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1.8.1. Mecanismos Moleculares Básicos

Os carboidratos interagem com as lectinas através de ligações de hidrogênio, coordenação metálica e interações hidrofóbicas. A disponibilidade de grande número de grupamentos hidroxila na estrutura dos carboidratos ligantes possibilita a formação de uma rede complexa de contatos cooperativos lectina-carboidrato, via ligações de hidrogênio, onde o grupamento hidroxila funciona como aceptor e/ou doador. Os átomos de cadeias laterais de aminoácidos, tais como Ácido Aspártico e Asparagina, hidrogênios de ligações amídicas e o oxigênio das carbonilas participam, usualmente, das ligações de hidrogênios envolvidas na interação com o carboidrato. Outras cadeias laterais de outros aminoácidos participam com menos freqüência. As ligações de hidrogênio na interface lectina-carboidrato podem ser diretas ou mediadas por moléculas de água (Elgavish & Shaanan, 1997).

Os cátions divalentes, tais como o Ca(II) e o Mn(II) nas lectinas de leguminosas, estão envolvidos indiretamente no mecanismo molecular de reconhecimento glicídico. Os íons estão localizados coordenados próximos a esse sítio de reconhecimento nas lectinas de leguminosas. As cadeias laterais dos aminoácidos Ácido Aspártico e Asparagina coordenam esses cátions, a Asparagina também faz uma ligação de hidrogênio com o glicídeo ligante. Portanto, além de servirem para a manutenção da integridade das subunidades dessas lectinas, os íons metálicos ajustam os resíduos de aminoácidos envolvidos no sítio ligante glicídico, auxiliando-os na interação com o carboidrato; no entanto não interagem diretamente com mesmo. Nas lectinas animais do Tipo C, o carboidrato ligante coordena diretamente com íon Cálcio(II) por meio de duas

hidroxilas e as demais são estabelecidas com as cadeias laterais dos aminoácidos Asparagina e Ácido Glutâmico (conservados nas lectinas tipo C), próximos ao sítio de ligação do carboidrato. As demais ligações de coordenação do íon Cálcio(II) são estabelecidas com quatro grupamentos carbonila provenientes desses mesmos aminoácidos citados(Sharon, 1993).

Figura 4 - Posições dos íons Ca(II) e Mn(II) nas proximidades do sítio de ligação glicídico da Concanavalina A (Loris e cols., 1998).

Apesar da característica hidrofílica dos carboidratos, as interações hidrofóbicas estabelecem uma função principal no reconhecimento glicídico pelas lectinas. Essas interações são particularmente notáveis em lectinas específicas para galactose, onde existe uma formação de carga parcial positiva formada pelos prótons de uma das faces do anel glicídico com uma carga parcial negativa, formada pelos elétrons π de um aminoácido com cadeia lateral aromático.

1.8.2. A Especificidade Primária, a Seletividade e Multiplicidade de Ligações

As lectinas, embora sejam ligantes específicas de carboidratos, possuem uma afinidade relativamente baixa por monossacarídeos (na ordem de mM). A seletividade das lectinas por seus alvos naturais específicos dá-se em função de múltiplos sítios de ligação adicionais àqueles que determinam a especificidade. Os sítios determinantes da especificidade são denominados sítios primários. A multiplicidade de ligações é proporcionada por subsítios de ligação (ou sítios extendidos) ou por subunidades multivalentes (Elgavish & Shaanan, 1997).

Em ligações que envolvem subsítios, um monossacáride (carboidrato específico), usualmente terminal, está intimamente ligado no sítio primário da lectina juntamente com os monossacárides posteriores da cadeia do oligossacáride. Esses monossacárides se ligam em sub-sítios da lectina, possibilitando uma magnitude seletiva muito maior do que aquela obtida com o monossacáride sozinho.

Figura 5 - Representação esquemática do sítio de ligação glicídico de um monômero de lectina com o efeito de ligações multiplas adicionais. Adaptado de Kennedy e cols. (1995).

As linhas cheias representam o sítio de especificidade primária, ou seja, o sítio determinante do monossacáride específico. As linhas tracejadas representam as interações adicionais entre os subsítios da lectina e os demais glicídeos que formam o oligossacáride.

Enquanto a seletividade fundamental das lectinas é provavelmente devida aos mecanismos de múltiplas ligações adicionais, o fator discriminatório mais importante no reconhecimento glicídico continua sendo a ligação ao sítio primário específico da lectina. Esse sítio também é indicativo do tipo de oligossacáride ou carboidrato complexo que poderá ser reconhecido pela lectina. Portanto, lectinas específicas para manose se ligam em séries de carboidratos complexos portadoras de resíduos de Manose ou Glicose terminais e lectinas específicas para galactose vão se ligar em séries de oligossacárides ou cadeias complexas de carboidratos que contenham resíduos terminais de galactose (Elgavish & Shaanan, 1997). As interações adicionais, aquelas devidas aos subsítios, serão efetivadas pelos carboidratos posteriores ao carboidrato ligante terminal no sítio primário (como visto esquematicamente na Fig. 5).

1.8.3. Fundamentos da especificidade de lectinas 2-N-acetilgalactosamina específicas Embora os mecanismos moleculares de reconhecimento glicídico sejam muito semelhantes e comuns entre as lectinas de leguminosas, cada especificidade de uma dada família de lectinas envolve uma estereoquímica única e característica, a qual é determinante do sítio principal de ligação ao carboidrato. Essa estereoquímica proporciona uma discriminação de ligantes suficientemente efetiva, de forma a distinguir diferenças sutis em determinadas configurações de átomos da estrutura dos carbonos assimétricos presentes nos carboidratos. Isso pode ser demonstrado quando se comparam as lectinas específicas para Manose/Glicose e para Galactose: a única diferença estrutural entre esses carboidratos é a configuração estereoquímica da hidroxila do carbono 4 (equatorial na manose/glicose e axial na galactose), o que já é suficiente para que as lectinas específicas respectivas estabeleçam sua discriminação (Elgavish & Shaanan, 1997).

Figura 6 - Estruturas químicas da N-acetilgalactosamina e da Galactose.

Para uma melhor compreensão das interações envolvidas no reconhecimento das lectinas específicas para 2-NacGal, a Lectina da Dolichos biflorus ou DBL é uma boa ferramenta de estudo. A DBL é uma lectina tetrâmera que possui, dentre todas as lectinas específicas para 2-NacGal, uma seletividade muito maior para 2-N- acetilgalactosamina do que para a Galactose (Hamelryck e cols., 1999). A 2- N- acetilgalactosamina se liga ao sítio de especificidade primária através da tríade de resíduos de aminoácidos conservada entre as demais lectinas (Asp85, Gly103 e Asn129, no caso da DBL) e também próxima ao sítio de coordenação com os íons metálicos; os quais são formados de aminoácidos também conservados entre as demais lectinas. Na

figura a seguir tem-se um esquema sumário das ligações de hidrogênio presentes na ligação da 2-N-acetilgalactosamina no sítio primário da DBL.

Figura 7 - Representação esquemática das ligações de hidrogênio envolvidas no reconhecimento 2-NacGal-DBL.

Em (A) tem-se o padrão de ligações de hidrogênio presentes no sítio de ligação da 2-NacGal à DBL, os aminoácidos são representados por abreviaturas; em (B) temos uma representação bidimensional da 2- NacGal (em branco) no sítio ligante da DBL determinado segundo dados de cristalografia, os átomos em vermelho são Oxigênios e em azul-escuro são Nitrogênios, todas as seqüências de aminoácidos envolvidos na ligação são representados por letras do alfabeto para melhor visualização do sítio ligante. Veja as explicações das seqüências coloridas dos aminoácidos no texto. Modificado de Loris e cols., (1998) para (A) e de Hamelryck e cols. (1999) para (B).

As interações específicas envolvidas na ligação 2-NacGal-DBL podem assim ser resumidas: a cadeia lateral do resíduo de Asp85 (precedido de Ala84, ambos em azul na fig.7), estabelece ligações de hidrogênio com as hidroxilas dos carbonos 3 e 4 da 2- NacGal; o oxigênio carbonílico da cadeia lateral do resíduo de Asn129 (em amarelo, na fig.6) auxilia na coordenação do Ca(II) e o átomo de nitrogênio do grupo amida (ligação peptítica) faz ligação de hidrogênio com a hidroxila no carbono 4; a hidroxila do carbono 3 da 2-NacGal compartilha ligação de hidrogênio com o nitrogênio do grupo amida da Gly103 e o hidrogênio desta (cadeia lateral) faz ligação com o oxigênio

carbonílico do grupo N-acetil da 2-NacGal. Ligações de hidrogênio adicionais são observadas entre o oxigênio da cadeia lateral da Ser215 (em verde na fig.6) e a hidroxila do carbono 6, e entre o nitrogênio amídico da Leu214 (também em verde) e a hidroxila do carbono 4 da 2-NacGal. O efeito estérico e hidrofóbico da presença da cadeia lateral da Leu214 é responsável pela preferência da DBL pelos anômeros α da 2-NacGal, uma vez que as hidroxilas configuradas em β não se interagem com uma cadeia lateral hidrofóbica como a Leu (Hamelryck e cols., 1999). Os aminoácidos Leu214 e Ser215 (em verde na fig.6) formam o “loop” de especificidade da DBL. Em adição às ligações de hidrogênio, as Interações Hidrofóbicas exercem um papel importante na ligação específica: as cadeias laterais de Tyr104 e Trp132 (em laranja e amarelo, respectivamente na fig.6) formam um “bolso” hidrofóbico que interage com o grupo metil pertencente ao grupamento N-acetil da 2-NacGal (susbstituinte em C2).