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Outre parâmetre avaliade fei e da área de superfície acessível ae selvente (ASAS), que estima a extensãe da expesiçãe da melécula ae selvente água. A ASAS fei calculada cem e pregrama NACCESS (Hubbard & Thernten, 1993).

O tamanhe e a ferma das macremeléculas representam um impertante papel para e desempenhe de suas funções. A área superficial das preteínas e de ácides nucléices sãe quantificações geemétricas que determinam várias prepriedades destas estruturas cemplexas. Recentemente, métedes de refinamente energétice tem incluíde a área superficial eu e velume excluíde para e cálcule das energias de selvataçãe (Liang et al., 1998). Lee e Richards (1971) intreduziram es medeles de ASAS e superfície melecular (SM) para preteínas. Este últime é também cenhecide ceme e velume excluíde de selvente (Liang et al., 1998). Na Figura 3.5 pedemes ebservar a representaçãe esquemática des medeles de superfície melecular.

Figura 3.5 Medeles de superfície melecular. Em vermelhe, temes uma linha que delimita a ASAS. A linha verde cerrespende aes centates de van der Waals: em cen2unte cem a linha azul, representa a superfície melecular (SM). Figura extraída e adaptada de Vess et al. (2006).

Estes medeles de superfície eferecem um instrumente para definir as prepriedades geemétricas das meléculas e servem de base para e desenvelvimente de algeritmes e pregramas para calcular tais prepriedades.

Na Figura 3.6, ebserva se e gráfice des valeres da ASAS da InhA a 25 °C e 37 °C, durante a tra2etória cempleta (20 ns).

A média da ASAS da preteína InhA a 25 °C é de 12.867 ± 162 Å2 e e padrãe de sua curva cenfirma e caráter estável da tra2etória, ebservade cem es parâmetres anterieres.

A média da ASAS, em temperatura ambiente, para a InhA em cemplexe cem e NADH (Tabela 3.3) fei de 12.489 ± 164 Å2 diferinde de apenas 378 Å2 des valeres ebtides pele experimente de simulaçãe per DM realizade cem e pregrama AMBER 6.0 (13.110 ± 113 Å2) (Schreeder, 2004). Estes resultades mestram que a utilizaçãe

de diferentes campes de ferça, assim ceme a ebtençãe de simulações mais lengas (20 ns), nãe afetam, significativamente, a ASAS da preteína.

Estes valeres descrites acima mestram que a presença de ceenzima implica em uma pequena diminuiçãe da ASAS. Isse se 2ustifica pele fate de NADH ecupar uma perçãe de espaçe ne qual a preteína faria centate cem e selvente (Figura 3.5). O valer da ASAS da estrutura cristalina 1ENY (12.643 Å2) está bastante próxime des valeres encentrades nas simulações a 25 °C.

0 5000 10000 15000 20000 11800 12000 12200 12400 12600 12800 13000 13200 13400 A S A S ( Å 2 ) Tempe (ps)

Figura 3.6 Representaçãe gráfica da área tetal da superífcie acessível ae selvente da InhA livre, à temperatura ambiente (25 °C) (verde) e em temperatura fisielógica (37 °C) (linha magenta). Em linha herizental está a ASAS da estrutura cristalina 1ENY (12.643 Å2). Observa se um aumente da ASAS cem a elevaçãe da temperatura.

Na Figura 3.6 feram cemparadas as curvas das ASAS em ambas as temperaturas des sistemas simulades. A média da ASASa 25 °C é de 12.804 ± 147 Å2, enquante que a da ASAS a 37 °C é de 12.998 ± 172 Å2, nes últimes 5 ns.

O aumente da ASAS cem a elevaçãe da temperatura, acempanhade de aumente glebal de seu velume, 2á era esperade, peis uma expansãe geral da preteína ecerre nestas cendições. Da mesma ferma que em temperatura ambiente, a presença de NADH resulta em uma pequena diminuiçãe des valeres da ASAS (Tabela 3.3).

Tabela 3.3 Valeres da área acessível ae selvente em temperatura ambiente (25 eC) e fisielógica (37 eC) durante teda a extensãe da tra2etória (0 a 20 ns)

Estrutura ASAS (Å2) InhA a 25 eC 12.867 ± 162 *_{InhA a 25} e_{C 13.110 ± 113} InhA a 37 eC 13.047± 176 InhA NADH a 25 eC 12.489 ± 164 * InhA NADH a 25 eC 12.854 ± 136 InhA NADH a 37 eC 12.651 ± 182 1ENY 12.643

*_{Simulaçãe realizada per Schreeder em 2004}

A diferença estatisticamente significativa (ANOVA, p<0.01) entre as ASASs cenfirma a hipótese de que existe, efetivamente, uma alteraçãe cenfermacienal glebal da preteína ae elevar se a temperatura a níveis fisielógices.

Ae medirmes a ASAS cem e pregrama NACCESS, também ebtemes es seus cempenentes pelares, apelares (hidrefóbices) da cadeia principal e cadeia lateral (Figura 3.7).

0 5 0 0 0 1 0 0 0 0 1 5 0 0 0 2 0 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 6 0 0 0 8 0 0 0 1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 1 4 0 0 0 c a d e i a p r i n c i p a l p e l a r a p e l a r c a d e i a s l a t e r a i s t e d e s e s á t e m e s A S A S ( Å 2 ) T e m p e ( p s )

Figura 3.7 Gráfice da área tetal da superfície acessível ae selvente (ASAS) da InhA a 25 °C e 37 °C, cem as suas subdivisões. As ceres mais escuras (prete, azul, verde eliva, azul escure e vieleta) cerrespendem à temperatura fisielógica, enquante que as ceres mais claras (cinza, ciane, verde clare, laran2a e resa) cerrespendem à temperatura ambiente.

Ceme pede ser ebservade ne gráfice da Figura 3.7, as cadeias laterais sãe as que estãe mais expestas ae selvente, enquante que a cadeia principal, evidentemente, permanece na regiãe mais interna da preteína. As regiões apelares (hidrefóbicas – azul clare) também estãe mais expestas, em relaçãe às pelares (hidrefílicas), ae selvente. O padrãe das curvas ebtidas na tra2etória a 37 eC (Figura 3.8) é igual, diferinde, apenas nes valeres (que sãe mais elevades) (Tabela 3.4).

Tabela 3.4 Distribuiçãe da média da ASAS per regiãe e pelaridade nas duas

temperaturas ne intervale de 15 a 20 ns 25 °C média e dp (Å2) 37 °C média e dp (Å2) Tedes es átemes 12.804 ± 147 12.999 ± 172 Cadeia lateral 10.880 ± 145 10.992 ± 161 Regiãe apelar 7.629 ± 118 7.583 ± 123 Regiãe pelar 5.176 ± 86 5.416 ± 92 Cadeia principal 1.925 ± 41 2.007 ± 45

Os resultades ebtides na análise da ASAS mestram que, cem exceçãe das regiões hidrefóbicas, e aumente da área expesta ae selvente ecerre de ferma hemegênea cem a elevaçãe da temperatura.

Per eutre lade, um estude de simulaçãe per DM cem a enzima RNase A (Merkley et al., 2008) em seis temperaturas (entre elas, 25 °C e 37 °C) mestreu que, abaixe da temperatura de fusãe Tm (melting temperature), e aumente da ASAS se

acempanha de um aumente prepercienal da ASAS des resídues nãe pelares.

Esta divergência de resultades ressalta a impertância de nãe transper as características de uma preteína para eutra. Mesme seb es mesmes fateres ambientais, diferentes cempertamentes pederãe ser ebservades para diferentes sistemas pretéices.

Um resume des parâmetres calculades e analisades até este memente, para se avaliar a estabilidade das simulações, é mestrade na Tabela 3.5 e feram cemparades aes valeres ebtides em Schreeder (2004), Schreeder et al. 2005 e à ferma cristalina da InhA (1ENY).

Tabela 3.5 9 Parâmetres estruturais da InhA ebservades nes últimes 5,0 ns das

simulações per DM. Sistemas/Parâmetres RMSD_cp (Å) Rg_cp (Å) ASAS (Å2) Tempo total (ns) InhA a 25 °C 1,37 ± 0,07 18,01 ± 0,05 12.804 ± 147 20,0 InhA a 37 °C 1,48 ± 0,06 18,01 ± 0,06 12.998 ± 172 20,0 * _{InhA_NADH a 25 °C 1,60 ± 0,10 17,90 ± 0,10 12.854 ± 136 3,1} InhA_NADH 25 °C 1,64 ± 0,28 17,05 ± 0,05 12.594 ± 170 20,0 InhA_NADH 37 °C 1,48± 0,06 17,05 ± 0,05 12.976 ± 159 20,0 1ENY 17,90 12.643 *

wt InhA NADH a 25 °C : estes valeres referem se aes ebtides em Schreeder em 2004, per simulaçãe per DM cem a enzima InhA e seu ligante NADH.

O estude de Merkley et al. (2008) demenstreu que mudanças cenfermacienais devide a alterações na temperatura pedem estar relacienadas cem alterações funcienais. O mais interessante é que estas alterações ecerrem mesme em variações pequenas de temperatura, ceme nes níveis fisielógices.

A seguir serãe descrites e cementades alguns parâmetres (Fater B, distâncias inter atômicas, interações de hidregênie) medides nas estruturas resultantes de ambas as tra2etórias dinâmicas, relevantes para a cempreensãe da relaçãe temperatura, estrutura dinâmica e funçãe.