Klonlama, erişkin bir canlıdan elde edilen vücut hücresinin o türe ait genetik materyali çıkartılmış bir yumurta hücresi içerisine konulması ile bir bireyin genetik kopyasının oluşturulması anlamına gelmektedir. Bu zamana kadar bu teknolojinin kullanılması ile birçok memeli türü klonlanmış ve teknoloji iyileştirilmeye çalışılmıştır. Ancak yapılan çalışmalarda elde edilen başarılar teknolojinin aydınlatılmasında yeterli olmamıştır. Bu sebeble klonlama teknolojisi ile elde edilen hayvanlar ve yavrularının detaylı bir şekilde incelenmesi gerekmektedir. Bu sayede teknoloji daha anlaşılır hale getirilebilir. Bu amaç doğrultusunda klonlar ve yavrularının moleküler karakterizasyon sonuçlarının elde edilen klonların normal bir ırk populasyonu oluşturmasının mümkün olup olmadığı ve bu teknolojinin nesli tükenmiş bir ırkın geriye getirilmesindeki muhtemel potansiyeli ile ilgili ipuçları vereceği düşünülmektedir.
Mikrosatellit belirteçler; polimorfizm oranının yüksek olması nedeniyle genetik haritalama, ebeveyn tayini (paternity test) , pedigri çalışmaları, akrabalı yetiştirmelerin (inbreeding) seviyesi ve etkisinin belirlenmesi, populasyonların evrim tarihi çalışmaları, gen kaynaklarının korunması çalışmaları, genetik çeşitliliğin araştırılması, biyolojik materyallerin adli amaçlı kimliklendirilmesi için kullanılmaktadır. Bu belirteçler klon hayvanlarda ise; klonlar, onların yavruları ve klonların üretilmesinde kullanılan verici hücreden elde edilen genomik DNA’da mikrosatellit analizi yapılarak klonların genomik DNA açısından verici hücreler ile özdeş olduğu ve yavrularında bu klonlara ait olduğunu teyit etmek için kullanılmaktadır. Bu analizler FAO ve ISAG tarafından tavsiye edilen mikrosatellit belirteçler kullanılarak yapılmaktadır. FAO tarafından sığır populasyonlarının araştırıldığı çalışmalarda
kullanılabilecek 30 adet belirteç tavsiye edilmektedir
(http://www.fao.org/docrep/014/i2413e/i2413e00.html). Daha önce yapılan çalışmalar incelendiğinde 6 (Yang ve ark. 2012), 9 (Zakhartchenko ve ark. 1999), 12 (Theoret ve ark. 2006) , 17 (Kato ve ark. 2000) adet mikrosatellit belirteç kullanılarak klon sığırların genomik DNA açısından karakterizasyonlarının yapıldığı görülmüştür. Yapılan bu yüksek lisans çalışmasında ise 10 adet mikrosatellit belirteç kullanılarak klon hayvanlar ve yavrularının genomik DNA karakterizasyonu yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar klon hayvanların verici hücreleri ile özdeş olduklarını ve yavruların bu klonlara ait olduğunu ortaya koymuştur. Ancak dişi klonların hepsinin tek bir hayvanın genetik kopyası, dolayısıyla genomik DNA’sının aynı olması sebebiyle yavruların annelerinin klon dişilerden hangisi olduğunu belirlemek mikrosatellit belirteçler ile mümkün değildir. Aynı şekilde babası Klon 1 ve Verici
65
Hayvan 1 olan yavruların da babalarının özdeş olması sebebiyle hangi babadan geldiklerinin ayırt etmek mümkün değildir. Klonlar için özel bir durum olarak her bir klonun farklı yumurta kaynağından gelmiş olması mtDNA analizi ile annelerin tespit edilmesini sağlayabilir. Ancak bu durum mtDNA’nın anne kaynaklı olması sebebiyle babalar için geçerli değildir.
mtDNA belirteçleri genel olarak; populasyonların tanımlanması, populasyon ve ekotiplerin orijinlerinin belirlenmesi, populasyonların coğrafi dağılımlarının ortaya konması, alttür içerisindeki haplotiplerin belirlenmesi, populasyonlar arasındaki gen akışı ve hibritlenme seviyelerinin tahmin edilmesi, anaya ait (maternal) kalıtım modellerinin izlenmesi, populasyonlar içi/arası genetik varyasyon düzeylerinin hesaplanması ve populasyonların genetik benzerlik ve farklılıklarından yararlanılarak filogenetik ilişkilerin tespit edilmesi, çalışmalarında yaygın bir şekilde kullanılmaktadır.
Genel kanı normal seksüel üreme esnasında mitokondrinin (ve mtDNA’lar) anneden geçtiği yönündedir. Babadan kaynaklı mitokondri yumurta içine girer ancak ilk bölünmeler ile oluşan az sayıdaki embriyonik hücrelerde bilinmeyen bir mekanizma ile hızla elimine edilir (Giles ve ark. 1980, Kaneda ve ark. 1995) .
Klonlama teknolojisi ile elde edilen hayvanlarda mtDNA geçişi incelendiğinde ise; mtDNA’nın normal seksüel üremede olduğu gibi genelikle alıcı yumurta kaynaklı olduğu görülmektedir (Plante ve ark. 1992, Steinborn ve ark. 2000, Evans ve ark. 1999, Steinborn ve ark. 2000, Tae Do ve ark. 2002, Burgstaller ve ark. 2007). Yapılan yüksek lisans çalışmasında moleküler karakterizasyonu yapılan 1 erkek ve 4 dişi klonun mtDNA’sının hücre vericilerinden farklı olduğu bulunmuş ve mtDNA’ların yumurta kaynaklı olduğu belirlenmiştir. Bu klonlardan Klon 2 ve 3 (Ece, Ecem)’ün analiz sonuçları incelendiğinde mtDNA’larının birbirleri ile aynı oldukları görülmüştür. Diğer 2 dişi klonun ( Klon 4-Nilüfer ve Klon 5-Kiraz) ise hem birbirinden hem de Klon 2,3’ten farklı olduğu tespit edilmiştir. mtDNA geçişi generasyonlarda incelendiğinde Klon 4 ve 5’in mtDNA’ları yavruları ile aynı ancak Klon 3’ün yavrularından farklı olduğu görülmüştür.
Tek anneden bir batında doğan iki dişi klonun (Klon 2 ve 3) mtDNA analizlerinde hiçbir farklılığın tespit edilemesinin çeşitli sebepleri olabilir. Klonlama işleminde bir ovaryumdan iyi kaliteli 4 yumurta elde edildiğini ve günde 50 ovaryumdan (25 dişiye ait) yaklaşık 200 yumurta hücresi ile çalışıldığı düşünülürse aynı hayvana ait yumurtalardan gelişen embriyoların transfer edilmiş olma ihtimali %3 gibi düşük bir ihtimaldir. Bir başka ihtimal ise klon embriyonun transfer sonrası ikiye bölünerek iki ayrı embriyo olarak gelişmesidir. İki klon embriyonun transferi sonrası ultrason muayenelerinde sadece tek yavru
66
kesesinin fark edilmiş olması ve ikizliğin ancak doğum sırasında anlaşılması böyle bir ihtimalin de olabileceğini düşündürmektedir. Bunlara ilave olarak intaruterin gelişimi boyunca embriyolar arasında karşılıklı hücre değişimi ve vasküler anostomozdan kaynaklanan kan lenfosit hücreleri ve üreme hücreleri kimerizmi ikiz sığırlarda iyi bilinen bir olgudur. Bu tip kimerizm aynı zamanda at, koyun, insan, lama gibi diğer memeli türlerinde de görülmüştür (Hiendleder ve Wolf 2003). Bir çalışmada iki farklı yumurta kaynağından üretilen in vitro embriyoların aynı anneye transferi sonrasında ikiz fetusların kan ve karacigerinde kimerizm tespit edilmiştir (Hiendleder 2007). Bu durumda iki embriyo farklı yumurtadan gelmiş olsa dahi embriyolar arası hücre geçişi sebebiyle ikizlerin kanında iki ayrı yumurtadan kaynaklı hücrelerin bir arada varlığı görülebilir. Ancak bu durum diğer dokularda olmayabilir. Dolayısıyla kan hücrelerindeki kimerizme bağlı olarak yavrularından farklı mtDNA’a sahip olduğu görülen dişi klonun (Klon 3-Ecem) yumurta hücrelerinde tek tip mtDNA tespit edilebilir. Yavrularda anneden farklı mtDNA varlığı görülmesi diş klonun üreme hücreleri de dahil olmak üzere kan dışındaki diğer dokularında tek bir yumurtadan gelen mtDNA varlığının mümkün olabileceğini düşündürmektedir. Ancak tüm mtDNA analizleri kan örneklerinde yapıldığı için bu çalışmada kesin bir şey söylemek mümkün değildir. Ayrıca klon dişinin dizi analiz sonuçlarında bazı nükleotidlerde görülen çift bantın kirlilikten mi yoksa kimerizden mi kaynaklandığı ayırt edilememektedir. Görülen ikinci bandın gerçek olup olmadığı farklı bir yöntemle teyit edilmelidir.
Bu konuda sunulan birçok rapora rağmen mitokondriyal DNA geçişi klonlamada hala bir sorun veya en azından bir bilinmeyen olarak değerlendirilmektedir. Teknolojinin uygulanışının bir sonucu olarak klonların MtDNA varlığının yumurtadan geleceği öngörülür. Bunu teyit eden birçok çalışmaya rağmen bazı raporlarda tam açıklanamayan bulgulara rastlanması ırklar arası nükleer transferde farklı genetik materyallerin birbiri ile uyumu konusunu gündeme getirmektedir. Bu konuda çok az çalışma vardır. Bu nedenle klonların moleküler karakterizasyonu ile ilgili her çalışma teknolojinin daha iyi anlaşılmasına katkı sağlayacaktır. Mevcut çalışmada incelenen klonlar iki farklı ırkın materyalinin bir araya getirilmesi ile oluşturulmuş ırklar arası klonlardır. Çalışmanın sonuçları da diğer birçok çalışmada rapor edildiği gibi mtDNA’nın yumurta kaynaklı olduğunu göstermiştir. Klonların halen sağlıklı olması ve sağlıklı yavrular vermesi mtDNA ve genomik DNA farklılığının klonlar ve jenerasyonlarında zararlı etkisinin olmadığını düşündürmektedir.
Klonlardaki mtDNA varlığı ile ilgili olarak tam tersi bir görüş klon evcil hayvanların üretilmesinde mtDNA farklılığının getirebileceği avantajlarla ilgilidir. MtDNA polimorfiktir
67
ve spesifik ana hattındaki bazı polimorfizmler süt üretimi ve büyüme performansı ile alakalıdır. Klonlama teknolojisi istenen genomik DNA ile arzu edilen polimorfizmi taşıyan mtDNA’nında bir araya getirilmesini ve böylece daha mükemmel bireylerin ortaya çıkmasını da sağlayabilir. Ancak bütün bu öngörülerin araştırmalarla desteklenmeye ihtiyacı vardır.
Klonlama, hayvancılık açısından baktığımızda gerek üstün genetik yapıya sahip, hastalıklara dirençli hayvanların sayısı artırmak gerekse sayıları azalan veya yok olan ırkları tekrar doğaya kazandırmak için başlı başına üretim amacıyla kullanılabileceği gibi aynı zamanda gelişim biyolojisinde henüz çözülemeyen birçok mekanizmanın aydınlatılması için model organizmalar oluşturmak amacıyla da kullanılabilir. Her ne amaçla üretilmiş olursa olsun klonlar özel hayvanlardır ve halen birçok bilinmeyeni bünyelerinde barındırmaktadırlar. Bu nedenle klonlar üzerinde yapılan her çalışma hem teknolojinin daha iyi anlaşılarak kontrol edilebilir hale gelmesine hem de bilinmeyen birçok mekanizmanın aydınlatılmasına katkı sağlıyacaktır.
Bu çalışma ırklar arası nükleer transfer sonucu oluşturulmuş klon sığır ve jenerasyonları üzerinde yürütülmüş moleküler karakterizasyon bulgularını içermektedir. Çalışma bulguları mikrosatellit belirteçlerin klonların özellikle köken aldığı birey ile genomik DNA açısından özdeş olduğunu tespit etmek amacıyla kullanılabileceğini, ancak genomik DNA bakımından özdeş klonların yavrularının hangi ebeveyne ait olduğunu belirlemede yetersiz olduğunu göstermiştir.
Klonlama çalışmalarında mtDNA geçişi halen bir bilinmeyen olarak gizemini sürdürmektedir. Yapılan çeşitli çalışmalar gelişim biyolojisinden bildiğimiz “mtDNA anne orjinlidir” temel bilgisinin gerçek temellerini ve mekanizmanın işleyişini aydınlatma da şaşırtıcı ipuçları sunarken her bulgunun bir öncekini destelemeyebildiği ve birbirinden farklı sonuçların ortaya çıkabileceği de görülmektedir. Mevcut çalışma da klonların hepsinin mtDNA’ları klonlandıkları hayvandan farklı bulunmuştur. Dolayısıyla tüm klonlar genomik DNA bakımından identikal ancak mtDNA bakımından birbirinden farklıdır. Bu daha önce yapılmış birçok çalışma ile uyumludur ancak iki dişi klonun klonlandıkları hayvandan farklı mtDNA’ya sahip olmalarına rağmen aralarında hiçbir fark görülmemesi düşündürücü bulunmuştur. Yine genel bilgi olarak yavruların mtDNA’larının anneleri ile aynı olması gerekir. Oysa iki dişi klonun yavrularının mtDNA’sı anneleri ile aynı iken bir dişi klonun yavrularının mtDNA’sı annelerinden farklı bulunmuştur. MtDNA geçişinin daha iyi aydınlatılması amacıyla klonların daha çok sayıda yavrusu ile çalışılması önerilebilir. Yine
68
özellikle birbirinin aynı mtDNA’ya sahip tek taşıyıcı anneden doğan ikiz klon dişilerin mtDNA varlığı kan dışındaki dokularda da araştırılabilir. MtDNA profili dizi analizine ilave olarak farklı moleküler yöntemler kullanılarak incelenebilir ve sonuçların dizi analiz sonuçları ile nasıl örtüştüğü değerlendirilebilir.
Bir diğer konu farklı mtDNA geçişi ile oluşturulan klon sürünün süt verimi veya büyüme performasının ırk ortalamasından farklı olup olmadığının araştırılmasıdır. Elde edilen sonuçlar teknolojinin iyi yönde bir ilerlemeyi de sağlama da muhtemel potansiyelini görmek açısından faydalı olabilir.
69