Bu tez çalışmasında, Türkiye genelinde toplam 16 ile ait (Kırklareli, İstanbul-Çatalca, Tekirdağ-Malkara, Amasya-Merzifon, Tokat, Kastamonu, Kütahya, Konya, Isparta, Antalya, Aydın, Muğla, Kars, Mardin, Şanlıurfa ve Kahramanmaraş) toplam 314 bireyden oluşan (Equus asinus) eşek populasyonları ile çalışılmıştır. 314 bireyden toplanan kan örnekleri ile DNA izolasyonu yapılmış ve izole edilen DNA’lar ile PCR analizleri gerçekleştirilmiştir. Çalışmada PCR analizleri için 20 mikrosatellit primeri kullanılmış (HMS07, ASB17, ASB23, HTG07, COR058, HMS02, AHT05, HMS03, COR007, LEX73, HTG06, VHL209, ASB02, HMS20, COR022, HTG10, COR018, COR071, COR082 ve LEX54), her bir mikrosatellit primerine ait allellerin belirlenmesi için her bir primer bir lokus ve bu primerlerin çoğalttığı DNA parçaları ise birer allel olarak değerlendirilmiş ve analiz edilmiştir. PCR ürünleri ile DNA parça (fragment) analizleri yapılmış ve DNA büyüklükleri (bç) elde edilen alleller ile çeşitli genetik istatistik analizler yapılmıştır.
Yapılan literatür çalışmaları sonucunda ülkemizin eşek ırklarının genetik yapısı hakkında yeterli bilgiye ulaşılamamıştır. Bu nedenle tez çalışması kapsamında ülkemizin biyolojik zenginliği içerisinde önemli bir yer tutan, çeşitli şehirlerinden oluşturulan eşek populasyonlarının mikrosatellit lokusları ele alınarak gen ve genotip frekansları hesaplanmış ve yerli gen kaynaklarını koruma çalışmalarına katkı sağlayacak veriler elde edilmiştir.
Genetik analizlerde kullanılan belirteçlerin kullanışlılık derecesi elde edilen alleller ve bu allellerin frekansları ile değerlendirilebilmektedir. Teorik olarak bir belirtecin polimorfik olabilmesi için en az iki farklı allel oluşturması gerekmektedir ve polimorfizm değeri ise iki farklı ölçüt ile belirlenebilmektedir. Bu ölçütlerden biri heterozigotluk (Nei ve Roychoudhury 1974) bir diğeri ise Botstein (1980)’e göre polimorfik bilgi içeriğidir (PIC). Bu çerçevede tez çalışması kapsamında elde edilen allel frekansları ile beklenen heterozigotluk (He), gözlenen
heterozigotluk (Ho) değerleri tespit edilmiş ve her bir lokus için PIC değerleri hesaplanmıştır.
Ayrıca bir populasyondaki tür çeşitliliğini karakterize etmek için yaygın olarak kullanılan Shannon sabiti (Shannon Diversity Index) (Shannon 1948, Magurran 1988) ve Nei (1972)’ye göre genetik uzaklık değerleri de hesaplanmıştır. Elde edilen bu veriler çerçevesinde çalışılan 16 populasyonun genetik yapısı hakkında önemli bilgilere ulaşılmıştır.
Çalışmada 16 farklı populasyonda çalışılan toplam 20 mikrosatellit primerinden bir tanesi haricinde (ASB17) hepsinin çalışılan populasyonlar genelinde polimorfik olduğu tespit
edilmiştir. Çalışılan 20 mikrosatellit lokusunda toplam 174 allel tespit edilmiş ve en çok allellin LEX54 primerine ait olduğu belirlenmiştir. Lokus başına düşen allel sayısının 8,7 (allel/lokus) olduğu hesaplanmıştır. Gözlenen allel sayısı Na ortalama 5,153 ± 0,145 olarak
hesaplanmıştır. Toplam 174 allellin 7’si HMS07, 1’i ASB17, 9’u ASB23, 11’i HMS02, 11’i COR058, 8’si HMS03, 9’u VHL209, 4’ü ASB02, 7’si HMS20, 8’i COR007, 6’sı LEX73, 12’si HTG07, 2’si COR022, 10’u HTG10, 14’ü COR018, 10’u COR071, 8’i COR082, 4’ü HTG06, 17’si LEX54 ve 16’sı AHT05 primerinde tespit edilmiştir. Çalışmada lokus bazında hesaplanan F istatistikleri; FIS değeri 0,024 ± 0,045, FIT değeri 0,071 ± 0,046, FST değeri ise
0,051 ± 0,009 olarak hesaplanmıştır.
20 mikrosatellit lokusu ile elde edilen allel sonuçları benzer bazı çalışmalarla karşılaştırılmıştır. Zhang ve ark. (2016) yapmış oldukları çalışma kapsamında 10 mikrosatellit lokusu kullanmış ve 10 farklı eşek ırkına ait (Guanzhong, Dezhou, Qingyang, Biyang, Jiami, Mongolia, Gunsha, Xinjiang, Taihang ve Xiji) 415 birey analiz yapılmıştır. Bu çalışmada kullanılan mikrosatellit lokuslarından 5 lokusun ortak olduğu tespit edilmiştir (HTG06, HTG10, HMS03, HMS07 ve HTG07). Aynı çalışmada 10 lokusun 7’sinin polimorfik olduğu ifade edilmiştir. Polimorfik lokusların çalışmamızla ortak olduğu saptanmıştır. Zhang ve ark. (2016)’nın çalışmasında toplam 80 allellin tespit edildiği en çok allellin ise AHT05 lokusunda (15) belirlendiği en az allellin ise HMS07 lokusunda (6) tespit edildiği ifade edilmiştir. Yaptığımız çalışmada da analiz ettiğimiz HMS07 lokusu için 7 allel tespit edilmiştir. Lokus başına düşen ortalama allel sayısının 8 (allel/lokus) olduğu ve çalışmamızla karşılaştırıldığında bu değerlerin birbirine yakın olduğu tespit edilmiştir. Bu durumun ortak kullanılan lokuslardan kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Ayrıca populasyonun polimorfizmi hakkında önemli bir ölçüt olan PIC değeri en yüksek Mongolia eşek ırkında (0,7967) en düşük ise Qingyang eşek ırkında (0,7218) tespit edilmiştir. Çalışmamızda ise en yüksek PIC değerinin İstanbul-Çatalca (0,563) ilinden oluşturulan populasyonda, en düşük PIC değerinin ise Aydın ilinden oluşturulan populasyonda (0,479) hesaplandığı tespit edilmiştir. Ayrıca ortak çalışılan lokusların (PIC > 0,5) yüksek düzeyde bilgi verici olduğu ve çalışmamızla karşılaştırıldığında sadece HMS07 lokusunun iyi düzeyde bilgi verici olduğu (PIC 0,25-0,5) belirlenmiştir. Bu sonuçlar neticesinde ülkemizde çalıştığımız mikrosatellit lokusları çerçevesinde aslında azımsanamayacak düzeyde genetik çeşitliliğin mevcut olduğu düşünülmektedir. Populasyon içi genetik çeşitliliğin belirlenmesinde önemli bir ölçüt olan heterozigotluk değeri ise Zhang ve ark. (2016)’da 0,8238 olarak hesaplanmış ve kendi çalışmamızla karşılaştırdığımızda (0,573) bu değerin yüksek bir değer olduğu tespit
edilmiştir. Bu durumun çalışmada kullanılan ırk sayısının fazlalığından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Ayrıca bu tez çalışması ile ortak lokusların da çalışıldığı için, SSR lokuslarının için farklı eşek ırkları arasındaki genetik çeşitliliği ve filogenetik ilişkileri analiz etmek adına bilgi verici lokuslar olduğu düşünülmektedir.
İtalya’da üç farklı eşek ırkı ile yapılmış bir başka çalışmada ise toplam 14 mikrosatellit lokusu ile çalışılmış ve çalışılan lokusların sekizinin çalışmamızla ortak ve polimorfik olduğu tespit edilmiştir (Bordonaro ve ark. 2011). Aynı çalışmada lokus başına düşen allel sayısının 6,07 olarak hesaplandığı bildirilmiştir. Lokus başına düşen ortalama allel sayılarının karşılaştırıldığında çalışmamızdan düşük bir değer olduğu tespit edilmiş olup bu durumun çalışılan birey sayısının azlığı ya da ırkların farklılığından kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Bordonaro ve ark. (2011)’de Ortalama gözlenen heterozigotluk değerinin ise 0,455 ± 0,054 olduğu yürütülen tez çalışmasında ise 0,573 ± 0,016 olarak hesaplandığı tespit edilmiştir. Ayrıca ortak çalışılan lokusların gözlenen heterozigotluk değerlerinin; AHT05 0,581, ASB23 0,704, HMS2 0,271, HMS3 0,463, HMS7 0,222, HTG10 0,736, HTG6 0,556 ve HTG7 0,648 olarak hesaplandığı bildirilmiş olup çalışmamızla karşılaştırıldığında heterozigotluk değerlerimizin yüksek olduğu tespit edilmiştir (AHT05 0,868, ASB23 0,737, HMS2 0,723, HMS3 0,594, HMS7 0,449, HTG10 0,782, HTG6 0,728 ve HTG7 0,809). Ortak çalışılan lokusların PIC değerleri karşılaştırıldığında ise çalışmamızda da analiz ettiğimiz HMS07 lokusunun 0,388 olarak hesaplandığı, karşılaştırılan çalışmada ise 0,291 olarak hesaplandığı belirlenmiş olup iyi derecede polimorfik bilgi içeren lokuslar olduğu belirlenmiştir. HMS07 lokusu haricindeki ortak lokusların PIC değerlerinin iki çalışmada da yüksek derecede polimorfik bilgi içeriğine sahip olduğu (PIC >0,5) tespit edilmiştir. Çalışılan lokus bazında hesaplanan FST değerinin toplam 0,108, FIS değerinin toplam 0,161, FIT
değerinin toplam 0,251 olarak hesaplandığı bildirilmiştir. FIS değerinin ASB23 ve HMS5
lokusları için negatif olduğu tespit edilmiştir. Çalışmamızda ise lokus bazında FIS değeri
0,258, FIT değeri 0,199, FST değeri ise 0,074 olarak hesaplanmıştır. FIS değerleri sunulan tez
çalışmasıyla karşılaştırıldığında düşük olduğu ve akrabalı yetiştirmenin fazla olabileceği düşünülmektedir. Çalışmamızda lokus bazında hesaplanan FST değeri; en yüksek (0,244)
HMS3, en düşük (-0,009) HTG4 lokuslarında hesaplanmış ve sunulan çalışmayla karşılaştırıldığında; en düşük değerin ASB02 (0,026) ve en yüksek değerin COR082 (0,211) lokuslarında hesaplandığı saptanmıştır.
İtalya’da sekiz farklı eşek ırkından ve 258 bireyden oluşan bir populasyonda yapılan bir diğer çalışmada 16 mikrosatellit lokusunda toplam 126 allel tespit edilmiştir (Colli ve ark. 2012). Lokus başına düşen allel sayısı 7,87, beklenen ve gözlenen heterozigotluk değerleri ise sırasıyla 0,558 ve 0,438 olarak hesaplanmıştır. Çalışmamızla kıyasladığımızda bu değerlerin daha düşük olduğu tespit edilmiştir. Populasyonların ikili karşılaştırılması sonucu elde edilen FST değerinin; en düşük 0,015 (Romagnolo ve Grigio Siciliano), en yüksek 0,241 (Martina
Franca ve Pantesco) olarak hesaplandığı bildirilmiştir. Bu tez çalışmasında ise; FST değeri en
düşük (0,008) Kırklareli ve İstanbul-Çatalca illeri arasında, en yüksek (0,051) Tokat ve Kütahya illeri arasında saptanmıştır.
Çalışmamızla ortak yedi lokusun tespit edildiği Di ve ark. (2017)’nın çalışmasında toplam 15 lokus ile çalışılmış ve hepsinin polimorfik olduğu belirtilmiştir. Bu lokuslarda toplamda 132 allellin tespit edildiği ifade edilmiştir. Ortak lokuslardan elde edilen allel sayıları incelendiğinde birbirine çok yakın olduğu belirlenmiştir. Lokus başına düşen allel sayısının ise 8,8 olduğu ve çalışmamızla yakın bir değer gösterdiği dikkati çekmiştir. Ayrıca çalışmamız diğer çalışmalarla karşılaştırıldığında ortalama lokus başına düşen allel sayısının birbirine yakın değerlerde olduğu tespit edilmiştir (Aranguren-Mendez ve ark. 2001, Colli ve ark. 2012, Rosenbom ve ark.2014, Jordana ve ark. 2015, Zhang ve ark. 2016, Sharma ve ark. 2017). Çalışmamızda elde edilen lokus başına düşen allel sayısının literatür çalışmalarının genelinin ortalamasının üzerinde bir değerde olduğu ve seçilen lokusların yüksek sayıda allel içerdiği dikkati çekmiştir. Di ve ark. (2017)’de hesaplanan heterozigotluk değerleri; ortalama gözlenen heterozigotluk değeri 0,56, ortalama beklenen heterozigotluk değeri ise 0,70 olarak bildirilmiştir. Lokus bazında FIS değerleri; HMS03: -0,004, HTG06: -0,134 olarak
hesaplanmıştır. FIS değerleri çalışmamızla karşılaştırıldığında; toplam 17 lokusda negatif
tespit edilmiş olup, HMS03 -0,011, HTG06 -0,069 olarak hesaplanmıştır. Çin’in 5 yerli eşek ırkı ile yürütülen bu çalışmada FST değeri 0,074 olarak hesaplanmış, genetik varyasyonun
%92,6’sının populasyonlar içi, %7,4’ünün populasyonlar arası kaynaklandığı tespit edilmiştir. Çalışmamızda ise toplam FST değeri 0,051 ± 0,009 olarak belirlenmiş, genetik varyasyonun
%97’sinin populasyon içi, %3’ünün ise populasyonlar arası olduğu saptanmıştır (Çizelge 4.6). Sonuçların çalışmamızla benzer olduğu dikkati çekmiştir.
Populasyona özgü alleller genetik farklılığı değerlendirmede önemli bir parametredir. Çalışmamızda 33 populasyona özgü allel (%18,96) belirlenmiş olup Rosenbom ve ark. (2014) Arap Yarımadası, Afrika ve Yakın Doğu civarından oluşturduğu örneklem ile yapmış olduğu
çalışmada ise 51 populasyona özgü allel (%20) belirlenmiştir. Balkan eşeklerinden yapılan bir başka çalışmada ise 28 populasyona özgü allel (%27,45) tespit edilmiştir (Stanisic ve ark. 2017).
Amerika eşek ırklarından oluşan 350 bireyi içeren bir populasyonda yapılan çalışmada, 14 mikrosatellit lokusu ile çalışılmış ve seçilen bazı lokusların ortak olduğu tespit edilmiştir (AHT04, AHT05, ASB23, HMS02, HMS03, HMS05, HMS06, HMS07, HTG04, HTG06, HTG07, HTG10, HTG15 ve VHL20) (Jordana ve ark. 2015). Sunulan tez çalışmasıyla ortak 8 lokusun bulunduğu ve tüm lokuslardan toplam 98 allellin tespit edildiği belirlenmiştir. Gözlenen heterozigotluk değerinin 0,512 ± 0,225 olarak hesaplandığı bu değerin de sunulan tez çalışmasıyla yakın olduğu tespit edilmiştir.
Ciampolini ve ark. (2007), toplam 18 mikrosatellit lokusu ile yürüttükleri çalışma kapsamında (AHT4, ASB02, ASB23, COR58, COR71, HMS1, HMS2, HMS3, HMS45, HMS6, HMS7, HTG10, HTG4, HTG6, HTG7, SGCV28, VHL20 ve VHL209) analiz ettikleri mikrosatellit lokuslarının dokuzunun çalışmamızla ortak olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen allel sayıları ve lokus başına düşen allel sayılarının (5,61 ± 2,893) çalışmamızdan az olduğu dikkati çekmiştir. Bu durumun çalışmada kullanılan birey sayısının az olması ile ilgili olabileceği düşünülmektedir. Nitekim çalışmada verilen, populasyonlar için genetik çeşitliliğin belirlenmesinde yardımcı bir diğer ölçüt olan ortalama heterozigotluk değerinin ise (0,579) çalışmamızla kıyaslandığında benzer olduğu tespit edilmiştir. Bu durumun ırkların farklı olması ya da seçilen lokuslar arasından farklı olan lokuslar olması nedeniyle olabileceği düşünülmüştür. Ayrıca çalışılan lokusların heterozigotluk değerleri incelendiğinde ortak kullanılan lokusların değerlerinin; ASB02 (0,640), ASB23 (0,755), COR58 (0,620), COR71 (0,700), HMS2 (0,640), HMS3 (0,700), HMS7 (0,400), HTG10 (0,580), HTG6 (0,680), HTG7 (0,840) ve VHL209 (0,326) olarak hesaplandığı bildirilmiştir. Bu değerler çalışmamızla kıyaslandığında çoğunlukla lokusların yakın heterozigotluk değerleri gösterdiği tespit edilmiştir. FST değeri ise 0,043 olarak hesaplanmış olup çalışmamız ve diğer çalışmalar
ile (Di ve ark. 2017) karşılaştırıldığında birbirine yakın değerlerin saptandığı dikkati çekmiştir. Bu durumun Dünya genelinde eşek populasyonları arasında genetik varyasyonun azalmasıyla ilişkili olabileceği düşünülmektedir.
İspanya’da nesli tükenmekte olan 5 eşek ırkında (Andaluza, Catalana, Mallorquina, Encartaciones ve Zamorano-Leonesa) (513 bireyde) toplam 15 mikrosatellit lokusu (AHT4, AHT5, ASB2, HMS1, HMS2, HMS3, HMS5, HMS6, HMS7, HTG4, HTG6, HTG7, HTG10,
HTG15 ve VHL20) ile çalışılmıştır. Çalışmada, iki lokus hariç (ASB2 ve HMS1) 13 lokusdan çeşitli verilerin elde edildiği bildirilmiştir (Aranguren-Mendez ve ark. 2001). Çalışılan lokuslardan sekizinin çalışmamızla ortak olduğu, tüm lokuslardan toplam 115 allellin tespit edildiği ve lokus başına düşen allel sayısının (7,66) çalışmamızla karşılaştırıldığında oranımızın büyük ve allel sayımızın fazla olduğu belirlenmiştir. Ortak lokusların PIC değerleri karşılaştırıldığında sunulan tezde daha yüksek değerlerin elde edildiği tespit edilmiştir (AHT05 0,74, HMS02 0,65, HMS03 0,51, HMS07 0,53, HTG06 0,73, HTG7 0,80 ve HTG10 0,78). Çalışılan ırkların gözlenen heterozigotluk değeri ise 0,546 ± 0,060 olarak hesaplanmış ve bu tez çalışmasıyla benzer bulunmuştur.
Bu tez çalışmasında populasyonlar arasındaki genetik farklılıkların Neighbor-Joining yöntemi ile incelenmesi sonucunda çalışılan populasyonların temelde 2 gruba ayrıldığı; Kütahya, Isparta, Amasya-Merzifon, Tekirdağ-Malkara, Kastamonu, Tokat, Konya, Antalya, Aydın ve Muğla populasyonlarının bir grupta kümelenmiş olduğu, diğer grupta ise; Kahramanmaraş, Mardin, Şanlıurfa, Kars, Kırklareli ve İstanbul-Çatalca populasyonlarının yer aldığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre, Türkiye yerli eşek ırklarının temelde iki farklı genetik kökeni olduğu ve ırklar bazında değerlendirildiğinde Doğu ve Orta Anadolu ırkları olarak iki gruba ayrılabileceği düşünülmektedir. FAO, Evcil Hayvan Çeşitliği Bilgi Sistemi (DAD-IS)’ne göre Türkiye’de Anadolu, Karakaçan, Merzifon eşek ırklarının var olduğu bildirilmekle birlikte bu veritabanında bu ırklara ait hiçbir veri bulunmamaktadır. Bu çalışmadaki sonuçlara dayanarak bu veritabanındaki bilgilerin revize edilmesi uygun olacaktır. Irklar bazında değerlendirme yapıldığında Türkiye’deki eşek populasyonlarının iki farklı kökenden geldiği ve Türkiye genelinde temelde iki ayrı eşek ırkının var olduğu düşünülmektedir. Bu durumun olası sebepleri olarak her geçen gün sayısı azalmakta olan eşeklerde kontrolsüz çiftleştirme, hayvan satışları ve göç sebebiyle farklı populasyonlardaki olası ırkların ırk özelliklerinin kaybedilmesi gösterilebilir.
Çalışma sonuçlarından elde edilen veriler ile literatür çalışmaları değerlendirildiğinde Dünya genelinde de eşek sayılarında bir azalış olduğu, hatta bazı ırkların yok olma tehlikesi altında bulunduğu gözlenmiştir. 1960'ların başlarında Türkiye eşek nüfusunun neredeyse iki milyon baş olmasına rağmen son 50 yılda önemli ölçüde azalma gözlendiği (Yılmaz ve Wilson 2013) bu nedenle koruma bilincinin oluşması ve bu alanda yapılacak çalışmaların artması gerektiği tespit edilmiştir. Dünya Hayvan Sağlığı Örgütünün (OIE) 2002 yılı raporunda belirtildiği gibi; Türkiye'de hayvan sağlığı ve refahını kapsayan yasal çerçevenin
“büyük ve geniş” olmasına rağmen pratikte eksik olması, çok sayıda yasa ve yönetmeliğin bulunmasına rağmen uygulamalarda ki eksiklerin sonucu birçok türün populasyon düzeyinde çarpıcı miktarda azaldığı gözlemlenmektedir (Oskam ve ark. 2004). Bu negatif etkiyi ortadan kaldırabilmek için yasal çerçevenin uygulanmasında bürokratların ve politikacıların etkinliğinin yanı sıra, yetiştiricilerin zihninde radikal bir değişimin olması gerektiği düşüncesi de benimsenmelidir. Tüm bunların en başında türlerin kökeninin aydınlatılmasına, nesli tükenmekte olan türlerde koruma stratejilerinin oluşturulmasına ilişkin çalışmaların yapılması gerekmektedir. Bu tip araştırmalar sayesinde genetik çeşitlilik tespit edilirken var olan çeşitliliğin de korunabilmesi adına bir yol izlenmiş olacaktır. Bu tez çalışması sonucu elde edilen bulgular ile bu amaca yönelik bir alt yapı oluşturulmuştur.