikasyonunu tanımlamaktadır. Belirtilen formülde; Xn, n döngü sonrasında elde edilen PCR ürününü, Xo ise başlangıç kalıp miktarını nitelemektedir. PCR verimi Ex ve reaksiyonun döngü sayısı da n’dir. Q-PCR reaksiyonunda ürün miktarının belirlenebildiği ilk döngü Ct (“threshold cycle”) ise 1 numaralı formül;

XT = X0 X (1+EX)CT,X = Kx [2] şeklinde yazılabilir.

İki numaralı formülde hedef gen için XT; Q-PCR reaksiyonunda ilk sinyal alımının gerçekleştiği ürün miktarı CT,X; sinyal alımının gerçekleştiği döngü numarasıdır. İki numaralı formül ile KX sabiti elde edilmektedir. Aynı formül referans genler için uygulandığında;

RT = RO X (1+ER)CT,R = KR [3] sabiti elde edilmektedir. 2 ve 3 birbirleri ile oranlanırsa;

Xo/Ro X (1+E)CT,X-CT,R = K [4] elde edilir. PCR ürününün referans gen ile normalize edildiği Xo/Ro yerine Xn (normalize edilmiş ürün miktarı), CT,X- CT,R farkı ∆Ct ile ifade edilirse dört numaralı formül XN = K x (1+E)-∆Ct [5] formülüne indirgenir. Referans ve hedef genin E değerleri kopya sayısının hesaplanmasında dikkate alınacak ise formül;

(Eref)CP olgu

(Ehedef)CP olgu [5] şeklinde yeniden düzenlenir.

Verinin normalizasyonu kalibratör örneğe göre yapılacağı için her hangi bir örneğin kontrole oranı ise E değerine bağlı olarak diploid kopya sayısını vermektedir.

(E

)

Diploid kopya sayısı = (Ehedef

)

(E

)

CP kalibratör

(E

)

PHOX2B kopya sayısının saptanmasına yönelik çalışmada referans ve hedef genlerin E değerlerinin analizde sapma yaratmayacak kadar birbirlerine yakın olmasından dolayı 2 standart değeri (% 100 verim) ile analiz yapılmıştır. Bununla birlikte elde edilen oranlar deney bütününde aynı referansların farklı olgulardan elde edilen relatif kantifikasyonuna bağlı normalizasyon değeri olmaksızın kopya sayısını vermektedir. Veri analizinde referanslara bağlı olarak normalizasyon faktörünün elde edilmesi için QBASE plus 2 yazılımında yer alan geNORM analizi kullanılmıştır. geNORM analizi ile elde edilen M değeri aynı referans genin diğer olgularda göstermiş olduğu relatif kantifikasyon sonucundaki farka dayalı olarak kullanılan referansların analizdeki stabilitesini saptamaktadır (85). Elde edilen M değeri 1 değerine ne kadar yakın ise kopya sayısı analizinde elde edilen verinin hatalı olma olasılığı da o kadar artmaktadır. QBASE plus 2 ile gerçekleştirilen analizlerde M değerinin 0.2’nin altında olması önerilmiştir (85). Bununla birlikte geNORM normalizasyon faktörünün hesaplanmasında aşağıda belirtilen şekilde kullanılmaktadır (86).

Şekil 26: Normalizasyon faktörünün hesaplanması ve hedef gen için elde edilen relatif

kantifikasyon değerinin referans genler ile normalize edilmesi (geNORM user guide update on July 8, 2008).

Şekil 26’da A, B ve C örneği için M değeri en uygun olan HK1, HK2 ve HK3’ün ∆Ct değerinin her bir örneğin kendi içinde geometik ortalaması alınarak normalizyon faktörü (0,445) hesaplanmaktadır. Elde edile verinin A numaralı örnek için hedef ∆Ct değerine bölünmesi ile kopya sayısına ait veri (2,245) normalize edilmektedir. M değerinin belirlenmesi ise aşağıda belirtilen şekilde hesaplanmıştır(86).

j ve k, A deneyinde m tane örnek için kullanılan iki referans gen ise A deneyinde M faktörü her iki referansın ∆Ct değerleri oranının (aij/aik) log2 tabanına göre düzenlenmesi ile hesaplanır.

J ve k farklı iki referans gen ise

Ajk = {log

(a

/a

), log

(a

/a

), ………… log

(a

/a

)} [1]

Birinci örnekten m kadar örneğe Log2 ortak tabanına alındığında;

Ajk = {log

(a

/a

)}

J ve k refrans genleri ile yapılan A deneyinde ikili değişimler tanımlanır ve standart sapma olarak değerlendirilse;

Vjk = standart sapma (Ajk)

formülü elde edilerek M değeri hesaplanır.

Normalizasyon faktörünün standart sapması ise;

SD = Edelta Ct x lnE x SD sample Ct [1] (Ereferans minimum Ct- referans olgu Ct) lnE ampilifikasyon veriminin logaritma değerini belirtmektedir.

SD NFn = NFn x (SD ref1/Ref1 geo.ort.) + (SD ref2/Ref2 geo.ort.) [2] formülü ile hesaplanmaktadır (http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). QBASE plus 2 yazılımı ile yapılan analizde diploid kopya sayısı için 1.41 değeri ve altı delesyon olarak kabul edilir iken 2.44 ve üstü artış olarak kabul edilmektedir. Belirtilen deney tasarımı ve analiz yönteminin uygulanabilirliği için 1p delesyonu ve 17q artışı MLPA yöntemi ile belirlenmiş nöroblastom olguları çalışmıştır. 1p delesyonuna sahip 5 nöroblastom olgusuna (143, 180, 196, 207 ve 217) ait QPCR verisi MLPA verileri ile karşılaştırılmıştır.

Tablo 12: 1p Delesyonu varlığı bilinen olgularından elde edilen kopya sayısı verileri Olgu Numarası QPCR Kopya Sayısı Standart Sapma Normalizasyon Faktötü QPCR Delesyon Eşik Değeri MLPA Verisi MLPA Delesyon Eşik Değeri 143 1,03 1,93E-02 0,896 1,41 0,66 0,83 180 0,848 2,08E-02 0,738 1,41 0,39 0,83 196 1,059 3,01E-02 1,445 1,41 0,37 0,83 207 1,057 1,10E-02 0,611 1,41 0,59 0,83 217 1,023 1,38E-02 1,118 1,41 0,53 0,83

1p delesyonu bilinen nöroblastom olgularında yapılan metod doğrulama çalışmasında delesyonun varlığı gösterilmiştir. Yapılan pozitif kontrol çalışmasında elde edilen en küçük değer 0,848 iken en büyük değer 1,059 olarak saptanmıştır. Q-PCR metodu ile kopya sayısı saptanmasında 2005.KB.SAG.016 numaralı projeden elde edilen işitme kaybı hastalarına ait ve kopya sayısı değişimi olmayan bireylerden alınan perifeik kan materyalinden elde edilmiş DNA materyali diploid kopya sayısının belirlenmesinde kullanılmıştır. Seçilen yöntem ile delesyonun saptanmasının ardından metod normal kopya sayısının saptanmasında 25 işitme kaybı hastası ile sorgulanmıştır.

Tablo 13: İşitme kaybı hastalarına ait periferik kandan izole edilmiş diploid kopya sayısına

sahip DNA materyalinden elde edilen Q-PCR sonuçları

Olgu Numarası QPCR Kopya Sayısı (PHOX2B) Standart Sapma Normalizasyon Faktötü QPCR Normal Birey Değer Aralığı Diploid Kopya Sayısı K116 1,612 0,077 1,125 1,41-2,44 2 K118 1,761 0,142 1,008 1,41-2,44 2 K129 1,9 4,44E-02 0,569 1,41-2,44 2 K130 1,959 4,21E-02 0,857 1,41-2,44 2 K133 2,072 0,058 0,934 1,41-2,44 2 K140 1,89 0,075 1,125 1,41-2,44 2 K141 1,842 0,051 1,123 1,41-2,44 2 K143 1,94 0,089 1,103 1,41-2,44 2 K150 2,03 2,98E-02 1,228 1,41-2,44 2 K156 1,818 0,055 0,989 1,41-2,44 2 K160 1,657 0,1 1,086 1,41-2,44 2 K162 1,815 1,91E-02 0,964 1,41-2,44 2 K165 1,828 2,70E-02 0,988 1,41-2,44 2 K174 2,258 4,96E-02 0,533 1,41-2,44 2 K175 1,716 4,72E-02 0,763 1,41-2,44 2 K179 1,692 0,066 1,028 1,41-2,44 2 K194 1,683 1,07E-01 0,614 1,41-2,44 2 K283 1,772 0,064 0,884 1,41-2,44 2 K285 2,028 3,33E-02 1,005 1,41-2,44 2 K286 2,042 0,1 1,044 1,41-2,44 2 K287 2,071 5,80E-02 0,954 1,41-2,44 2 K289 1,834 0,052 1,111 1,41-2,44 2 K290 1,929 6,40E-02 0,989 1,41-2,44 2 K298 1,939 2,18E-02 0,769 1,41-2,44 2 K304 1,905 4,67E-02 0,987 1,41-2,44 2

Diploid kopya sayısına sahip DNA materyali ile yapılan çalışma sonucunda elde edilen en küçük değer 1,612 iken en büyük değer 2,258 olarak saptanmıştır. QBASE plus 2 yazılımında diploid kopya sayısı için belirlenen üst sınırın (2,44) veri analizinde kullanılmasında bir sakınca görülmemiştir. Bununla birlikte delesyon ve normal bireylere ait

kopya sayısının belirlenmesinde seçilen yöntem ve analiz metodu doğrulanmıştır.

Tablo 14: 17q artışı varlığı bilinen olgularından elde edilen kopya sayısı verileri Olgu Numarası QPCR Kopya Sayısı (TOB1) Standart Sapma Normalizasyon Faktötü QPCR Artış Eşik Değeri MLPA Verisi MLPA Artış Eşik Değeri 30 3,862 0,104 1,234 2,44 1,83 1,2 52 6,302 0,463 1,331 2,44 1,88 1,2 160 5,043 0,223 0,338 2,44 1,91 1,2 200 3,504 0,107 1,318 2,44 1,91 1,2 206 2,734 0,113 1,088 2,44 2,44 1,2 210 3,553 0,082 0,673 2,44 1,83 1,2 215 4,211 0,061 1,789 2,44 1,92 1,2

17q artışı saptanan bireylerde MLPA yöntemi ile elde edilen artış verisi Q-PCR metodu ile doğrulanmıştır. Bununla birlikte yöntem kopya sayısı artışını tespit etmekte ancak MLPA metodu ile elde edilen verilere kıyasla farklı artış değerleri göstermektedir. 30 ve 52 numaralı olguların MLPA veri değeri birbirine çok yakın olmasına rağmen (1,83 ve 1,88) iki olgu için Q-PCR metodu ile elde edilen veri arasında farklılık (3,862 ve 6,302) gözlenmiştir. Belirlenen referans genler nöroblastom tümörlerinde rekuran kromozomal anomalilerinin gözlenmediği lokuslar üzerinden seçilmiştir. Kontrol genlerinin bu bölgelerden seçilmesi sonucunda nöroblastom ile ilişkili delesyon veya kazanımdan dolayı meydana gelebilecek değişimin kopya değişimi üzerine olan yanıltıcı etkisinin ortadan kaldırılması amaçlanmıştır. Ancak bir tümör dokusundan diğer bir tümör dokusuna farklılık gösterebilen kromozom seti sayısı nedeni ile referans genlerin bulunduğu kromozomların set artışından etkilenmesi kopya sayısı artışı gözlenen olgular için yanıltıcı etki oluşturabilir. Bununla birlikte yöntem ve analiz metodu ile 17q artışının varlığı tespit edilmiştir.

QBASE plus 2 yazılımı ile yapılan veri analizinde M değerinin varlığı (≤0.2) ve her bir reaksiyonun ikili olarak (duplicate) yapıldığı deneyde tekrarlar arasındaki Ct değeri farkının 0,5’in üstüne geçmemesine dikkat edilmiştir.