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Através da mosca-brancas o isolado de ToSRV foi transmitido para 19 espécies das 26 de plantas testadas (Tabela 8). Foram observados diversos sintomas de acordo com a espécie de planta hospedeira testada.

A detecção viral de todas as plantas testadas foi realizada via PCR com os oligonucleotídeos universais PALIv1978/PAR1c496.

Em plantas como Chenopodium amaranthicolor, Nicandra physaloides, Physalis floridana e Lycopersicum esculentum cv ‘Santa Clara’, após 20 dias da transmissão foi possível a observação de sintomas visuais nas folhas. Para as demais plantas os sintomas apareceram após 35-60 dias. Para algumas plantas de Capsicum sp. positiva por PCR, os sintomas foram observados após 90 dias.

Tabela 8. Relação de plantas hospedeiras utilizadas para avaliação e sintomas observados do isolado ToSRV[PJU] transmitidos por mosca-branca.

Espécie testada PCR Número de plantas positivas/inoculadas Sintomas Capsicum annum Magali R + 7/10 Mq Magda + 8/10 Mq Rubia R + 8/10 Mq Martha + 7/10 Mq Bruna + 5/10 Pc e cn Italiano amarelo + 4/10 - Paloma + 1/7 Mq Impacto + 3/9 Mq Doce Comprida + 5/6 - Capsicum frutescens + 4/10 Mq Chenopodium amaranthicolor + 2/10 Pc Chenopodium quinoa - 0/10 - Datura stramonium - 0/10 - Gomphrena globosa - 0/10 - Nicandra physaloides + 2/10 M e em Nicotiana rústica + 1/10 Mq Nicotiana clevelandii + 5/10 A Nicotiana glutinosa - 0/10 - Nicotiana tabacum TNN - 0/10 - Havana 425 - 0/10 - Petunia hybrida + 1/10 -

Phaseolus vulgaris cv ‘Pérola’ + 4/9 -

Physalis floridana + 3/10 Cn e em

Glycine max ‘Conquista’ - 0/10 -

Lycopersicum esculentum cv

‘Santa Clara’ + 2/10 Ci

Vigna unguiculata + 5/10 -

(-) : ausência de sintomas; cn: clareamento de nervura; en: enrugamento; M: mosaico; Mq: mosqueado; ci: clorose internerval; Pc: pontos cloróticos; A: amarelecimento

Figura 24. Observação de sintomas 30 dias após a transmissão de vírus com mosca-

branca virulíferas. A) Chenopodium amaranthicolor, pontos cloróticos; B) Physalis floridana, clareamento de nervura e enrugamento foliar e C) Nicandra physaloides, mosaico e enrugamento foliar.

Tentativa anteriores foram feitas usando como fonte de inóculo pimentão positivo com ToSRV[PJU], observando-se que as moscas brancas (mantidas em plantas de soja no IAC) quando transferidas para aquisição do begomovírus em pimentão apresentavam alta taxa de mortalidade. Este experimento indicou que o pimentão não é um hospedeiro preferencial da mosca-branca, quando presente outra cultura como fonte de alimento. Outra tentativa, realizada no IAC, foi forçar as moscas brancas a formar sua população em plantas de pimentão sadio, no entanto a reprodução destas no pimentão sempre foi insuficiente para realização do teste de transmissão para todas as espécies de plantas propostas no estudo. Durante a coleta de amostras de pimentão, em estufas com alta população de mosca-branca foram obtidas algumas ninfas presentes em planta de pimentão, afim de se iniciar uma colônia a partir de moscas coletadas diretamente desse hospedeiro. Entretanto, foram encontradas dificuldades no estabelecimento de uma colônia com boa população desses insetos. Morales e Jones (2004), estudando a ecologia e epidemiologia da mosca branca,

confirmaram que um dos fatores para o crescimento da população do vetor é a temperatura que deve permanecer com uma média de 24ºC ou mais para o desenvolvimento do ciclo do inseto. Durante as tentativas, a temperatura era inferior a 24°C ou ocorria frentes frias freqüentemente o que possivelmente explica o insucesso no estabelecimento da praga.

Aproximadamente 50% do feijão ‘Pérola’ e o feijão caupi foram infectados pelo ToSRV[PJU] utilizando-se a mosca-branca como vetora, indicando que os begomovírus que infectam solanáceas em condições de campo também podem infectar leguminosas como hospedeiras alternativas, porém sem causar danos aparentes dada a ausência de sintomas observados. No caso do ToRMV, espécie que apresentou alta identidade da AC1 e do componente B com o isolado de ToSRV[PJU], o componente B deste vírus já foi verificado infectando naturalmente feijão que se encontrava ao lado de plantações comerciais de tomate, porém não tendo sido encontrado o componente A correspondente, indicando que naturalmente este vírus também poderia infectar feijão (Fernandes et al., 2006). Em condições de laboratório, utilizando-se a transmissão por extrato vegetal e biobalística, o ToRMV nunca foi transmitido para feijão, bem como para o pimentão utilizando-se o extrato e a enxertia (Fernandes et al., 2006), mostrando comportamento diferencial de hospedeiras quando comparado ao ToSRV[PJU]. O isolado ToSRV[PJU] mostrou-se capaz de infectar somente as espécies de fumo N. rustica e N. clevelandii e curiosamente causou sintomas de pontos cloróticos em C. amaranthicolor.

Todas as cultivares de pimentão testados foram infectados pelo ToSRV[PJU] em quantidades variadas, demonstrando sintomas de mosqueado, pontos cloróticos e clareamento de nervura ou ausência de sintomas no caso do pimentão italiano amarelo (Tabela 8), indicando alta suscetibilidade das cultivares atualmente encontradas no mercado.

6.4 Caracterização citológica

As células das plantas infectadas foram examinadas por microscopia eletrônico de transmissão para averiguar possíveis modificações citológicas provocadas pelo ToSRV [PJU] no hospedeiro. A morfologia das células de folhas infectadas e com sintomas da doença foram comparadas com as células de folhas sadias.

Foram encontradas algumas modificações no nucléolo das células associadas ao tecido vascular de plantas infectadas com o ToSRV[PJU], semelhantes às causadas pelo BGMV em feijoeiro (Kim et al. 1978). Leve hipertrofia do nucléolo em comparação ao nucléolo da célula sadia (Figuras 25), segregação do nucléolo (Figuras 26) e o aparecimento de anéis fibrilares de vários tamanhos associados com o nucléolo segregado (Figura 27) foram visualizados somente em plantas doentes.

Kim et al. (1978) verificaram que em feijoeiro estas modificações ocorriam após seis dias de inoculação e somente nas células do floema, não tendo sido verificado alterações do nucléolo em células da epiderme, mesofilo e do xilema. Da mesma forma encontraram partículas virais somente no núcleo de células do floema.

Em células infectadas também foram verificados menor número de cloroplastos em relação à célula sadia e grânulos presentes no interior da mitocôndria (Figura 28). Foram observados grânulos de cristais próximos a parede celular tanto em célula infectadas como sadias (Figura 29).

Figura 25. Eletrofotomicrografia de células associadas ao tecido vascular de pimentão

Figura 26. Eletrofotomicrografia de células associadas ao tecido vascular de pimentão

Lilac infectado pelo ToSRV[PJU]. A-segregação do nucléolo (N) em célula infectada. B-seta indica a formação de pequeno anel fibrilar e nucléolo e estágio mais avançado de segregação. Aumento 9.750 X e 13.250X, respectivamente.

N

N

Figura 27. Eletrofotomicrografia de células associadas ao tecido vascular de pimentão

Lilac infectado pelo ToSRV[PJU]. A) Anel fibrilar formado apartir do nucléolo segregado em célula infectada e B) setas indicam o anel fibrilar maior e e pequenos anéis. Aumento 9.750 X e 31.500X, respectivamente.

Figura 28. Eletrofotomicrografia de nervura foliar de Pimentão Lilac infectada por ToSRV

[PJU]. Observação de grânulos no interior da mitocôndria. Aumento 23.000X

Figura 29. Setas indicando os grânulos de cristais observados em células de plantas sadia (A)

e em células de planta infectada por ToSRV[PJU]. Aumento 7750X e 23000X respectivamente.

A