TARTIŞMA VE SONUÇLAR

Foram analisadas, ainda, possíveis correlações entre as imunoexpressões de TCD8 e CD57, levando-se em consideração todos os casos de CE de lábio inferior incluídos na presente pesquisa. O teste de correlação de Spearman (r) demonstrou existir correlação positiva, estatisticamente significativa, entre células imunomarcadas para TCD8 e CD57 (r = 0,761; p < 0,001).

Figura 1.Fotomicrografia mostrando aspectos morfológicos do CE de lábio inferior de alto grau de

malignidade.(H/E,;Barra=100 µm)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Figura 2. Fotomicrografia mostrando aspectos morfológicos do CE de lábio inferior de baixo grau de

malignidade. (H/E,;Barra=100 µm)

Figura 3.Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão dos linfócitos TCD8 em CE de lábio inferior sem

metástase. (Barra=50µm)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Figura 4. Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão dos linfócitos TCD8 em CE de lábio inferior com

metástase. (Barra=50µm)

Figura 5. Fotomicrografia mostrando a imunoexpressão das céulas natural killer em CE de lábio inferior

sem metástase. (Barra=50µm).

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Figura 6. Fotomicrografia monstrando a Imunoexpressão das células natural killer em CE de lábio inferior

com metástase. (50µm)

6 DISCUSSÃO

Globalmente, o câncer oral é a oitava causa mais comum de morbidade entre as neoplasias malignas. De todos os cânceres da cavidade oral, mais de 90% são CEO que surgem na mucosa da boca e da orofaringe (JONHSON et al., 2011). O CEO é uma neoplasia epitelial invasiva, com graus variados de diferenciação escamosa e uma aptidão para o desenvolvimento de metástases linfonodais precoces (JOHNSON et al., 2005).

O CE de lábio inferior se desenvolve lentamente e apenas 3%-29% das lesões apresentam metástase em linfonodos cervicais (SALGARELLI et al., 2009). Quando a metástase linfonodal é detectada, há uma significativa queda no índice de sobrevida do paciente (HASSON, 2008). Desta forma, o CE de lábio inferior tem geralmente um bom prognóstico, possivelmente como resultado de um diagnóstico precoce, em decorrência da baixa taxa de metástase em linfonodos regionais (VARTANIAN et al., 2003). Essa lesão é, ainda, mais facilmente percebida pelo paciente, motivando uma intervenção mais precoce (OLIVEIRA; SILVA; ZUCOLOTO, 2006; MORSELLI et al., 2008). Adicionalmente, a taxa reduzida de mortalidade em pacientes com CE de lábio inferior pode ser explicada pela reduzida rede de vasos sanguíneos e linfáticos que se apresentam nessa localização anatômica, podendo influenciar numa evolução menos agressiva do tumor (OLIVEIRA; SILVA; ZUCOLOTO, 2006; BATISTA et al., 2010).

Para o CE de lábio inferior, o tamanho do tumor, gradação histopatológica de malignidade, metástase em linfonodo regional e recidiva da lesão são os principais fatores relacionados a sobrevida dos pacientes (SOUZA et al., 2011). Dentre estes fatores, a metástase linfonodal regional em estudos, realizados por Lim et al. (2004), revelaram que a presença dessa variável é considerada um dos principais indicadores para predizer o prognóstico de pacientes com carcinoma epidermóide oral.

A metástase à distância relacionada ao CE de lábio inferior é rara e pode ser esperada em casos de tumores avançados e com comprometimento de linfonodos regionais no momento do diagnóstico. A incidência é de 0,5%-2% e costuma ser mais frequente nos pulmões, nos ossos e no fígado. O estágio clínico IV é o grupo com maior risco de ocorrência da lesão (BETKA, 2001).

Quando foram avaliados os aspectos clínicos do câncer, foi importante utilizar o estadiamento clínico TNM por se tratar de um dos melhores indicadores clínicos para predizer o prognóstico do CEO. Esse sistema possibilita a avaliação das características fundamentais de um câncer: extensão local, disseminação regional e metástase á distância (COSTA et al., 2005;

COSTA et al., 2002). Na presente pesquisa, o estadiamento clínico TNM foi agrupado em duas categorias, onde se observou um predomínio dos estágios III e IV correspondendo a 56,25% dos casos em relação aos estágios I e II que representavam 43,75 %.

Luna –Ortiz et al (2004) mostraram resultados semelhantes aos achados do presente estudo, onde 50% da sua amostra se encontravam nos estágios III e IV. A prevalência dos estágios III e IV pode ser justificada pela amostra intencional composta por 16 casos de CE de lábio com metástase e 16 casos de CE de lábio sem metástase linfonodal regional, onde a maioria dos tumores em estágio avançado apresentavam metástase linfonodal regional. Logo, observa-se uma associação estatisticamente significativa entre essas variáveis analisadas (p=0,000).

Portanto, os achados estão em concordância com os estudos de McCombe et al.(2000) os quais observaram para os estágios clínicos mais avançados do tumor, há uma importante associação com o surgimento de metástases regionais. Abreu et al. (2004) constataram em suas pesquisas uma correlação entre o aumento do tamanho tumoral e a ocorrência de metástase e recidiva.

Os sistemas de gradação histopatológica de malignidade vem sendo vastamente utilizados nos estudos e resultados mais satisfatórios vem sendo obtidos (BETTENDORF et al., 2005; KADEMI et al., 2005; LARSEN et al., 2009). A associação do sistema de gradação com o estadiamento clínico TNM, fornece um melhor prognóstico do tumor e a escolha de um tratamento mais adequado (SAWAIR, 2003).

Bryne et al (1998) propuseram um sistema de gradação histológica de malignidade baseado no front de invasão tumoral, porque acreditava que as características moleculares e morfológicas dessa área ,em muitos carcinomas de células escamosas, podem refletir as características de comportamento biológico mais real do que as outras partes do tumor; já que diversos eventos moleculares de importância para a disseminação do tumor como ganhos e perdas de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas, aumento da proliferação celular e início da angiogênese, ocorrem na interface tumor-hospedeiro. Nesta pesquisa optou- se por usar a gradação histológica proposta por Bryne (1998),por estarmos de acordo com a autora a respeito da importância do front de invasão para predizer o prognóstico do tumor e,também, por se tratar de um metódo rápido e de facil realização, e com valor prognóstico demonstrado por diversos estudos (BRYNE ,1998; BÁNKFALVI; PIHHKO,2000).

No presente estudo a analise da gradação histopatológica de malignidade em relação a prensença ou ausência de metástase evidenciou que 75 % das lesões com metástases em linfonodos cervicais foram classificadas como tumores de alto grau de malignidade, enquanto

que 75% das lesões com ausência de metástase linfonodal , foram classificadas como tumores de baixo grau de malignidade.Esse resultado revelou uma relação estatísticamente significativa em relação a presença e ausência de metástase com a gradação histopatológica de malignidade (p=0,006 ). Abreu et al.(2004) encontraram resultados semelhantes com os expostos nesta pesquisa, onde a presença de recidiva e metástase foram mais frequentes nas lesões com alto grau de malignidade ,concluindo que a gradação histopatológica de maliginidade é um fator de prognóstico importante em CE de lábio inferior.

Estudos relataram haver associação entre a gradação histopatológica de malignidade e o estadiamento clínico TNM ( NETO; QUADROS, 1998). Nesta pesquisa ao associar a gradação histopatológica de malignidade proposta por Bryne (1998) com o estadiamento clínico TNM, pode-se observar que a maioria dos tumores de alto grau de malignidade foram classificados nos estágios III e IV, enquanto que a maioria dos tumores de baixo grau de malignidade foram classificados em estágios menos avançados (I e II), mostrando, assim, associação significativa entre esses achados (p=0,0032). Costa et al. (2005) associando as variáveis histopatológicas com os estágios I/II e III/IV, constataram haver correlação significativa dos referidos estágios com os parâmetros infiltrado linfoplasmocitário e o pleomorfismo nuclear. Estes resultados fornecem subsídios para concluir que existe um possível reflexo do estadiamento clínico TNM sobre o comportamento histopatológico do tumor, já que pacientes com estadiamento clínico TNM III/IV apresentaram um comportamento histopatológico mais agressivo (COSTA et al., 2005). Seguindo essa mesma linha, Cardesa et al.(2005) observaram em seus estudos uma forte correlação entre a gradação histopatológica de malignidade, proposta por Bryne et al.(1992), e as seguintes variáveis: presença e ausência de metástases linfonodal regional, estadiamento clínico TNM e o desfecho dos tumores.

Muitos pesquisadores têm buscado outros parâmetros como indicadores de agressividade e comportamento das neoplasias, tendo em vista que o uso de fatores clínicos associados a fatores histomorfológicos ainda são conflitantes no que diz respeito a predizer o prognóstico dessas lesões (SILVEIRA et al., 2004). A imunidade local em CEO pode contribuir para o desenvolvimento de novos marcadores moleculares, que auxiliarão a identificar o estado biológico e imunológico do paciente, predizer a progressão da doença e selecionar o tratamento apropriado individualizado. Portanto, a imunidade anti-tumoral tem sido sugerida para desempenhar um papel importante no desenvolvimento e proteção contra a malignidade. Porém, poucos estudos tem investigado o papel da resposta imune do hospedeiro no CEO. Estudos nessa vertente aumentariam o conhecimento sobre a interação entre resposta imunológica e desenvolvimento de CEO (SILVEIRA et al. 2010; SANTOS PEREIRA et al.,

2013). Seguindo essa linha de pesquisa, o trabalho ora realizado avaliou a imunoexpressão de células TCD8 e células NK presentes no infiltrado inflamatório do front de invasão em amostras de CE de lábio inferior com metástases e sem metástases, com o objetivo de compreender o papel que essas células inflamatórias assumem na patogênese do câncer.

O desenvolvimento do câncer envolve uma gama de interações das células localizadas no front de invasão com as células inflamatórias impedindo o crescimento e desenvolvimento tumoral, porém o próprio tumor pode se beneficiar de alterações genéticas e assim modificar o seu microambiente imunológico, e consequentemente evadindo da resposta imune (WHITESIDE,2010). Portanto, sabe-se que as células do sistema inflamatório podem contribuir tanto para a inibição como para a progressão do crescimento tumoral (ZANCOPE et al., 2011). Neste contexto, as células T CD8, que representam uma subpopulação importante de linfócitos T citotóxicos e as células NK, são as mais prováveis células efetoras para uma resposta antitumoral eficiente (MANTOVANI et al., 2010; ZANCOPE et al., 2011; FELLER; ALTINI; LEMMER, 2013;).

No presente estudo, as células TCD8 foram evidenciadas imunoistoquímicamente em todos os casos pesquisados, apresentando nítida variação na quantidade das mesmas quando da análise microscópica. Foi encontrado um maior número de células TCD8 no grupo com ausência de metástases (mediana= 140,7) quando comparado ao grupo com metástase (mediana=115,30), apesar de não existir uma relação estatisticamente significativa entre essas váriaveis(p=0,146). Silveira et al.(2010) analisando CEO e CE de lábio inferior também não evidenciaram uma diferença estatística entre esses pârametros. Já Suwa et al.(2006), diferentemente dos autores citados acima, constataram que a atividade proliferativa do linfócitos TCD8 tende a se correlacionar com a metástase linfonodal regional.Seguindo essa mesma linha, Sheu et al.(1999), investigaram o significado clínico do infiltrado linfocítico dentro do ambiente tumoral de carcinoma cervical humano, e concluíram que alterações na relação de linfócitos TCD4/TCD8 são inversamente proporcionais com o crescimento rápido do tumor e com surgimento de metástase linfonodal em câncer cervical. Mlecnik et al.(2011) em seus resultados observaram que o crescimento do tumor primário e a propagação metastática foram associados com a diminuição da densidade de células T intratumoral.

Acredita-se que um dos motivos para a ausência de diferença estatística encontrada nessa pesquisa ocorra devido ao desenvolvimento de metástases envolver falhas no controle local e a distância. Logo acredita-se que apenas o infiltrado inflamatório não seria capaz de influenciar de forma determinante na disseminação metástatica (SANTOS et al., 2013).

A presença de um infiltrado inflamatório composto por linfócitos têm sido estudada em diversos tipos de câncer e vem sendo considerado como um fator de prognóstico importante (SILVEIRA et al., 2010). Schumacher et al. (2001) em seus estudos concluíram que a presença de linfócitos TCD8 foi um fator de prognóstico favorável. Contrariando esses achados, Grabenbauer et al.(2006) estudando células CD3+, Granzimas B+ e CD8+ em CE de canal anal, afirmaram que a presença de células do infiltrado inflamatório são fatores prognósticos negativos para evolução tumoral. Na presente pesquisa, ao associar células TCD8 com estadiamanto clíncio TNM, não houve uma diferença estatísticamente significativa (p=0,146), e resultados semelhantes foram constatados por Suawa et al.(2006). Algumas subpopulações de células T estão associadas com um resultado clínico mais favorável em câncer de colo retal, tais como as células TCD8 citotóxicas,células T helper Th17 e as células T reguladoras(FoxP3+) (MLECNIK et al.2011; SINICROPE et al.2009; TOSOLONI et al. 2011). Sendo assim, é possivel sugerir que a associação não siginificativa das células TCD8 e o estadiamento clínico TNM, se deve a presença da ação anti-tumoral de outras células no estroma ,além dos linfócitos TCD8.

No que diz respeito à correlação entre imunoexpressão de TCD8 e grau histológico de malignidade, Pereira et al.(2013) evidenciaram que lesões de baixo grau apresentavam uma média maior de células positivas do que lesões de alto grau, resultando significância estatística ao achado. Na presente pesquisa não foi encontrada diferença estatística entre essas variáveis (p=0,936), assim como nos achados de Zancope et al.(2010).

Uma imunovigilância eficaz se faz necessária para prevenção do início e da progressão do câncer (JEWETT;TSENG, 2011). Sendo assim,o sistema imunológico conta com a participação das células NK na tentativa de controlar o crescimento tumoral. A célula NK é um subtipo de linfócito que se caracteriza por um vasto espectro de funções efetoras contra microrganismos intracelulares, transformação celular precoce e crescimento tumoral, devido à sua habilidade para citotoxidade celular e produção de citocinas e quimiocinas (BERNARDINI et al., 2012; HAZELDINE et al., 2012).

O papel das células NK no combate a disseminação de células neoplásicas tem sido demonstrado por muitos autores, que correlacionam inversamente a densidade e a atividade citolítica das células NK, com a presença de metástase linfonodal regional e à distância em CE (SCHANTZ et al., 1991; GONZALEZ et al.,1998). Zancope et al.(2010) em seus estudos mostraram que a quantidade de células NK foi significativamente maior em CE de lábio quando comparado a CEO metastático. Essa associação não foi evidenciada na presente pesquisa, visto que a associação da imunoexpressão da células NK com a presença de metástases, não resultou

em diferenças estatisticamente significativas (p=0,622). As células NK desempenham um papel importante em fases iniciais do desenvolvimento do tumor (WHITESIDE et al., 1998; SMYTH et al., 2002). Estudos mostram que, embora a imunidade inata representa a primeira linha de defesa contra o patógeno (ABBAS et al., 2012), a maioria das células tumorais em humanos são resistentes à lise celular de células NK mediada por perforina. Portanto, as células NK são raramente encontradas no infiltrado linfocítico tumoral em casos de câncer em estágio avançado (WHITESIDE et al., 1998). Sendo assim, lesões com metástase por se encontrarem em um estágio mais avançado do tumor, possuem uma quantidade menor de células NK.

Gonzalez et al. (1998), insatisfeitos com o uso do estadiamento clínico TNM como guia de decisões terapêuticas ou para fornecer um prognóstico para sobrevida, sugeriram em suas pesquisas para atingir um sistema mais confiável, a incorporação de variáveis adicionais. Portanto, as células natural killer ativadas poderiam, provavelmente, ter uma função nessa nova abordagem. Eles constataram em seus resultados que o grau de comprometimento da atividade das células NK parece relacionar-se com o estado da doença, sendo mais acentuada em pacientes com câncer avançado. Sznurkowski et al.(2013), estudando o valor prognóstico de células NK em CE de vulva, averiguaram que pacientes em estágios avançados da doença tinham uma quantidade maior de células NK quando comparado aos pacientes em estágio mais inicial, com valores estatísticos significativos. Turkseven e Oygur (2010), em contraste com os autores citados anteriormente, mostraram que a densidade de células CD57 + (células NK), foi estatisticamente menor nos tumores classificados no grupo de pobre prognóstico em comparação com os casos no grupo bom prognóstico. Igualmente em resultados desta pesquisa, observou-se um maior número de células NK nos estágios I e II, já para o estágios III e IV a quantidade dessas células foi menor, porém não foi encontrada uma diferença estatística significativa entre a presença de células NK e o estadiamento clínico TNM das lesões (p=0,576).

Estudos sugerem que o aumento da secreção de fator de necrose tumoral (FNT-alfa) nos tumores, pode ser um dos fatores facilitadores para um padrão de invasão tumoral mais agressivo e também responsável pela supressão de células NK. O FNT serve como um regulador do sistema imunológico, com efeitos biológicos diversos. Ele liga-se a receptores específicos (TNFR) nas células alvo, em seguida, pode levar a célula à apoptose ou pode promover sua sobrevivência (ROBBINS; COTRAN, 2005). FNT-alfa secretado por células inflamatórias mononucleares poderia estimular a destruição da matriz extracelular para além do seu efeito citotóxico facilitando o padrão de invasão de alto grau (TURKSEVEN; OYGUR, 2010). Então é esperado que em lesões de alto grau de malignidade, existe muita produção de

FNT–alfa que vai promover a destruição de células NK. No presente trabalho, houve uma menor quantidade de células NK para as lesões classificadas em alto grau de malignidade quando comparadas a lesões de baixo grau. Entretanto não houve uma significado estatístico para o achado (p=0,936). Botter et al. (2013) compartilha dos achados referentes a correlação dessas variáveis identificados no presente estudo.

No atual trabalho, as variáveis recidiva e óbito, não tiveram associação com nenhum dos parâmetros imunoístoquimicos analisados (imunoexpressão de TCD8 e células NK). Este fato pode se associar às peculiaridades intrínsecas da localização do lábio inferior, sendo assim um local de fácil diagnóstico e melhor visibilidade para adequada ressecção ciurugica, quando comparada a outros sítios da cavidade oral. Portanto ,essas peculiaridades possibilitam que esse tumores sejam diagnosticados em estágios bem precoces, como também a realização da cirúrgia a tempo hábil, possibilitando maiores sucessos no que diz respeito a recidiva e ao desfecho da lesão (MASSANO et al., 2006).

Pages et al.(2005),observaram que a presença de células do sistema imunológico estão relacionadas com melhor evolução do paciente e maior tempo de sobrevida. Um aumento da densidade de células T no infiltrado com uma alta proporção de células T CD8 foi associado com uma proteção significativa contra a recidiva tumoral em pacientes com adenocarcinoma primário colorretal (PAGES et al., 2005). Mlecnik et al.(2011) corroborando com os achados citados anteriormente, relataram que nas lesões com recidiva ocorria uma reação imunologica mais baixa. Schantz et al. (1999) encontraram uma relação estatística significativa de células NK inversamente com o óbito. Porém, eles não identificaram nenhuma relação entre a função das células NK e recorrência local.

Bottchet et al.(2013) , de forma semelhante ao presente estudo verificaram que não houve correlações significativas da proporção de células T / NK para os casos livres de recidiva. Entendemos que existe uma relação dinâmica e complexa entre o sistema imune e a biologia do câncer. A presença de um infiltrado inflamatório rico em linfócitos TCD8 e células NK, pode refletir um microambiente tumoral com uma resposta imune citotóxica local contra células malignas.

7 CONCLUSÕES

Conforme os resultados obtidos na presente pesquisa, pode-se concluir que:

1- _{No carcinoma de lábio inferior existe uma possibilidade que se estabelece entre o} TNM e a ocorrência metastática, sob à influência de sua disseminação, enquanto que, as isentas de metástases, mesmo com as infiltrações que ocorrem, costumam ser menos letais, pelas suas limitações na área do envolvimento, de onde se supõe existir uma relação que se estabelece na repercussão dos seu efeitos com indiscutíveis reflexos no prognóstico da doença.

2- A ausência de relação estatisticamente significativa do TCD8 e das células NK, com

as variáveis estudadas, quais sejam metástases, estadiamento clinico TNM, gradação histológica de malignidade, recidiva e óbito, sugerem que as células TCD8 e as células NK não exercem efetiva influências na indicação de prognóstico no CE de lábio inferior.

3- _{A imunomarcação positiva para células TCD8 e células NK, no infiltrado} inflamatório tumoral, reflete, na dependência de sua densidade, um microambiente favorável a resposta imunocitotoxica a qual se mostra contrária ao crescimento das células do parênquima do CE de lábio inferior.