Son yıllardaki hızlı kentleşme ve sanayideki gelişmeler çevresel bazı problemlere neden olmaktadır. Doğal akuatik sistemler evsel, endüstriyel ve diğer insan yapımı aktivitelerden dolayı büyük ölçüde kontaminasyona maruz kalmaktadır. Nehirlerdeki ağır metal kontaminasyonu, hızlı büyüyen şehirlerde bu problemlerin başında gelmektedir. Kimyasal kontaminantlar için güncel akuatik zarar tanımlama prossedürleri persistans, bioakümülasyon ve toksisiteye dayanır. Bununla birlikte metaller için bu değerlerin kritik seviyelerinin belirlenmesi güçtür. Çünkü metaller doğal olarak çevrede kalıcıdırlar ve hem esansiyel hem de esansiyel olmayan metaller doğal olarak biyobirikime uğrarlar. Ayrıca metallerin toksisiteleri jeokimyasal özelliklerden oldukça etkilenirler (DeFrost vd. 2007; Vinodhini, vd. 2008; Reza, vd. 2010).
Daha önce yapılan çalışmalarda antioksidan enzim sistemlerindeki değişimler üzerine ağır metal toksisitesinin etkilerinin belirlenmesi amacıyla çalışmaların yapılması gerekliliği vurgulanmıştır (Vinodhini vd. 2008). Örneğin detoksifikasyonda görev alan bir enzim olan glutatyon S-tranferaz enzimi Ağrı Dağı alabalığı solungaç dokusundan saflaştırılmış ve Hg2+
, Cu2+, Zn2+ ve Se4+ iyonlarının enzimi inhibe ettiği belirlenmiştir (Çomaklı, V., Kuzu, M. ve Demirdağ, R. 2015). Karaciğer monooksigenaz enzim sisteminin bir bileşeni olan ve NADPH kullanan enzim olan sitokrom P450 redüktaz enzimi Van Gölü balığı karaciğer dokusundan saflaştırılmış ve Hg2+
, Ag+ ve Cu2+ iyonlarının enzimi in vitro ortamda inhibe ettiği bildirilmiştir (Kuzu, M. ve Çiftci, M. 2015). Bununla birlike özellikle tiyoredoksin redükraz enzimi üzerine ağır metallerin etkileri konusunda literatürde oldukça sınırlı bilgi bulunmaktadır. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada mitokondriyel TrxR enzimi alabalık karaciğer dokularından saflaştırılmış ve karakterize edilerek bazı ağır metallerin enzim aktivitesi üzerine in vitro etkileri incelenmiştir (Özgençli ve Çiftci, 2016).
Yapılan bu çalışmada ise sitozolik TrxR enzimi alabalık solungaç dokularında saflaştırılarak ilk defa bir balık türünün solungaçlarından elektroforetik saflıkta saflaştırılmış oldu. Saflaştırma işlemi ısı denatürasyonu ve 2',5'-ADP Sepharose 4B afinite kromatografisi teknikleri kullanılarak iki basamakta gerçekleştirildi. Afinite
54
kolonundan elde edilen enzimin saflığı SDS-PAGE ile kontrol edildi ve tek bant görüldü. Standart proteinler kullanarak elde edilen Rf -log MA grafiği yardımıyla enzimin monomer molekül ağırlığı ~64,1 kDa olarak hesaplandı. Daha önce yapılan diğer çalışmalarda ise mitokondriyel TrxR enzimi sığır adrenal korteksinden saflaştırılmış ve monomer molekül ağırlığı 56 kDa olarak belirlenmiştir (Watabe vd. 1999). Bu değer alabalığı karaciğer mitokondriyel TrxR için yaklaşık 70 kDa (Özgençli ve Çiftci, 2016), insan plasenta TrxR için 55,2 kDa (Gromer vd. 1998), rat karaciğer TrxR enzimi için 58 kDa olarak belirlenmiştir (Luthman ve Holmgren, 1982). Dolayısıyla alabalık solungaç sitozolik TrxR enzimin molekül ağırlığının literatür ile uyumlu olduğu söylenebilir.
Çalışma sonucunda Gökkuşağı Alabalığı solungaç dokusundan TrxR enzimi 184,1 kat saflaştırılmıştır. Diğer bir çalışma olan midye hepatopankreası tiyoredoksin redüktazının saflaştırılması ve bazı özelliklerinin incelenmesi amacıyla yapılan bir diğer çalışmada ise midye hepatopankreas ham ekstresinden sırayla amonyum sülfatla çöktürme, DEAE-Sefaroz CL-6B anyon değiştirici ve afinite (2',5'-ADP- agaroz) kromatografileri uygulanması sonucu adı geçen dokuda tiyoredoksin redüktazın 965 kez saflaştırılarak elde edildiği bildirilmiştir (Acar, 2013). TrxR enzimi daha önce sıçan karaciğerinden Sephadex jel filtrasyonu ve DEAE-selüloz kromatografileri kullanılarak 626 kat saflaştırıldığı belirtilmiştir (Larsson 1973).
2’5’-ADP Sepharose 4B afinite kromotografisi yöntemiyle gökkuşağı alabalık solungaç dokusundan saflaştırılan TrxR enziminin spesifik aktivitesi 1,0435 EÜ/mg bulundu. Literatür taraması sonucunda; Pigiet ve Conley (1977) saf tiyoredoksin redüktazın DTNB indirgeme metodu ile tayin edilen spesifik aktivitesinin 1,290 U/mg, Maggioli ve vd. (2004 ) 7,117/mg, Williams ve arkadaşları (1967) ise 1,020 U/mg olduğu, glutatyon redüktazınkinin ise 214 mol/dak (Pigiet ve Conley 1977), ve 210 mol/dak, (Williams ve Arscott 1971) olarak belirtilmiştir. Acar’ın (2013) çalışmasında enzimin saflık derecesi, SDS-PAGE uygulanması ve spesifik aktivitenin hesaplanması ile incelendiği belirtilmiştir. Bu çalışmada TrxR enziminin spesifik aktivitesi 29,745 EU/mg protein olarak saptandığı belirtilmiştir. Bu çalışmada, saf olarak elde edilen TrxR’ın spesifik aktivitesi bakımından, diğer türlerden izole edilen tiyoredoksin redüktazlarla kıyaslandığında 25 kat daha fazla
55
spesifik aktivite gösterdiği gözlenmektedir. Tiyoredoksin redüktaz aktivitesi DTNB bağımlı metodun yanı sıra, tiyoredoksin varlığında substrat olarak insulin kullanılan metod ile kanıtlanmıştır. Midye tiyoredoksin redüktazının, elektron vericisi olarak kullanılan NADPH varlığında insulindeki disülfid bağlarını redükleyebildiği tespit edilmiştir (Acar 2013).
Saflaştırılan enzim için optimum pH ve optimum iyonik şiddetin belirlenmesine yönelik aktivite ölçümleri yapıldı. Yapılan çalışmalar neticesinde enzimin en yüksek aktiviteyi pH 7.75 K-fosfat tamponunda gösterdiği bununla birlikte pH 7.0’dan sonra enzimin aktivitesini belirli bir düzeyde koruduğu tespit edildi. Bununla birlikte pH 7.75 ve 8.0’da Tris/HCl tampon ile yapılan aktivite ölçümlerinde ise aktivitenin K-fosfat tampon ile yapılan ölçümlere göre çok düşük olduğu görüldü. Yine farklı konsantrasyonlardaki K-posfat tamponunda yapılan aktivite ölçümlerinde enzim aktivitesinin 300 mM küvet içi konsantrasyonunda en yüksek olduğu belirlendi. Ancak aktivitenin 150 mM konsantrasyonundan sonra 550 mM konsantarasyona kadar göreceli olarak stabil olduğu görüldü. Daha önce yapılan çalışmada alabalık mitokondriyel TrxR enzimi için optimum pH 7.50, optimum iyonik şiddet ise 500 mM olarak verilmiştir (Özgençli ve Çiftci, 2016). E.coli enzimi için ise optimum pH’nın 7.7 olduğu ve K-fosfat ile yapılan ölçümlerdeki aktivitenin Tris/HCl ile yapılan ölçümlere kıyaslandığında 2 kat fazla olduğu bildirilmiştir (Moore, Reichard ve Thelander, 1964). Enzimin substratlarına olan ilgisini gösteren KM değerlerinin hesaplanması amacıyla beş farklı substrat konsantrasyonunda
aktivite ölçümleri yapılarak Lineweaver-Burk grafikleri çizildi. Buna göre enzimin NADPH ve DTNB için KM değerleri sırasıyla 7.88 μM ve 0.25 mM olarak
hesaplandı. Bu değerler daha önce yapılan çalışmalarda rat karaciğer TrxR için sırasıyla 6 μM ve 0.66 mM (Luthman ve Holmgren, 1982), sığır adrenal korteksi TrxR enzimin DTNB için 3.9 mM, insan plasenta TrxR enziminin NADPH için 18 μM olarak bildirilmiştir (Gromer vd. 1998). Bu değerlerle kıyaslandığında enzimin substratlarına ilgisi bakımından rat karaciğer enzimine benzer olduğu söylenebilir.
Sıçan karaciğerinden izole edilen tiyoredoksin redüktazın DTNB’e karşı KM
değeri 660 M, NADPH’a karşı 6 M olarak saptanmıştır (Luthman ve Holmgren 1982). Thermotoga maritima bakterinin (Yang ve Ma 2010) tiyoredoksin redüktazın Vmax değeri 115 mol NADPH olarak bildirilmiştir. Deinococcus radiophilus
56
tiyoredoksin redüktazının NADPH’a karşı KM ve Vmax değerleri sırasıyla 12,5 mol
ve 25 mol/dak., DTNB’a karşı KM ve Vmax değerleri ise sırasıyla 463 mol ve 756
mol/dak olarak tespit edilmiştir (Seo ve Lee 2010). Sıçan karaciğerinden saflaştırılan TrxR’ın NADPH’a karşı KM değerinin 40 mol olarak bildirilmiştir
(Larsson 1973).
Oksidatif hasara karşı koruma, hücresel stres tepkisi ve protein tamiri için anahtar role sahip tiyoredoksin sisteminin bir bileşeni olan TrxR içerdiği yapısal sistein rezidülerinden dolayı oksidasyona duyarlı hale gelir (Carvalho vd. 2008). Ayrıca selenol ve tiyol gruplarından dolayı enzimin özellikle iki değerlikli metal iyonları ile kompleks oluşturarak inhibe olabileceği aktarılmıştır (Özgençli ve Çiftci, 2016). Örneğin civanın toksik etkisini antioksidan regülasyonda gerekli olan glutatyon peroksidazı ve TrxR gibi selenoenzimleri inhibe ederek gösterebileceği vurgulanmıştır (Branco vd. 2012). Bu nedenle balık solungaç dokularında tiyoredoksin sisteminin ağır metallerden nasıl etkilendiğinin belirlenmesi amacıyla TrxR enzimi üzerine in vitro etkileri incelendi. Yapılan ölçümler sonucunda Ni2+, Cu2+, Pb2+, Cr3+, Fe3+, Ag+ iyonlarının enzim inhibe ettiği belirlendi. Elde edilen sonuçlar kullanılarak her bir iyon için % Aktivite- metal iyonu konsantrasonu grafiği çizildi ve buradan IC50 değeri bulundu. Daha sonra Cheng-Prusoff eşitliği
kullanılarak Kideğerleri hesaplandı. Etkisine bakılan metaller içerisinde en kuvvetli
inhibisyon etkisini Ag+ iyonu gösterdi. Bununla birlikte yine Ni2+ iyonu μM düzeyde inhibisyon etkisi gösterdi.
Daha önce yapılan çalışmalarda enzim aktivitesinin Ca2+
ve Mg2+ iyonları tarafından zayıf inhibe edilirken Cu2+
, Fe2+, Mn2+, Zn2+ gibi iki değerlikli metal iyonları tarafından kuvvetli inhibe edildiği bildirilmiştir (Watabe vd. 1999). Yine Özgençli ve Çiftçi tarafından yapılan çalışmada Se4+
, Cu2+ , Co2+ , Ni2+ , Fe3+ ve Al3+ iyonlarının alabalık karaciğer dokusundan saflaştırılan mitokondriyel TrxR üzerine etkileri incelenmiş Se4+
iyonunun enzimi aktive ettiği diğer metal iyonlarının ise mM düzeyde enzimin inhibisyonuna sebep oldukları bildirilmiştir (Özgençli ve Çiftci, 2016). Ağır metallerin biyolojik birikim özellikleri Cyprinus carpio türü üzerinde çalışılmış ve solungaç dokularında Cd>Pb>Ni>Cr sıralamasında metallerin toplanma eğiliminde olduğu belirtilmiştir (Vinodhini ve Narayanan, 2008).
57
Dolayısıyla ağır metallere maruz kalan balık türlerinde tiyoredoksin sisteminin bu durumdan etkileceği ve bu etkinin zamanla biyobirikimden dolayı artabileceği söylenebilir. Bu ise ağır metallerin toksik etkilerinin mekanizmalarından biri olarak değerlendirilebilir.
Hg2+, Cu2+, Se4+, Al3+ iyonlarının Ağrı Dağı alabalığı solungaç dokusundan saflaştırılmış glutatyon S-transferaz enzimin aktivitesi üzerine etkileri inclenmiştir. Yapılan çalışma sonucunda metal iyonlarının IC50 ve Ki değerleri bulunmuştur. Metal
iyonlarının IC50 değerleri; Hg2+ iyonu için 0,137 μM, Cu2+ iyonu için 0,159 μM, Se4+
iyonu için 0,239 μM, Al3+ iyonu için 4,08 μM, K
i değerleri ise; Hg2+ iyonu için 0,038
μM, Cu2+
iyonu için 0,044 μM, Se4+ iyonu için 0,066 μM, Al3+ iyonu için 1,134 μM olarak bildirilmiştir (Çomaklı, V., Kuzu, M. ve Demirdağ, R. 2015).
Burada Ag+ iyonunun inhibisyon etkisi oldukça dikkat çekicidir. Çünkü bu iyon için IC50 değeri 5.82 nm olarak hesaplanmıştır. Bunun nedeninin enzimin aktif
bölgesinde sistein aminoasitini içermesi olduğu düşünülmektedir. İnsan sitozolik TrxR enziminin üç tane yapısal sistein rezidüsü (Cys62
, Cys69 and Cys73) içerdiği ve bu rezidülerin Cys62
-Cys69 arasında aktivite kaybına sebep olan ikinci disülfid bağını oluşturarak enzimi oksidasyona dayanıksız hale getirdiği bildirilmiştir (Carvalho vd. 2008). Aktif ve katalitik bölgelerinde Cys ihtiva eden enzimler Ag+ ve Hg2+ gibi ağır metal iyonları ile –SH grubu üzerinden merkaptanlar oluşturarak inhibe oldukları bildirilmiştir (Keha ve Küfrevioğlu, 2010).
Sonuç olarak bu tez kapsamında ;
Gökkuşağı alabalığı solungaç dokusundan TrxR enziminin saflaştırılması için 2',5'-ADP Sepharose 4B afinite kromotografisi yöntemi kullanılmıştır. Bu yöntemle enzim saf olarak elde edilmiş ve saflaştırma sonuçlarının literatürle uyumlu olduğu görülmüştür.
Çalışma sonucunda Gökkuşağı Alabalığı solungaç dokusundan TrxR enzimi 1,0435 EU/mg spesifik aktiviteye sahip % 26,19 verimle 184,1 kat saflaştırılmıştır. Enzimin saflığı elektroforezde bulunan tek bant ile tespit edilmiştir.
Saflaştırılan Gökkuşağı Alabalığı solungaç dokusundan TrxR enzimi için yapılan karakterizasyon çalışmalarında optimum pH 7,75, optimum iyonik şiddet 300 mM potasyum fosfat olarak belirlenmiştir.
58
Gökkuşağı Alabalığı solungaç dokusundan saflaştırılan TrxR enzimi üzerine bazı ağır metal iyonlarının inhibisyon etkileri incelenmiştir. Ag+
, Ni2+, Pb2+, Fe3+, Cu2+,Cr3+ metal iyonlarıyla çalışılmıştır. Metal iyonları için IC50 ve Ki değerleri
hesaplanmıştır. İnhibisyon çalışmaları sonucunda metal iyonlarının düşük dozlarda TrxR enzimini inhibe ettiği görülmüştür.
59 KAYNAKÇA
Acar, E. (2013). Midye (Mytilus galloprovincialis Lam.) hepatopankreasından tiyoredoksin redüktaz enziminin saflaştırılması ve kinetik özelliklerinin incelenmesi. İstanbul Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Biyokimya Anabilim Dalı / Biyokimya Bilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi.
Arnér, E.S.J. ve Holmgren, A. (2006). The thioredoxin system in cancer. Seminars in Cancer Biology, 16, 420-426.
Arnér E.S.J., Focus on mammalian thioredoxin reductases – important selenoproteins with versatile functions, BBA-Gen. Subj. 2009 (1790) 495–526.
Arscott LD, Gromer S, Schirmer RH, Becker K, Williams CHJ. The mechanism of thioredoxin reductase from human placenta is similar to the mechanisms of lipoamide dehydrogenase and glutathione reductase and is distinct from the mechanism of thioredoxin reductase from Escherichiacoli. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 3621-6.
Berggren MI, Husbeck B, Samulitis B, Baker AF, Gallegos A, Powis G. (2001). Thioredoxin peroxidase-1 (peroxiredoxin-1) is increased in thioredoxin- 1transfected cells and results in enhanced protection against apoptosis caused by hydrogen peroxide but not by other agents including dexamethasone, etoposide, and doxorubicin. Arch Biochem Biophys 392:103-9
Besse, I. and Buchanan., B.B. (1997). "Thioredoxin-Linked Plant and Animal Processes: The New Generation", Botanical Bulletin- Academia Sinica Taipei, 38, 1-11.
Bindoli, A., Rigobello, M.P., Scutari, G., Gabbiani, C., Casini, A., Messori, L. (2009). Thioredoxin reductase: A target for gold compounds acting as potential anticancer drugs. Coordination Chemistry Reviews, 253, 1692- 1707.
Branco, V., Canário, J., Lu, J., Holmgren, A., ve Carvalho, C. (2012). Mercury and selenium interaction in vivo: effects on thioredoxin reductase and glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine, 52(4), 781-793.
60
Buxbaum, E. (2007. Fundamentals of Protein Structure and Function. Springer, pp. 59-63, West Indies.
Cadenas, C., Franckenstein, D., Schmidt, M., Gehrmann, M., Hermes, M., Geppert, B., Schormann, W., Maccoux, L.J., Schug, M., Schumann, A., Wilhelm, C., Freis, E., Ickstadt, K., Rahnenführer, J., Baumbach, J.I., Sickmann, A., Hengstler, J.G. (2010). Role of thioredoxin reductase 1 and thioredoxin interacting protein in prognosis of breast canser. Breast Cancer Research, 12, R44-R59.
Carvalho, C. M., Chew, E. H., Hashemy, S. I., Lu, J., ve Holmgren, A. (2008). Inhibition of the human thioredoxin system a molecular mechanism of mercury toxicity. Journal of Biological Chemistry, 283(18), 11913-11923. Cai, W., Zhang, L., Song, Y., Wang, B., Zhang, B., Cui, X., ... ve Fang, J. (2012). Small molecule inhibitors of mammalian thioredoxin reductase. Free Radical Biology and Medicine, 52(2), 257-265.
Chen, W.; Tuladhar, A.; Rolle, S.; Lai, Y.; Rodriguez del Rey, F.; Zavala, C. E.; Liu, Y.; Rein, K. S. Brevetoxin-2, is a unique inhibitor of the C-terminal redox center of mammalian thioredoxin reductase-1. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2017, 329, 58−66.
Crosley, L.K., Meplan, C., Nicol, F., Rundlöf, A.K., Arner, E.S.J., Hesketh, J.E. and Arthur, J.R., 2007. Diferential regulation of expression of cytosolic and mitochondrialthioredoxin reductase in rat liver and kidney. Archives of Biochemistry and Biophysics, 459, 178-188.
Çomaklı, V., Kuzu, M. and Demirdağ, R. (2015). Characterization and Purification of Glutathione S-Transferase from the Liver and Gill Tissues of Ağrı Balık Lake Trout Salmo trutta labrax and the Effects of Heavy Metal Ions on Its Activity. Journal of aquatic animal health, 27, 145-151.
DeForest, D. K., Brix, K. V., ve Adams, W. J. (2007). Assessing metal bioaccumulation in aquatic environments: the inverse relationship between
61
bioaccumulation factors, trophic transfer factors and exposure concentration. Aquatic toxicology, 84(2), 236-246.
Demirbilek, M. E. (2007). Serebral İskemi Oluşturulan Sıçanlarda Egf, Tnf-Α Düzeylerinin ve Tiyoredoksin Sisteminin İncelenmesi. Gazi Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyokimya Ana Bilim Dalı, Doktora Tezi.
Demirdağ, R. (2012). Karbonik Anhidraz II ve IV İzoenzimlerinin Koyun Böbrek Dokusundan Saflaştırılması Karakterizasyonu ve Bazı Kimyasalların Etkilerinin Araştırılması. Atatürk Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi.
Biterova E.I., Turanov A.A., Gladyshev V.N., Barycki J.J., Crystal structures of oxidized and reduced mitochondrial thioredoxin reductase provide molecular details of the reaction mechanism, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 15018–15023.
Ekren, G. S. (2013). Fitaz üreten fungusdan enzimin üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu (Master's thesis, Adnan Menderes Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü).
Elias S. J. Arne  r and Holmgren., A., "Physiological Functions of Thioredoxin and Thioredoxin Reductase", Eur. J. Biochem., 267, (2000) 6102-6109
Engman, L., McNaughton, M., Gajewska, M., Kumar, S., Birmingham, A., Powis, G. (2006). Thioredoxin reductase and cancer cell growth inhibition by organogold (III) compounds. Anti-canser Drugs, 17, 539-544.
Enzyme Technıcal Assocıatıon, 2001. Enzymes a Primer on Use and Benefits Today and Tomorrow. 1800 Massachusetts Avenue, N.W. Second Flor Washington, DC 20036. s.1-34.
Fang J, Jun L, Holmgren A. Thioredoxin reductase is irreversibl modified by curcumin. J Biol Chem 2005; 280: 25284-90.
Furlan, S.A., and Pant, H.K., 2006. Enzyme Technology: General Properties of Enzymes, (A. Pandey, C.Webb, C.R. Soccol and C. Larroche, editörler),
62
Springer Science and Business Media, Inc. And Asiatech Publishers Inc., New York, p 11-37.
Gasdaska, P.Y., Berggeren, M.M., Berry M.J., Powis G., 1999. Cloning, sequencingand functional expression of a novel human thioredoxin reductase. FEBS Lett, 442,105-111.
Gan, Z.R., "Yeast Thioredoxin Gene", The Journal of Biological Chemistry, 266, (1991) 1692-1696.
Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., ve Chattopadhyaya, M. C. (2014). Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation
Gerze, A. (2003). Proteaz Enziminin Bacıllus Subtılıs Megatherium Ve Bacıllus Polymxa Bakteri Türlerinden Kısmi Saflaştırılması ve Özelliklerinin İncelenmesi (Doctoral dissertation, Fen Bilimleri Enstitüsü).
Gromer S, Schirmer RH, Becker K. News and views on thioredoxin reductases. Redox Report 1999; 4: 221-8.
Gromer, S., Arscott, L. D., Williams, C. H., Schirmer, R. H., ve Becker, K. (1998). Human placenta thioredoxin reductase isolation of the selenoenzyme, steady state kinetics, and inhibition by therapeutic gold compounds. Journal of Biological Chemistry, 273(32), 20096-20101.
Gümgüm, B., Tez, Z., ve Gülsün, Z. (1994). Heavy metal pollution in water, sediment and fish from the Tigris River in Turkey. Chemosphere, 29(1), 111- 116.
Holmgren, A. ve Lu, J. (2010). Thioredoxin and thioredoxin reductase: Current research with special reference to human disease. Biochemical and Biophysical Research Communications, 396, 120-124.
Holmgren, A., "Thioredoxin", Annu. Rev. Biochem., 54, (1985) 237-271.
http://academic.pgcc.edu/~kroberts/Lecture/Chapter%205/enzymes.html, Erişim Tarihi: 08.09. 2017.
63
http://dent.ege.edu.tr/dosyalar/kaynak/301_patoloji/12.pdf, Erişim Tarihi: 10.09.2017
http://www.belgeci.com/enzimlerin-adlandirilmasi-ve-siniflandirilmasi.html, Erişim Tarihi: 08.09. 2017.
http://www.enzimler.gen.tr/enzim-inhibisyonu.html, Erişim Tarihi: 08.09. 2017. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Methotrexate_and_folic_acid_compared.p
ng, Erişim Tarihi: 08.09. 2017.
https://www.biyolojigunlugu.com, Erişim Tarihi: 08.08. 2017.
https://www.msxlabs.org/forum/biyoloji/21021-enzim-nedir-enzimler- hakkinda.html, Erişim Tarihi: 08.09. 2017.
Jacquoti, J.P., Lancelin, J.M., and Meyer, Y., "Thioredoxins: Structure and Function in Plant Cells", New Phytologist, 136, (1997) 543-570.
John H. Duffus ""Heavy metals" a meaningless term? (IUPAC Technical Report)" Pure and Applied Chemistry, 2002, Vol. 74, pp. 793-807
John, F.K., 1987. Enzyme Technology (H.J. Rehm ve G.Reed editör), Biotechnology, Vol.7A. New York s 37-62.
John, W., and Sons, I., 1998. Industrial Enzymes and Their Applications. United States of Amerika. 454p.
Jordan A, Reichard P. Ribonucleotide reductases. Annu Rev Biochem 67:71-98, 1998.
Kahvecioğlu Ö, Kartal G, Güven A, Timur S. Metallerin çevresel etkileri-i. Metalurji Dergisi. 2009; 136:47-53.
Kalısz, H. M., 1988. Microbial enzymes. Advances in Biochemical Engineering, Biotechnology, Springer, Berlin Heidelberg, New York, 36: 3-61.
Karademir, A., Akgül, M., Tutuş, A., (2002). Kâğıt Endüstrisinde Enzim Kullanımına Genel Bir Bakış: Enzimlerin Kabuk Soyma, Liflerin
64
Modifikasyonu, Çözünebilir Kâğıt Hamuru ve Selüloz Üretiminde Kullanımı (Bölüm 1). KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 5(1). s.3.
Karlenius, T.C. ve Tonissen, K.F. (2010). Thioredoxin and cancer: A role for thioredoxine in all states of tumor oxygenation. Cancers, 2, 209-232.
Keha, E. E., ve Küfrevioğlu, Ö. İ. (2011). Biyokimya. Aktif Yayınevi.
Kemerdere, R. (2008). Glial tümörlerde tiyoredoksin redüktaz değerleri. İstanbul Üniversitesi / Cerrahpaşa Tıp Fakültesi / Nöroşirürji Anabilim Dalı, Yüksek Lisans Tezi.
Kuzu, M. and Ciftci, M. (2015) Purification and characterization of NADPH- cytochrome P450 reductase from Lake Van fish liver microsomes and investigation of some chemical and metals' effects on the enzyme activity. Turkish Journal of Chemistry, 39, 149-158.
Koç, A., Karakaya, H.Ç., Ünlü, E.S. (2006). Evidence for the presence of a second electron donor for the cytoplasmic thioredoxins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Turkish Journal of Biology, 30, 133-138.
Kömürcü, H.F. (2007). Sıçanlarda İskemik Beyin Dokusunda EGF, TNF-α ve Tiyoredoksinin Zamana Bağlı Değişimi. Gazi Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi Biyokimya Anabilim Dalı.
Krauth R.L., Siegel, L.D. Arscott, A. Schonleben-Janas, R.H. Schirmer, C.H. Williams Jr., Role of active site tyrosine residues in catalysis by human glutathione reductase, Biochemistry 37 (1998) 13968–13977.
Larsson, A. (1973). Thioredoxin reductase from rat liver. European Journal of Biochemistry, 35, 346-349.
Laurent, T.C., Moore, T.C. ve Reichard, P. (1964). Enzymatic synthesis of deoxyribonucleotides. IV. Isolation and characterization of thioredoxin, the hydrogen donor from Escherichia Coli B. Journal of Biological Chemistry, 239, 3436-3444.
65
Liu, Z., Du, Z.-Y., Huang, Z.-S., Lee, K.-S., Gu, L.-Q. (2008). Inhibition of thioredoxin reductase by curcumin analogs. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 72, 2214-2218.
Lu, J., Papp, L.V., Fang, J., Rodriguez-Nieto, S., Zhivotovsky, B., Holmgren, A. (2006). Inhibition of mammalian thioredoxin reductase by some flavonoids: Implications for myricetin and quercetin anticancer activity. Cancer Research, 66, 4410-4418.
Luthman, M., ve Holmgren, A. (1982). Rat liver thioredoxin and thioredoxin reductase: purification and characterization. Biochemistry, 21(26), 6628- 6633.
Madsen, G.B., Norman, B.E., and Slott, S., 1973. A New Heat-Stable Bacterial Amylase and its Use İn High-Temperature Liquefaction .Starke 25, 304. Maggioli, G., Piasenza, L., Carambula, B., Carmona, C. (2004). Purification,
characterization and immunolocalization of a thiordoxin reductase from adult Fasciola hepatica. Journal of Parasitology, 90, 205-211.
Mansour, S. A., ve Sidky, M. M. (2002). Ecotoxicological studies. 3. Heavy metals contaminating water and fish from Fayoum Governorate, Egypt. Food Chemistry, 78(1), 15-22.
Miranda A.-Vizuete, Damdimopoulos A.E., Pedrajas J.R., Gustafsson J.A., Spyrou G., Human mitochondrial thioredoxin reductase cDNA cloning, expression and genomic organization, Eur. J. Biochem. 261 (1999) 405–412.
Moore, E. C., Reichard, P., ve Thelander, L. (1964). Enzymatic synthesis of deoxyribonucleotides V. Purification and properties of thioredoxin reductase from Escherichia coli B. Journal of Biological Chemistry, 239(10), 3445- 3452.
Mukherjee, A. ve Mart’in, S.G. (2008). The thioredoxin system: a key target in tumor and endothelial cells. Brazilian Journal Radiology, 81, S57-S68.
Mustacich, D. ve Powis, G. (2000). Thioredoxin reductase. Review article. Biochemical Journal, 346, 1-8.
66
Nakamura H, Nakamura K, Yodoi J. Redox regulation of cellular activation. Annu Rev Immunol 1997;15:351–369.
Nelson, D.L., Cox, M.M. 2004. Enzymes. Lehninger Principles of Biochemistry (Nelson, D.L., Cox, M.M). W. H. Freeman, p. 190-249,Madison.
Nishinaka Y, Nakamura H, Masutani H, Yodoi J. Redox control of cellular function by thioredoxin: A new therapeutic direction in host defence. Arch Immunol Ther Exp 49:285-92, 2001.
Nordberg J, Arnér ESJ. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol and Medicine 2001; 31: 1287-312. Özbolat, G., ve Tuli, A. (2016). Ağır Metal Toksisitesinin İnsan Sağlığına Etkileri.
Arşiv Kaynak Tarama Dergisi. Archives Medical Review Journal, 25(4):502- 521
Özgençli, İ., ve Çiftci, M. (2016). Purification and characterization of mitochondrial thioredoxin reductase enzyme from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) liver and investigation of the in vitro effects of some metal ions on the enzyme. Turkish Journal of Chemistry, 40(1), 174-183.
Pandey, A., and Ramachandran, S., 2006. Enzyme Technology: General Introduction, (A. Pandey, C. Webb, C.R. Soccol and C. Larroche, editörler), Springer Science and Business Media, Inc. And Asiatech Publishers Inc., New York, p 1-11.
Parrilha, G. L., Ferraz, K. S., Lessa, J. A., de Oliveira, K. N., Rodrigues, B. L., Ramos, J. P., ... ve Beraldo, H. (2014). Metal complexes with 2- acetylpyridine-N (4)-orthochlorophenylthiosemicarbazone: Cytotoxicity and effect on the enzymatic activity of thioredoxin reductase and glutathione reductase. European journal of medicinal chemistry, 84, 537-544.
Pigiet, V.P. ve Conley, R.R. (1977). Purification of thioredoxin, thioredoxine reductase and glutathione reductase by affinity chromatography. The Journal of Biological Chemistry, 252, 6367-6372.
67
Powis, G., Wipf, P., Lynch, S. M., Birmingham, A., ve Kirkpatrick, D. L. (2006).