Verilerin Değerlendirilme Yöntemleri

Kloroplast DNA’sı haploid genoma sahip olduğu için her bir primer çiftinin çoğalttığı bölge bir lokus, her bir primerin çoğalttığı farklı nükleotid uzunluğundaki DNA parçaları bir allel olarak değerlendirildi. Bu ilkeye dayanarak, analiz edilen her bir primer için, tohum bahçesindeki klonlara ait bireylerin ve tohum bahçesi yakınındaki doğal populasyondaki bireylerin her birinin sahip olduğu allellerin büyüklüğü belirlendi ve frekansları ayrı ayrı hesaplandı.

Tohum bahçesindeki klonlara ait rametler, tohum bahçesindeki klonlar tarafından üretilen embriyolar ve doğal populasyondan örneklenen bireyler olmak üzere 3 grup ele alındı. Tohum bahçesindeki polen kirliliği düzeyini tahmin edebilmek için tohum bahçesindeki bütün klonların, tohum bahçesindeki bireyler tarafından üretilen embriyoların ve doğal populasyondaki bireylerin çalışılan lokuslar bakımından genetik çeşitlilik parametrelerinin belirlenmesi için veriler düzenlendi. Tohum bahçesindeki 30 klonun ve doğal populasyondan örneklenen 47 bireyin genotipleri belirlendi. Genetik çeşitliliği belirleyebilmek için her bir grupta, polimorfik lokuslar, polimorfik lokuslardaki ortalama allel sayısı ve allel frekansları, etkili allel sayısı ve Shannon sabiti hesaplandı. Polimorfizm ölçütü olarak, bütün bireyler göz önüne alındığında iki ve/veya daha fazla allele sahip olan mikrosatellit bölgesi polimorfik lokus olarak değerlendirildi. Çalışılan altı kloroplast mikrosatellit bölgesi bakımından her bir bireydeki farklı büyüklükteki allellerin kombinasyonları haplotip olarak değerlendirildi. Her bir grubun genetik çeşitliliği, Nei (1987)’nin tarafsız haplotip çeşitliliği (He) hesaplanarak

belirlendi. Nei (1987)’nin tarafsız haplotip çeşitlilik katsayısı aşağıdaki şekilde hesaplandı;

He = n (n-1) -1 (1 – Σfi2)

Formülde fi değeri i haplotipinin frekansını; n ise, örnek sayısını belirtmektedir.

Gruplar içindeki bireyler arasında bulunan genetik mesafe, basamaklı mutasyon modeline göre hesaplandı (stepwise mutation model – SMM). Bu modelde, rekombine olmayan kloroplast genomu tek bir lokus olarak alınır ve Goldstein vd (1995)’in genetik

uzaklık değeri (D2sh) hesaplanır. İki birey arasındaki genetik uzaklık aşağıdaki şekilde hesaplanmaktadır; 2 1 1 2

_(,

₎

⎥

⎦

⎤

⎢

⎣

⎡

₋

=

∑

= − K k sh

i

j

K

aik

ajk

D

Formülde bulunan aik ve ajk terimleri i ve j bireylerinin k lokusunda sahip oldukları allellerin büyüklüğünü göstermektedir (Goldstein vd 1995). Formüldeki K terimi ise çalışılan lokus sayısını ifade etmektedir. Örneğin, bu çalışmada altı kloroplast mikrosatellit bölgesine ait lokuslara bakıldığı için K=6 olarak alınmaktadır.

Polimorfik bilgi içeriği (PIC), bir belirtecin populasyondaki polimorfizmi belirlemekteki değerini göstermektedir. PIC değeri bir belirtece (lokusa) ait allel sayısına ve allelerin populasyondaki dağılımına bağlıdır. Tohum bahçesindeki klonlarda, embriyolarda ve tohum bahçesi yakınındaki doğal populasyondaki bireylerde çalışılan her bir cpSSR lokusu için polimorfik bilgi içeriği (PIC) değeri aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı. Formülde, "n" bir cpSSR lokusundaki allel sayısını ve "p" bir cpSSR lokusundaki her bir allelin frekansını belirtmektedir (Botstein vd 1980).

PIC = 1 - (

∑

) - = n i i p 1 2 1 2 1 1 2 2 _j n i n i j i p p

∑ ∑

− = =+

Genetik çeşitlilik parametrelerinin [allel frekansı, polimorfik lokuslardaki gözlenen allel sayısı, etkili allel sayısı, Shannon sabiti, Nei’nin (1973) genetik çeşitlilik katsayısı] hesaplanmasında BIOSYS-2 (Black 1997), GENALEX [(version 6.3) (http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/)] (Peakall ve Smouse 2006) ve POPGENE (Microsoft Window-based Freeware for Population Genetics Analysis, Version 1.32) (Yeh vd 1999) istatistik programlarından, haplotip zenginliğinin hesaplanmasında CONTRIB 1.02 (Petit vd 1998) istatistik programından, tohum bahçesinde, tohum bahçesindeki klonlar tarafından üretilen embriyolarda ve doğal populasyonda gözlenen haplotip sayısının ve frekansının hesaplanmasında, basamaklı mutasyon modeline göre moleküler varyans analizinde (AMOVA) ARLEQUIN [(versiyon 3.11) (http://cmpg.unibe.ch/software/arlequin3/)] (Excoffier vd 2005) istatistik programından

yararlanıldı. Böylece tohum bahçesinin, tohum bahçesindeki bireyler tarafından üretilen embriyoların ve doğal populasyonun gen havuzu ve genetik çeşitliliği hakkında bilgiler edinildi.

Bir tohum bahçesindeki klonların sahip olduğu ramet sayısındaki farklılıklara dayalı olarak hesaplanan etkili klon sayısı (Nc) değeri, tohum bahçesinin gen havuzunu tanımlamada bahçedeki klon sayısından daha fazla öneme sahiptir. Tohum bahçesinde etkili klon sayısı (Nc) tahmini aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı;

Nc =

∑

= N i i total n n 1 2 2

Formülde, "ntotal" tohum bahçesindeki toplam ramet sayısını, "ni" i. klonun ramet sayısını ve "N" tohum bahçesindeki klon sayısını belirtmektedir (Kang vd 2001b).

Polen kontaminasyonu oranının tahmini için ilgilenilen tohum bahçesindeki bütün klonların çalışılan lokuslar bakımından genotipinin ve tohum bahçesi içerisindeki bireyler tarafından oluşturulan tohumların embriyolarına katkıda bulunan polen gametlerinin genotipinin bilinmesi gerekir. Ayrıca tohum bahçesi civarındaki doğal populasyonlarda, çalışılan lokusların allel frekanslarının bilinmesi gerekir. Tohum bahçesi içindeki bir ağaca gelen polenlerin gametik çok-lokuslu genotipleri, o bireyin tohumlarında megagametofit ve embriyo dokunun analizi ile belirlenmiştir. Megagametofit doku embriyo oluşumuna katkıda bulunan anasal gametin genotipini (Stewart 1994), embriyo doku ise kloroplast DNA koniferlerde paternal (babasal) kalıtım gösterdiği için polen gametinin genotipini yansıtır.

Polen kontaminasyonu tahmini için geliştirilen model tohum bahçesindeki olası tüm çok-lokuslu polen genotipleriyle analiz edilen her bir embriyonun oluşumuna katkıda bulunan çok-lokuslu polen genotipinin karşılaştırılmasına dayanır. Tohum bahçesi tarafından üretilmeyen bütün polen gametleri "belirlenebilir" kontaminantlardır (b). Belirlenebilir kontaminantların oranı polen kontaminasyonunun "minimum tahmini"dir. Bunun "minimum tahmin" olmasının nedeni, bazı kontaminantların muhtemel olarak

tohum bahçesi klonları tarafından üretilenlerinkinden ayırt edilemeyen çok-lokuslu genotiplere sahip olmasındandır. Gerçek polen kontaminasyonu oranını (m), "belirlenebilir" kontaminantların oranının (b) doğal populasyondaki bir polen taneciğinin belirlenebilir birçok-lokuslu marker genotipi taşıyabilme olasılığına (d) bölünmesiyle hesaplanır (Smith ve Adams 1983).

m = b/d

m: Gerçek polen kirliliği (kontaminasyonu) oranı tahmini,

b: Kontaminantların (kirliliğin) gözlenen oranı (minimum tahmin),

d: Doğal populasyondaki bir polen taneciğinin belirlenebilir bir çok-lokuslu belirteci genotipi taşıyabilme olasılığıdır.

Tohum bahçesine dışarıdan (tohum bahçesi kaynaklı olmayan) polen karışıp karışmadığı (polen kontaminasyonu) eğer karışmışsa ne ölçüde karıştığının belirlenmesinde Turbo Basic’de yazılan bir bilgisayar programı olan GENFLOW (Adams ve Burczyk 1993) ve POLLEN FLOW (PFL) (Slavov 2004, Slavov vd 2005b) istatistik paket programları kullanıldı.

Tohum bahçesi tarafından üretilen dişi çiçekler ıslah edilmemiş ağaçlardan gelen polenlerle döllendiği zaman, bu dişi çiçeklerden oluşan tohumlardan elde edilecek genetik kazanç, kontaminasyonun olmadığı durumda elde edilecek kazancın yarısı kadar olacaktır. Polen kontaminasyonunun genetik kazanç üzerine olabilecek olumsuz etkisini, yani genetik kazançtaki azalmayı ve elde edilecek net genetik kazancı hesaplamak için, aşağıdaki formül kullanılmıştır (Squillace ve Long 1981).

Ga=[(m x G)/2]

Gn=G - Ga

Burada; "G_a" Kontaminasyon olması halinde, beklenen genetik kazançtaki azalmayı, "G_n" net genetik kazancı, "G" kontaminasyon olmadığında beklenen genetik kazancı, "m" polen kontaminasyonu oranını belirtmektedir.

Belgede Kloroplast SSR (cpSSR) belirteçleri yardımıyla kızılçamın (Pinus brutia TEN.) Gündoğmuş-Eskibağ (Akçagedik-Tespihli) orijinli 38 no’lu klonal tohum bahçesinde polen kirliliğinin belirlenmesi (sayfa 63-67)