EĞİTİM BİLİMLERİ TESTİ
KAYNAKLAR 21.150 UZUN VADELİ
Todas as 39 cepas utilizadas nesse trabalho foram testadas para as características fenotípicas e moleculares.
As cepas oriundas da micoteca do CEMM, que não possuíam classificação a nível de espécie, foram identificadas molecularmente, além terem confirmadas suas características macro e micromorfológicas. As cepas doadas pelos pesquisadores possuíam a identificação a nível de espécie, porém foram testadas para a confirmação tanto molecular como fenotipicamente. Logo, como resultado, todas as cepas confirmaram a identificação de origem. Ver tabela 1.
Tabela 1. Resultado da identificação molecular das 39 cepas.
Código Identificação inicial Identificação final
ATCC 22019 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu CEMM 05-1-053 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu CEMM 03-5-029 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu A90038 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu CEMM 05-6-054 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu UNESP02 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu CEMM 05-5-070 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu
CEMM 05-1-051 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu CEMM 03-5-043 Complexo C. parapsilosis C. parapsilosis stricto sensu USP15 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu UNESP04 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu USP01 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu URM6411 C. parapsilosis stricto sensu C. parapsilosis stricto sensu ATCC 96143 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-087 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-093 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-092 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-086 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-095 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-089 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-090 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-091 C. metapsilosis C. metapsilosis URM6407 C. metapsilosis C. metapsilosis URM6408 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-094 C. metapsilosis C. metapsilosis CEMM 05-5-088 C. metapsilosis C. metapsilosis ATCC 96139 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-083 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-084 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-079 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-085 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-1-060 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-1-053 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 03-5-040 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 03-3-044 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-078 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-099 C. orthopsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-1-058 Complexo C. parapsilosis C. orthopsilosis CEMM 05-5-080 C. orthopsilosis C. orthopsilosis
Figura 4. Gel de agarose a 1%, mostrando fragmentos de bandas de aproximadamente 716 pb, concluindo que as cepas de 1-8 são pertencentes ao Complexo C. parapsilosis, C - controle negativo da reação e M - marcador molecular de 1000 pb.
Figura 5. Gel de agarose a 2% mostrando digestão do produto do PCR-SADH com enzima de restrição BanI. C. parapsilosis stricto sensu (poço 6), C. metapsilosis (poços 1, 2, 3, 7 e 8) e C. orthopsilosis (poços 4 e 5). C – controle negativo e M – marcador molecular.
7.2 SENSIBILIDADE IN VITRO DO COMPLEXO C. parapsilosis FRENTE À CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS
As concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram determinadas para todas as 39 cepas, em estudo, frente aos antifúngicos e CsA isolados, encontrando-se os dados na tabela 2. Para a espécie C. parapsilosis stricto sensu, os valores de CIM variaram de 0,0625 a 0,5; 0,125 a 2; 0,03125 a 0,25; 0,03125 a 0,5 e de 6,25 µg/mL para anfotericina B (AMB), fluconazol (FLZ), voriconazol (VRZ), caspofungina (CASP) e ciclosporina A (CsA), respectivamente. A espécie C. metapsilosis apresentou CIM, variando de 0,0625 a 0,5; 0,0625 a 4; 0,03125 a 0,125; 0,03125 a 0,25 e de 100 µg/mL para AMB, FLZ, VRZ, CASP e CsA, respectivamente. E, por último, a espécie C. orthopsilosis teve CIM, variando de 0,0625 a 0,5; 0,25 a 4; 0,0625 a 0,25; 0,03125 a 0,5 e de 100 µg/mL para AMB, FLZ, VRZ, CASP e CsA, respectivamente. A concentração inibitória mínima de CsA se manteve constante dentro das espécies.
Tabela 2. Perfil de sensibilidade das cepas do Complexo C. parapsilosis na forma planctônica frente a drogas antifúngicas e ciclosporina A.
Cepa Espécie CIM (µg/mL)
AMB FCZ VRZ CASP CsA
ATCC 22019 C. parapsilosis stricto sensu 0,0625 0,125 0,03125 0,5 6,25 CEMM 05-1-054 C. parapsilosis stricto sensu 0,5 0,25 0,03125 0,0625 6,25 CEMM 03-5-029 C. parapsilosis stricto sensu 0,5 2 0,25 0,03125 6,25
A90038 C. parapsilosis stricto sensu 0,0625 1 0,25 0,125 6,25 CEMM 05-6-054 C. parapsilosis stricto sensu 0,25 0,125 0,25 0,25 6,25 UNESP02 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 2 0,0625 0,125 6,25 CEMM 05-5-070 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,25 0,03125 0,25 6,25
CEMM 05-1-051 C. parapsilosis stricto sensu 0,25 2 0,25 0,25 6,25 CEMM 03-5-043 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,125 0,03125 0,125 6,25 UPS15 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 1 0,03125 0,25 6,25 UNESP04 C. parapsilosis stricto sensu 0,25 0,25 0,0625 0,125 6,25 USP01 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,125 0,03125 0,125 6,25 URM6411 C. parapsilosis stricto sensu 0,125 0,5 0,25 0,125 6,25 ATCC 96143 C. metapsilosis 0,0625 0,0625 0,03125 0,125 100 CEMM 05-5-087 C. metapsilosis 0,25 0,5 0,03125 0,0625 100 CEMM 05-5-093 C. metapsilosis 0,0625 0,5 0,03125 0,03125 100 CEMM 05-5-092 C. metapsilosis 0,25 2 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-086 C. metapsilosis 0,25 1 0,0625 0,25 100 CEMM 05-5-095 C. metapsilosis 0,0625 4 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-089 C. metapsilosis 0,125 1 0,125 0,25 100 CEMM 05-5-090 C. metapsilosis 0,125 1 0,03125 0,25 100 CEMM 05-5-091 C. metapsilosis 0,125 0,5 0,03125 0,125 100 URM6407 C. metapsilosis 0,5 4 0,125 0,25 100 URM6408 C. metapsilosis 0,5 2 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-094 C. metapsilosis 0,125 1 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-088 C. metapsilosis 0,25 1 0,125 0,125 100 ATCC 96139 C. orthopsilosis 0,125 0,25 0,0625 0,03125 100 CEMM 05-5-083 C. orthopsilosis 0,0625 4 0,125 0,125 100 CEMM 05-5-084 C. orthopsilosis 0,125 0,5 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-079 C. orthopsilosis 0,25 1 0,125 0,03125 100 CEMM 05-5-085 C. orthopsilosis 0,25 0,5 0,0625 0,25 100 CEMM 05-1-060 C. orthopsilosis 0,25 2 0,0625 0,5 100 CEMM 05-1-053 C. orthopsilosis 0,125 4 0,0625 0,125 100 CEMM 03-5-040 C. orthopsilosis 0,25 1 0,0625 0,25 100 CEMM 03-3-044 C. orthopsilosis 0,5 1 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-078 C. orthopsilosis 0,25 0,5 0,0625 0,125 100 CEMM 05-5-099 C. orthopsilosis 0,25 4 0,125 0,125 100 CEMM 05-1-058 C. orthopsilosis 0,125 2 0,25 0,5 100 CEMM 05-5-080 C. orthopsilosis 0,25 2 0,0625 0,25 100
Tabela 3. Variações das concentrações inibitórias mínimas para cada droga de cada espécie.
Espécie CIM (variação)
AMB FCZ VRZ CASP CsA
C. parapsilosis stricto sensu
(n =13) 0,0625 a 0,5 0,125 a 2 0,03125 a 0,25 0,03125 a 0,5 6,25 C. metapsilosis (n =13) 0,0625 a 0,5 0,0625 a 4 0,03125 a 0,125 0,03125 a 0,25 >100 C. orthopsilosis (n =13) 0,0625 a 0,5 0,25 a 4 0,0625 a 0,25 0,03125 a 0,5 >100
7.3 EFEITO DA COMBINAÇÃO DA CsA E ANTIFÚNGICOS EM CEPAS DO COMPLEXO C. parapsilosis
As concentrações inibitórias mínimas (CIM) foram determinadas para todas as 39 cepas, em estudo, frente aos antifúngicos e CsA combinados, os dados encontram-se na tabela 3.
Os valores da CIM para a combinação das drogas antifúngicas e CsA variaram de 0,03125 a 0,125/0,312 a 1,25; 0,03125 a 0,5/0,312 a 1,25; 0,0039 a 0,0625/0,312 a 2,5; 0,0078 a 0,03125/0,156 a 0,625 µg/mL para a combinação, respectivamente, AMB/CsA; FCZ/CsA; VRZ/CsA e CASP/CsA, para a espécie C. parapsilosis stricto sensu. Para a espécie C. metapsilosis, as CIMs variaram de 0,0156 a 1/1,25 a 2,5; 0,0156 a 1/0,312 a 2,5; 0,0039 a 0,0156/1,25 a 5; 0,0039 a 0,0625/0,312 a 1,25 µg/mL, para a combinação, respectivamente, AMB/CsA; FCZ/CsA; VRZ/CsA e CASP/CsA. Já as cepas de C. orthopsilosis apresentaram CIM variando de 0,0078 a 0,125/0,312 a 2,5; 0,03125 a 1/0,312 a 1,25; 0,0078 a 0,03125/1,25 a 20; 0,0078 a 0,0625/0,625 a 2,5 para a combinação, respectivamente, AMB/CsA; FCZ/CsA; VRZ/CsA e CASP/CsA. Desse modo, todas as cepas avaliadas foram inibidas pelas combinações testadas.
A combinação testada mostrou interação sinérgica frente a todas as cepas do Complexo C. parapsilosis, exceto para três cepas que apresentaram indiferente para AMB e FCZ.
Cepa Espécie
AMB/CsA FCZ/CsA VRZ/CsA CASP/CsA AMB/CsA FCZ/CsA VRZ/CsA CASP/CsA
ATCC 22019 C. parapsilosis stricto sensu 0,0156/1,25 0,03125/1,25 0,0039/1,25 0,0078/0,156 0,262 0,45 0,32 0,040 CEMM 05-1-054 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125 /0,312 0,125/1,25 0,0039/1,25 0,0156/0,312 0,3 0,45 0,32 0,112 CEMM 03-5-029 C. parapsilosis stricto sensu 0,125/0,312 0,5/1,25 0,0625/0,312 0,0078/0,312 0,3 0,5 0,31 0,174 A90038 C. parapsilosis stricto sensu 0,0156/1,25 0,25/1,25 0,0078/2,5 0,0156/0,312 0,262 0,5 0,43 0,112 CEMM 05-6-054 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/ 0,312 0,03125/1,25 0,0078/2,5 0,0156/0,312 0,174 0,45 0,43 0,081 UNESP02 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,5/1,25 0,0156/0,312 0,03125/0,625 0,3 0,5 0,28 0,162 CEMM 05-5-070 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,25/0,625 0,0039/1,25 0,0078/0,156 0,3 0,65 0,32 0,035 CEMM 05-1-051 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,5/1,25 0,0078/2,5 0,0156/0,312 0,3 0,5 0,43 0,174 CEMM 03-5-043 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,03125/0,312 0,0039/1,25 0,0078/0,156 0,3 0,3 0,32 0,045 UPS15 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,25/0,312 0,0039/1,25 0,0078/0,156 0,3 0,3 0,32 0,082 UNESP04 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,03125/1,25 0,0039/1,25 0,0078/0,156 0,174 0,325 0,26 0,082 USP01 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,03125/0,312 0,0039/1,25 0,0078/0,156 0,3 0,3 0,32 0,082 URM6411 C. parapsilosis stricto sensu 0,03125/0,312 0,125/1,25 0,0078/2,5 0,0156/0,312 0,3 0,45 0,43 0,112 ATCC 96143 C. metapsilosis 0,0156/1,25 0,0156/1,25 0,0039/1,25 0,03125/0,312 0,262 0,262 0,135 0,252 CEMM 05-5-087 C. metapsilosis 0,0625/1,25 0,25/0,625 0,0078/1,25 0,0078/1,25 0,26 0,506 0,262 0,137 49
CEMM 05-5-093 C. metapsilosis 0,0156/1,25 0,125/1,25 0,0078/5 0,0039/0,625 0,262 0,262 0,3 0,068 CEMM 05-5-092 C. metapsilosis 1/1,25 0,5/2,5 0,0039/1,25 0,03125/0,312 0,074 0,275 0,074 0,252 CEMM 05-5-086 C. metapsilosis 0,0625/1,25 0,25/1,25 0,0039/1,25 0,0625/0,625 0,262 0,262 0,068 0,256 CEMM 05-5-095 C. metapsilosis 0,25/1,25 1/1,25 0,0156/1,25 0,03125/0,312 0,262 0,262 0,262 0,262 CEMM 05-5-089 C. metapsilosis 0,03125/1,25 0,25/1,25 0,0039/1,25 0,0625/0,625 0,262 0,262 0,042 0,256 CEMM 05-5-090 C. metapsilosis 0,03125/2,5 0,25/0,312 0,0078/2,5 0,03125/0,312 0,275 0,253 0,274 0,127 CEMM 05-5-091 C. metapsilosis 0,03125/2,5 0,0625/0,312 0,0039/1,25 0,03125/0,312 0,275 0,128 0,137 0,252 URM6407 C. metapsilosis 0,125/1,25 1/1,25 0,0156/5 0,03125/0,312 0,262 0,262 0,175 0,127 URM6408 C. metapsilosis 0,0625/1,25 0,5/0,312 0,0156/5 0,03125/1,25 0,137 0,253 0,3 0,262 CEMM 05-5-094 C. metapsilosis 0,03125/1,25 0,25/0,312 0,0039/1,25 0,03125/0,312 0,262 0,253 0,07 0,252 CEMM 05-5-088 C. metapsilosis 0,0625/1,25 0,25/1,25 0,0156/1,25 0,03125/0,312 0,262 0,262 0,136 0,252 ATCC 96139 C. orthopsilosis 0,03125/2,5 0,03125/0,312 0,0078/5 0,0078/1,25 0,275 0,128 0,175 0,262 CEMM 05-5-083 C. orthopsilosis 0,0078/1,25 1/1,25 0,03125/1,25 0,03125/1,25 0,137 0,262 0,262 0,262 CEMM 05-5-084 C. orthopsilosis 0,03125/2,5 0,125/0,312 0,0078/5 0,03125/1,25 0,275 0,253 0,175 0,262 CEMM 05-5-079 C. orthopsilosis 0,0625/0,312 0,250/0,312 0,0078/5 0,0078/1,25 0,253 0,253 0,11 0,262 CEMM 05-5-085 C. orthopsilosis 0,125/1,25 0,125/1,25 0,0156/1,25 0,0625/1,25 0,512 0,262 0,262 0,262 CEMM 05-1-060 C. orthopsilosis 0,0625/1,25 0,5/1,25 0,03125/5 0,0625/2,5 0,262 0,262 0,11 0,15 CEMM 05-1-053 C. orthopsilosis 0,03125/1,25 0,5/1,25 0,0156/5 0,03125/1,25 0,262 0,137 0,3 0,262 CEMM 03-5-040 C. orthopsilosis 0,0625/0,312 0,25/0,312 0,0156/5 0,0156/0,625 0,253 0,253 0,3 0,068 CEMM 03-3-044 C. orthopsilosis 0,0625/0,312 0,25/0,312 0,0078/5 0,0156/0,625 0,128 0,253 0,175 0,13 CEMM 05-5-078 C. orthopsilosis 0,0625/0312 0,0625/0,312 0,0078/5 0,0156/0,625 0,253 0,128 0,175 0,13 CEMM 05-2-099 C. orthopsilosis 0,0156/1,25 1/1,25 0,03125/1,25 0,0156/1,25 0,074 0,262 0,262 0,137 CEMM 05-1-058 C. orthopsilosis 0,03125/2,5 0,5/0,312 0,03125/20 0,0625/2,5 0,275 0,253 0,325 0,15 CEMM 05-5-080 C. orthopsilosis 0,0625/0,312 0,5/0,312 0,0078/5 0,0156/0,625 0,253 0,253 0,175 0,068 50
AMB/CsA FCZ/CsA VRZ/CsA CASP/CsA AMB/CsA FCZ/CsA VRZ/CsA CASP/CsA C. parapsilosis stricto sensu (n=13) 0,03125-0,125/ 0,312-1,25 0,03125-0,5/ 0,312-1,25 0,0039-0,0625/ 0,312-2,5 0,0078/ 0,156-0,625 0,174-0,3 0,3-0,65 0,26-0,43 0,035-0,174 C. metapsilosis (n=13) 0,0156-1/ 1,25-2,5 0,0156-1/ 0,312-2,5 0,0039-0,0156/ 1,25-5 0,0039-0,0625/ 0,312-1,25 0,074-0,275 0,125-0,506 0,042-0,3 0,068-0,262 C. orthopsilosis (n=13) 0,0078-0,125/ 0,312-2,5 0,03125-1/ 0,312-1,25 0,0078-0,03125/ 1,25-20 0,0078-0,625/ 0,625-2,5 0,074-0,502 0,125-0,262 0,11-0,3 0,068-0,262 51
7.4 EFEITO DA CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS ISOLADAS E EM COMBINAÇÃO NA FORMAÇÃO DE BIOFILMES DE C. parapsilosis
As combinações CIM10X e CIM50X de CsA e drogas antifúngicas foram capazes de inibir a formação de biofilme de todas as cepas do complexo C. parapsilosis. Onde na concentração é CIM10X para cepas de C. parapsilosis ocorreu uma redução em relação ao controle de 75, 60 47 e 46%, em média, para combinação, respectivamente, AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, para a CIM50X a redução foi de 42, 60, 38 e 65%, em média, para combinação, respectivamente, AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA.
Figura 6. Gráfico de biofilme em formação para C. parapsilosis stricto sensu mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X.
Na espécie C. metapsilosis, foi observado uma redução de 60, 44, 40 e 39%, em média, para a combinação CIM10X de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente, e uma redução de 52, 42, 45 e 40%, em média, para a combinação CIM50X de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente.
Figura 7. Gráfico de biofilme em formação para C. metapsilosis mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X.
A espécie C. orthopsilosis apresentou uma redução de 60, 48, 50 e 48%, em média, para a combinação CIM10X de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente, e de 53, 43, 36 e 48% para a combinação CIM50X de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente. Adicionalmente, foi testado o efeito de cada droga isolada nas concentrações em estudo sobre a formação do biofilme; os valores obtidos foram subtraídos do valor das drogas em combinação. Todo experimento foi realizado em triplicata.
Figura 8. Gráfico de biofilme em formação para C. orthopsilosis mostrando as percentagens de inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos nas CIM10X e CIM50X.
7.5 EFEITO DA CsA E DROGAS ANTIFÚNGICAS ISOLADAS SOBRE BIOFILME MADURO DE C. parapsilosis
Os resultados das combinações CIM10X CsA/drogas antifúngicas não apresentaram relevância estatística sobre o biofilme maduro de nenhuma das espécies do Complexo C. parapsilosis
Na combinação CIM50X CsA/drogas antifúngicas, ocorreu uma redução de 42, 64, 38 e 66%, em média, para combinação AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA respectivamente, para a espécie C. parapsilosis stricto sensu. Na espécie C. metapsilosis, foi observado uma redução de 57, 31, 39 e 42%, em média, para a combinação de AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente, e de 51, 48, 42 e 54% para a combinação AMB/CsA, FCZ/CsA, CASP/CsA e VRZ/CsA, respectivamente, para C. orthopsilosis.
Ademais, foi testado o efeito de cada droga isolada nas concentrações em estudo sobre o biofilme formado, os valores obtidos foram subtraídos do valor das drogas em combinação. Todo experimento foi realizado em triplicata.
Figura 9. Gráfico de biofilme maduro para C. parapsilosis stricto sensu. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X.
Figura 10. Gráfico de biofilme maduro para C. metapsilosis. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X.
Figura 11. Gráfico de biofilme maduro para C. orthopsilosis. Inibição do sinergismo entre CsA/antifúngicos estatisticamente significante na CIM50X.
8 DISCUSSÃO
Nas últimas duas décadas, houve um significativo aumento na frequência de infecções causadas pelo gênero Candida (BASSETTI et al., 2011). Isso se deve em parte ao crescimento do número de pacientes imunocomprometidos ou submetidos a procedimentos médicos cirúrgicos invasivos (SILVA et al., 2005; SMEEKNS et al., 2013), em consequência, foram sendo divulgados relatos de resistência antifúngica e uma elevação nas taxas de mortalidade e morbidade (CHONG et al., 2007; NUCCI et al., 2010).
A epidemiologia da candidíase está mudando ao longo dos anos e espécies não- albicans vêm ganhando atenção mundial (CANTÓN et al., 2011; BASSETTI et al., 2011). Dentre essas espécies, o Complexo C. parapsilosis tem sido reconhecido como um importante patógeno emergente (PFALLER et al., 2007), relatado em alguns países como a segunda espécie de Candida mais isolada em quadros de candidemias (CANTÓN et al., 2010; BASSETTI et al., 2011). Além disso, possui uma tendência a ser mais isolada em recém-nascidos e pacientes que fazem uso de nutrição parental e/ou cateteres (VAN ASBECK et al., 2007; SILVA et al., 2009).
Desde a descrição do Complexo C. parapsilosis (TAVANTI et al., 2005), muitos estudos têm sido realizados para descrever o perfil de sensibilidade a antifúngicos de uso clássico. Embora o perfil de resistência não seja uma característica comum ao Complexo, Silva e colaboradores, 2009, relataram cepas resistentes aos compostos azólicos e uma sensibilidade reduzida a equinocandinas (SPREGHINI et al., 2012). Vários fatores são responsáveis pela resistência antifúngica em biofilmes (RAMAGE et al., 2005; CHANDRA; MUKHERJEE; GHANNOUM, 2012; SHINDE et al., 2012), destacando a calcinurina como um dos responsáveis a resistência às drogas antifúngicas (UPPULARI et al., 2008). A combinação de drogas com ações diferentes podem inibir múltiplos alvos celulares e, portanto, é de grande importância a busca de novas estratégias para resolver as questões referentes ao perfil de sensibilidade (BACHMANN et al., 2003; UPPULURI et al., 2008).
No presente estudo, foi demonstrado que a ciclosporina A (CsA), um potente inibidor de calcineurina, é capaz de interferir no crescimento da forma planctônica de cepas de C. parapsilosis stricto sensu; contudo, para as duas outras cepas do Complexo apresentou menor efeito sobre o crescimento celular. Li e colaboradores, 2008, já
demonstraram que a CsA usada, isoladamente, tem fraca atividade antifúngica contra C. albicans, com um valor de CIM de 512 mg/mL. Em 2012, mais recentemente, Shinde e colaboradores relataram uma CIM de 250 µg/mL, também para a espécie C. albicans. Sendo assim, com base nos nossos resultados e em comparação com esses dois estudos citados anteriormente, sugere-se que as espécies do Complexo C. parapsilosis são mais sensíveis a CsA.
Os resultados aqui apresentados confirmam que a CsA aumenta a atividade in vitro de antifúngicos contra cepas do Complexo C. parapsilosis. Foi observado sinergismo entre CsA e AMB, FCZ, VRZ e CASP, com índices FICI tão baixos quanto 0,035 para CsA mais CASP. O aumento da sensibilidade de C. parapsilosis stricto sensu em combinações com a CsA pode ser de importância prática, haja visto, que os estudos epidemiológicos têm mostrado que é a espécie mais prevalente do Complexo (CANTÓN et al., 2011; GARCÍA-EFFRON et al., 2012) e também é mais propensa a desenvolver resistência aos antifúngicos (SILVA et al., 2009).
O potencial sinergético de inibidores da calcineurina e antifúngicos vem sendo descrito na literatura. Estudo realizado por Marchetti e colaboradores, 2000, demostrou a ação antifúngica da combinação de FCZ e CsA frente a cepas de C. albicans. Desde então, vários estudos têm comprovado que os inibidores da calcineurina apresentam efeito sinérgico quando combinados a drogas antifúngicas, frente a cepas de C. albicans (UPPULURI et al., 2008), Cryptococcus neoformans (DEL POETA et al., 2000), Aspergillus fumigatus (STEINBACH et al., 2004) e Mucorales (SHIRAZI; KONTOYIANNIS, 2013).
Os resultados do presente estudo demonstram, pela primeira vez, o potencial inibitório de combinações formadas por CsA e antifúngicos contra as espécies do Complexo C. parapsilosis, o que leva a supor que a inibição da calcineurina também pode ter efeito contra cepas do Complexo C. parapsilosis resistente, como mostrado previamente para C. albicans (UPPULARI et al., 2008), haja vista que todas as cepas testadas foram sensíveis aos antifúngicos e que ocorreu uma redução da CIM causada pelo sinergismo com CsA.
Após estabelecido as concentrações inibitórias mínimas em sinergismo (CIMsin) frente a células planctônicas, alcançadas pela combinação da CsA com antifúngicos, buscou-se avaliar o efeito de tais combinações contra biofilmes, já que o estudo realizado por Shinde e colaboradores, 2012, apresentara resultados promissores na abordagem combinatória de CsA/antifúngicos contra o biofilme de C. albicans.
O Complexo Candida parapsilosis tem sido frequentemente relacionado com biofilmes em dispositivos médicos de longa permanência (SARDI et al., 2013). Infecções associadas aos biofilmes de fungos são considerados um desafio terapêutico, principalmente em indivíduos imunocomprometidos (SENEVIRATNE et al., 2007; CHANDRA; MUKHERJEE; GHANNOUM, 2012), os quais protegem o fungo contra a ação dos antifúngicos (CANTÓN et al., 2010).
Embora a CsA isoladamente não tenha efeito contra biofilmes de fungos, combinações sinérgicas com antifúngicos têm se mostrado eficazes contra estas estruturas (UPPULURI et al., 2008; CHEN et al., 2011; SHINDE et al., 2012). Os resultados do presente estudo destacam o potencial farmacológico da inibição da calcineurina como uma abordagem anti- biofilme. Ou seja, a literatura científica vem mostrando a importância da calcineurina na sobrevivência dos fungos e que a inibição desta confere aos microrganismos mais sensibilidade à ação dos antifúngicos utilizando, como modelo, essa via de ação farmacológica para desenvolvimento de novas drogas para o combate das infecções fúngicas. Embora o mecanismo exato por trás do efeito sinérgico provocado pela CsA com várias drogas antifúngicas ainda não esteja elucidado (MANCHETTI et al., 2003; SHINDE et al., 2012), mais estudos nessa linha de pesquisa devem ser estimuladas para melhor compreensão desse mecanismo.
Os resultados permitem concluir que as combinações formadas por CsA e antifúngicos são capazes de inibir o crescimento de espécies do Complexo C. parapsilosis na forma planctónica, de reduzir a sobrevivência das células em biofilmes maduros e de evitar a formação de biofilme. Estes resultados reforçam o potencial de inibição da calcineurina em fungos como uma abordagem promissora para aumentar a eficiência de drogas antifúngicas.
9 CONCLUSÃO
1. A ciclosporina inibe o crescimento in vitro de cepas do Complexo Candida parapsilosis em fase planctônica;
2. Cepas de C. parapsilosis stricto sensu apresentam maior sensibilidade a ciclosporina A que cepas de C. orthopsilosis e C. metapsilosis;
3. A ciclosporina A age de forma sinérgica com anfotericina B, azólicos e caspofungina na inibição de cepas do Complexo Candida parapsilosis em forma planctônica e biofilme.