59
Moraes ve ark. (2016) pasaj 3 mezenkimal kök hücre hattındaki kondrojenik farklılaşmanın 14. günde fibroblastoid hücre popülasyonunun küboidal hücrelere dönüşmeye başladığını rapor etmişlerdir. Çalışmamızda kondrojenik farklılaşma çalışmalarına (Bunnel ve ark., 2008; Moraes ve ark., 2016) benzer şekilde kıkırdak matriks oluşumunu gösteren proteoglikanların 21 gün sonra oluştuğu ve belirgin kondrojenik yönde farklılaşan hücreler görüldü. Çalışmamızda; pasaj 3 hücrelerin 21 gün sonra kondrojenik yönde farklılaştığı Alcian Blue boyama tekniği ile belirlenerek elde ettiğimiz hücrelerin kondroblast hücreleri olduğu saptandı.
Birçok araştırmacı (Zuk ve ark., 2001; Taha & Hedayati, 2010; Huang ve ark., 2013); pasaj 3 mezenkimal kök hücre hattındaki adipojenik yönde farklılaşmanın birinci haftasında yassı formdaki hücrelerin vakuoler hücrelere dönüştüğünü rapor etmişlerdir. Bu vakuoler formdaki hücrelerin sitoplazmasında lipid damlacıklarının görüldüğü ve hücrelerin adipositler olduğunu bildirmişlerdir.
Tez çalışmamızda; birçok araştırma bulguları ile (Zuk ve ark., 2001; Taha, &
Hedayati, 2010; Huang ve ark., 2013) paralel olarak; 5. günde hücre sitoplazmasında lipid vakuollerini, hücre popülasyonunun fibroblastoid yassı görünümden yuvarlak adiposit hücrelerine dönüştüğünü ve 14 gün sonra hücre popülasyonunun % 70’inde lipid damlacıklarının belirgin olarak arttığını, adipojenik yönde farklılaştırdığımız hücrelerin Oil Red O histokimyasal boyama tekniği ile kırmızı renkli vakuoller oluşturarak adipositlere dönüştüğünü saptadık.
ISCT tarafından kabul gören çeşitli kök hücre yüzey işaretleyicileri olan CD44, CD29, CD73, CD105 ve CD90’ın kök hücrelerde taşınırken; CD14, CD34, CD44 ve CD117 gibi yüzey işaretleyicilerinin ise olmaması gerektiği ve bu özelliklere sahip kök hücrelerin ise MKH oldukları tanımlanmıştır (Dominici ve ark., 2006; Huang ve ark., 2013). Yoshimura ve ark. (2006) non enzimatik yöntemle izole ettikleri hücrelerde CD44 (44,8 ± 11.0), CD73 (99,7 ± 0,3), CD29 (99,3 ± 1,0), CD105 (99,8 ± 0,1) ve CD90 (99,7 ± 0,39)’ın pozitif stromal/mezenkimal kök hücre yüzey işaretleyicilerinin yüksek oranda gözlendiğini ve CD45 (1.7 ± 1.4), CD34 (10,7 ± 9,2) gibi hematopoietik yüzey işaretleyicilerinin ise daha az olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte non enzimatik yöntem ile MKH izolasyonunda;
sağlıklı ve yüksek oranda kök hücre potansiyeline sahip yüzey işaretleyicisi taşıyan hücrelerin elde edildiğini saptamışlardır (Yoshimura ve ark., 2006). Dominici ve
60
ark., (2006); Yoshimura ve ark., (2006) ve Huang ve ark., (2013)’nın; bulgularına paralel olarak; çalışmamızda non enzimatik yöntemle izole ettiğimiz bu hücrelerin CD90 ve CD105 yüzey işaretleyicilerinin immunpozitif; CD45 ve CD11b yüzey işaretleyicilerinin ise immunnegatif reaksiyon verdiği saptandı. Böylece ürettiğimiz pasaj 3 hücrelerinin, mezenkimal kök hücre potansiyelinde olduğunu göstererek fenotipik karakterizasyonu tanımlandı.
CD90 pozitif olan hücrelerin; fibroblast benzeri morfolojiye sahip olduğu CD90 taşımayan hücrelerin ise poligonal hücre formuna farklılaştığı bildirilmektedir (Moraes ve ark., 2016). Benzer şekilde çalışmamızdaki pasaj 3 hücrelerinin fibroblast benzeri yapıya sahip olduğu CD90 pozitif reaksiyon verdiği saptandı. Aynı zamanda Moraes ve ark. (2016) tarafından CD90 kök hücre yüzey işaretleyicisi ile pozitif reaksiyon veren hücrelerin henüz farklılaşmamış olduğunu veya CD90’ın azalmasının hücrelerin farklılaşmaya başlaması açısından kilit bir role sahip olduğunu belirtmektedir. Özellikle farklılaşmış olan adiposit hücrelerinde CD90 bulunmazken; MKH’lerin farklılaşma potansiyelinin korunması ve terapötik etkinliği açısından da CD90 taşınmasının önemli olduğu belirtilmektedir (Moraes ve ark., 2016). Hazırlanan tez çalışmamızda primer hücre kültürü ile yağ dokusundan izole ettiğimiz pasaj 3 hücrelerinin; plastik yüzeye tutunarak çoğaldığı, homojen fibroblastoid popülasyona sahip olduğu, osteojenik, kondrojenik ve adipojenik yönde farklılaşabildiği ve hücrelerin CD90 ile CD105 yönünden immunpozitif ve CD11b ile CD45 yüzey işaretleyicileri açısından immunnegatif reaksiyon verdiği tanımlandı.
Literatür bilgisine (Özen & Gül Sancak, 2014; Kibria, Altunbaş, & Yağcı, 2015; Gül Sancak, Özen, Bayraktaroğlu, Ceylan, & Can, 2016; Çerçi, & Erdost, 2020) paralel olarak, çalışmamızda yağ doku kökenli mezenkimal kök hücrelerden izole edilen pasaj 3 hücre hattına ait hücrelerde hemostazisin devamının sağlandığı ve sağlıklı kök hücre proliferasyonunun gerçekleştiği görüldü.
Gerdes ve ark., (1984) ile Ross ve Hall, (1995) hücre proliferasyonunu Ki-67 antikorunun immunreaksiyonu ile değerlendirerek; sadece mitoz fazındaki hücrelerde Ki-67 antikorunun nükleusta pozitif reaksiyon verdiğini belirtmektedirler. Özellikle hücre döngüsü analizinde, Ki-67 antikoru G1, S, G2 ve mitotik fazdaki hücre nukleusunda bulunurken; G0 fazındaki hücrelerde Ki-67 antikorunun bulunmadığı rapor edilmiştir (Gerdes ve ark.,1984). Gronthos ve ark., (2001) tarafından yapılan
61
çalışmada Ki-67 antikorunun bulunduğu ve hücre proliferasyonunun pozitif olduğu S ve G2/M fazlarında mezenkimal kök hücrelerin osteoblastlara farklılaşmasının olumlu yönde arttığını belirtmişlerdir (Gronthos ve ark., 2001). Tez çalışmamızda, CAP’a bağlı olarak hücresel canlılığın, sağlıklı kök hücre gelişiminin ve proliferasyonun ne yönde etkilendiği Ki-67 antikorunun immunreaksiyonu ile değerlendirildi. CAP uygulamasının hücrelerde artan süre ve yüksek doza bağlı olarak hücresel canlılığı, kök hücre hemostazisini ve kök hücre proliferasyonunu azalttığı belirlendi. Lin ve ark., (2013) ise 100, 150, 200 ve 250 µM CAP uyguladıkları böbrek kanser hücre hattında, hücre proliferasyonunun baskılandığını ve hücre siklusunun G2/M fazında doza bağlı artışı sonucunda apoptozun indüklendiğini belirtmişlerdir. Ayrıca CAP’ın 100, 200 ve 250 µM CAP uygulama dozlarında mitokondriyal membran potansiyelinin depolarizasyonu ve caspase 3 aktivasyonu ile hücrelerde apoptoz etkisi oluşturduğunu da rapor etmişlerdir.
Bununla birlikte Qian ve ark. (2016); CAP’ın MCF-7 meme kanser hücre hatlarında mitokondriyal membran potansiyelinin stabilitesini bozduğunu ve kemoprotektif etki gösterdiğini, bunu ROS artışı ve ROS anabileşeni olan superoksitin katalaza dönüşümü aracılığıyla yaptığını göstermişlerdir. Qian ve ark. (2016); 48 saatlik 150 ve 300 µM CAP uygulamasının, Forkhead box (FOX) protein süper ailesindeki pek çok tümörogenezis oluşturan geni koordine eden FOXO3a’nın baskılanması aracılığıyla mesane kanser hücre hattında proliferasyonu baskıladığını, hücre döngüsünü durdurarak ROS artışını stimüle ettiğini belirtmişlerdir. Ito ve ark., (2004); Qian ve ark., (2016) çalışmalarında yüksek doz CAP uygulamasının mitokondriyal membran potansiyelini olumsuz yönde etkileyerek hücre döngüsünü bozduğunu, Annexin V ile caspase 3 değerlendirmesi ile apoptozu indüklediğini ve ROS üretimini arttırdığını bildirmişlerdir. Çalışmamızda ise; Ki-67 ve MTT analiz sonuçlarına bağlı olarak 24 saatlik 100 ve 150 µM CAP ile 48 saatlik 50, 100 ve 150 µM CAP uygulama dozlarında yağ doku kökenli mezenkimal kök hücrelerdeki proliferasyonun belirgin oranda azaldığı, hücresel sağ kalımın, kök hücre hemostazisinin baskılandığı ve mezenkimal kök hücrelerde apoptozun indüklendiği görüldü.
Çalışmamızda, 48 saatlik 25 µM ve üzerindeki CAP uygulamasında Ki-67 immunreaksiyonunun belirgin oranda zayıfladığı görüldü. Aynı zamanda MTT
62
bulguları ile desteklenerek hücre canlılığının azaldığı ve hücresel bütünlüğünün bozulduğu mikroskobik olarak sitoplazma ile hücre membranının parçalandığı, kök hücrelerde hücresel hasarın önemli düzeyde arttığı saptandı.
Gimble & Guilak, (2003), Dominici ve ark (2006) ile Moraes ve ark. (2016) çalışmalarında plastik yüzeye tutunan fibroblastoid karakterli mezenkimal kök hücrelerin, fenotipik karakterini koruması için CD90 ekspresyonunun gerekli olduğunu belirtmişlerdir. Ancak Moraes ve ark., (2016) CD90’ın azalması ile hücrelerin aslında farklılaşmaya başladığını ve fibroblastoid yapıdan uzaklaşarak poligonal hücrelere dönüştüğünü vurgulamışlardır. Çalışmamızda 24 ve 48 saatlik 5, 10 ve 25 µM CAP dozlarının; CD90 immunreaksiyonunu olumsuz yönde etkilemediği, plastik yüzeye tutunmanın değişmediği, fibroblastoid hücrelerden oluşan homojen popülasyonun arttığı gözlenerek, hücresel proliferasyonun arttığı, böylece mezenkimal kök hücre karakterinin de bozulmadığı ve istenmeyen hücre farklılaşmasının olmadığı saptandı. Aynı zamanda 24 ve 48 saatlik 50, 100 ve 150 µM CAP uygulama dozlarında artan CAP dozuna ve süreye bağlı olarak hücresel formasyonda heterojenik popülasyona sahip poligonal formda farklılaşan hücreler belirlendi.
CD105 yüzey işaretleyici, endotel hücrelerinin göçünü, hayatta kalma ile hücre iskeletinin organizasyonunu düzenler ve anjiyogenezde etkin rol alır (Ryu ve ark., 2010). CD105'in yokluğu veya azalması MKH farklılaşması ile ilişkilendirilmektedir (Ryu ve ark., 2010). Ayrıca CD105 negatif yağ doku kökenli MKH’lerin, CD105 pozitif immunreaksiyon verenlere oranla, kondrositlere farklılaşmaya daha yatkın olduğu bildirilmiştir (Ryu ve ark., 2010). Rosu Myles ve ark. (2010) tarafından CD105’in azalması sonucunda, hücresel farklılaşmanın oluştuğu, ancak mezenkimal kök hücre özelliklerinin azalmaya başladığını belirtmişlerdir (Rosu Myles ve ark., 2010). Gaebel ve ark. (2011) CD105 ekspresyonunun MKH'lerdeki terapötik etkilerini inceleyerek ilk olarak, insan CD105 pozitif kemik iliği kökenli MKH'lerin enfaktüse bağlı dejeneratif kalp rejenerasyonunda oldukça etkili olduğunu saptamışlardır (Gaebel ve ark., 2011).
Çalışmamızdaki bulgularda CD105 pozitif immunreaksiyon 24 saatlik uygulamada 5, 10 ve 25 µM CAP dozlarında artarken 50, 100 ve 150 µM CAP dozlarında ise
63
azaldığı saptandı. 24 saatlik uygulamada 5, 10 ve 25 µM CAP dozlarındaki CD105 ile CD90 artışları birlikte değerlendirildiğinde mezenkimal kök hücre potansiyelinin korunduğu görüldü. 24 saatlik uygulamada 50, 100 ve 150 µM CAP dozlarında ise CD105 ile CD90 pozitif immunreaksiyonun azalması; hücresel farklılaşmanın başladığını, kök hücre fenotipik özelliğinin değiştiğini ve kök hücre potensiyelinin azaldığını göstermektedir. 48 saatlik uygulamada ise 5, 10 ve 25 µM CAP dozlarında hücresel proliferasyonun 24 saatlik uygulamaya göre daha fazla azaldığı saptandı.
CD105 ekspresyonunun 48 saatlik 50, 100 ve 150 µM CAP dozlarında önemli derecede azalmasının hem proliferasyonun azalışı hem de mikroskobik bulgularımızda hücresel bütünlüğün, hücresel tutunmanın yoğun düzeyde azalmasının, CD90 ekspresyonunun azalmasıyla paralel bir ilişkisi olduğunu göstermektedir. Aynı zamanda bu bulgular; MTT sonuçlarında hücresel canlılığın azalması ve Ki-67 immunreaksiyonunun azalması ile desteklenmektedir. Sonuç olarak CD105’in pozitif immunreaksiyonunun, 24 saat süresince 5, 10 ve 25 µM CAP uygulamalarında artışı; hücresel göçü, hücresel tutunmayı, hücresel sağ kalımı ve mezenkimal kök hücre proliferasyonunu olumlu yönde desteklediği saptandı.
Ayrıca hücresel farklılaşma ise Rosu Myles ve ark. (2010) çalışmalarına benzer şekilde 24 saatlik 150 µM CAP ve 48 saatlik 50, 100 ve 150 µM CAP uygulama dozlarında görüldü.
CD11b yüzey işaretleyicisi, integrin reseptör ailesinin α alt birimlerine ait olup, hücresel adezyon ve sinyal iletimi için kritik olan bir transmembran molekülü olarak işlev görür (Avery ve ark., 2019). Schmid ve ark. (2018) ve Carmeliet & Jain (2011) CD11b artışı kök hücre göçü, hücre adezyonu ve hücresel hemostazisin korunabilmesi için önemli olabileceğini rapor etmişlerdir. Çalışmamızda elde edilen bulgularda, CAP uygulamasının özellikle 24 saatlik 50, 100 ve 150 µM CAP uygulamalarında ve 48 saatlik 25 µM CAP üzerindeki dozlarda CD11b negatif yüzey işaretleyicisinin pozitif immunreaksiyon vermeye başladığı saptandı. Böylelikle;
CAP, doz ve süre artışına bağlı olarak mezenkimal kök hücreleri fibroblastoid formdan uzaklaştırarak farklılaştırdığı, poligonal formda farklılaşan hücrelerin oluşumuna sebep olduğu görüldü. Bu bulgular CD11b artışının, kök hücrelerin immünolojik yapısını değiştirdiğini düşündürmektedir. Çalışmamızda; 24 saatlik CAP uygulamasının, özellikle 50, 100 ve 150 µM uygulamalarında negatif olması
64
gereken immunreaksiyonun pozitif yönde arttığı, 48 saatlik uygulamada ise bu artışın 25, 50, 100 ve 150 µM CAP dozlarında gözlenerek, hücresel farklılaşmanın başladığı belirlendi. Aynı zamanda CD90 ekspresyonunun azalması ile birlikte non adhezif ve heterojenik hücre popülasyonunun varlığı saptandı. Özellikle 24 saat süreli 150 µM CAP uygulaması ile 48 saat süreli 25 µM ve üzeri CAP dozu uygulamalarında CD11b, CD45 pozitif immunreaksiyonunun başlaması, CD90 ve CD105 pozitif immunreaksiyonunun ise azalmaya başlaması sonucunda kök hücrelerin farklılaşmış olabileceğini öngörmekteyiz. Bununla birlikte 48 saatlik 100 ile 150 µM CAP dozlarında hücresel sağ kalımın azalmaya başladığı, hücresel strese karşı immun baskılanmanın veya kök hücre popülasyonundaki hücresel canlılığın azalmasından dolayı CD11b pozitif immunreaksiyon artışının da doğal bir süreç olabileceğini düşünmekteyiz. Elde ettiğimiz bulgularda artan doz ve sürede uygulanan CAP’ın mezenkimal kök hücreleri hücresel farklılaşma siklusuna yönlendirebileceğini, hücre sağ kalıımı ve proliferasyonu üzerine olumsuz etkiler yaratabileceği saptandı. Kök hücre potansiyelini koruyamadığı durumda, canlılığının devamlılığını sağlamak için kök hücrelerin olası farklılaşma sürecine girdiği ve immun baskı altında hücresel sağ kalımı azalttığı gözlendi.
Peker (2015); 30 günlük sıçan ovaryum granuloza hücre hattında in vitro ortamda yapmış olduğu çalışmada 10, 50 µM CAP dozlarının proliferasyona ve 100 µM üzerindeki uygulama dozlarının ise apoptoza yol açtığını bildirerek CAP’ın düşük dozlarının ovaryum granuloza hücreleri üzerinde proliferatif etki gösterdiğini, CAP uygulama dozu arttıkça apoptozun arttığını bildirmiştir (Peker, 2015). Mızrak (2003) ile Mızrak ve ark. (2008) tarafından erişkin sıçan spermatogenik hücre hatlarında 24 ve 48 saatte 150, 200 ve 250 µM CAP dozlarında, germ hücrelerindeki DNA parçalanmasına ve apoptoza sebep olduğunu in vitro spermatogonial germ hücrelerinde sağ kalımı olumsuz yönde etkilediğini saptamışlardır. Çalışmamızda 48 saatlik 100 ve 150 µM CAP uygulaması sonucunda elde edilen MTT analizi ve Ki-67 immunreaksiyon bulgularında aynı deney gruplarında hücre proliferasyonunun azaldığı ve hücresel sağ kalımın baskılandığı saptanırken, CD90 ekspresyonunun azalması kök hücre stresine karşı proinflamatuar bir yanıt oluşumunun başladığını ve CD11b’nin pozitif immunreaksiyon vermesine sebep olduğunu düşündürmektedir.
Çalışmamızdaki sonuçlar değerlendirildiğinde; in vitro ortamda 24 saat boyunca 5,
65
10 ve 25 µM CAP içeren MKH’lerin farklılaşmadan proliferasyonunu arttırdığı ve kök hücre hemostazisinin bozulmadığı saptandı. Bu bulgular; 5, 10 ve 25 µM CAP ile inkube edilerek canlı dokuya transplante edilen MKH’lerin; TRPV1 reseptörü olan dokulara bağlanma olasılığını, canlıdaki kök hücrelerin proliferasyonunu indükleyerek, hızlıca göç edebileceğini, canlı dokuya uyum ve yayılım sürecinin daha hızlı olup olamayacağı sorusunu akla getirmektedir. Az sayıda izole elde edilen kök hücrelerin, CAP içeren besiyerinde subkültür yöntemi ile proliferasyonunun artıp artmayacağı, CAP ile subkültüre edilen MKH’lerin canlı dokulara transplantasyon sırasında sayısı az olsa bile, olası terapötik etkide anlamlı artış ve TRPV1 reseptörü taşıyan doku ile organlarda sistemik bir kök hücre göçü sağlayıp sağlayamayacağı, gibi araştırılması gereken birçok soru ve projeleri gündeme getirmektedir.
Hücre ve doku kültüründe hücrelerin daha iyi bir performans göstermesi için ticari serumlardan yararlanılmaktadır. Fang ve ark. (2017) Fetal bovine serum ile belirgin morfolojik değişiklikler olmadan test edilen hücre hatlarında, hücrelerin uzun süreli büyümesini destekleyebileceğini göstermişlerdir. Bazı alternatif ticari serumlar; FBS'e benzer hatta daha üstün performans göstererek, hücre ve doku kültüründeki FBS gibi etki sunmaktadır (Fang, Wu, Fang, Chen, & Chen, 2017).
Basic fibroblast growth factor (bFGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), angiopoietin 1 (Ang-1), placenta growth factor (PGF) gibi pek çok gelişme faktörleri içeren ticari serumlar bulunmakta olup hücre kültür ortamına eklenerek hücresel proliferasyonu arttırmakta ve kök hücre gelişimini olumlu yönde desteklemektedir (Chua, Raduan, Wan Safwani, Manzor, Pingguan-Murphy, & Sathapan, 2013).
Çalışmamızda 24 saat süre ile 5, 10 ve 25µM CAP dozlarının in vitro ortamda sıçan mezenkimal kök hücrelerinde proliferasyonu arttırdığı, kök hücre fenotipik karakterizasyonunu değiştirmediği ve kök hücrelerin farklılaşmasına sebep olmadığı belirlendi. Elde ettiğimiz bulgular ışığında in vitro mezenkimal kök hücre izolasyonları ve subkültür fazlarında Capsaicin’in düşük dozlarının alternatif bir hücre kültür besiyeri katkı materyali olarak proliferasyon indükleyici gelişme faktörü olabileceğini düşünmekteyiz.
66 Sonuç olarak;
Yağ doku kökenli pasaj 3 mezenkimal kök hücrelerinde; 24 saat süre ile 5, 10 ve 25 µM CAP dozlarının mezenkimal kök hücre fenotipini değiştirmeden kök hücre proliferasyonu ve kök hücre sağ kalımını arttırdığı saptandı. Ancak 24 ve 48 saatlik 50 µM ve üzeri uygulanan CAP dozlarının hücresel farklılaşmayı indüklediği, hücre canlılığı ve proliferasyonu azalttığı belirlendi.
Bu bulgular kapsamında;
Capsaicin’in in vitro ortamda besiyerlerine kısa süre ile düşük dozda uygulanabilecek alternatif yeni bir biyomateryal olarak kullanılıp kullanılmayacağının;
In vivo ortamda Capsaicin içeren besiyerinde üretilen mezenkimal kök hücrelerin canlı dokuya transplantasyon sonrası TRPV1’e bağlanarak; daha hızlı terapötik etkinliği oluşturup oluşturmayacağının yapılacak in vitro ve in vivo klinik çalışmalar ile desteklenmesinin bilime katkı sağlayacağı düşüncesindeyiz.
67