Intervalo Simples
O mapeamento por intervalo simples foi proposto por Lander e Botstein (1989). A partir de um modelo genético de co-segregação, é definida a probabilidade condicional dos genótipos do QTL em relação aos genótipos dos dois marcadores que flanqueiam o intervalo e as variâncias dos possíveis genótipos do QTL são consideradas homogêneas. Desta forma, dado o intervalo incremental, a variância e as médias das classes genotípicas do QTL, é definida uma razão de função de log-verossimilhança para testar a hipótese das médias das classes serem diferentes, contra a hipótese nula de que as classes tem médias fenotípicas iguais. Os resultados do teste são expressos em “LOD-Score” (LIU, 1998).
O rastreamento é feito ao longo das marcas genéticas ordenadas, de uma forma sistemática e linear, testando a mesma hipótese nula e utilizando a mesma fórmula de verossimilhança a cada incremento. Os LOD-Score acumulados, representam o lod profile, ao longo do mapa genético. A localização do máximo LOD-Score, tem o potencial de indicar múltiplos QTL, quando um modelo de QTL único é utilizado. Determinar qual dos muitos picos
indicam um QTL único, leva a um problema de determinar os resultados que são estatisticamente significantes. É difícil declarar um QTL com segurança, devido a verossimilhança ser uma função de misturas de normais (distribuições normais). Esta função quando maximizada sob as hipóteses nula ou alternativa, leva a testes estatísticos que falham ao seguir a distribuição estatística padrão. Isto acontece mesmo quando múltiplos testes e as premissas estatísticas são levados em consideração. Esta questão dos múltiplos testes e das premissas, podem ser resolvidas através da aplicação da metodologia de reamostragem (permutação ou bootstrap). Mesmo representando um avanço em relação os testes de marcas individuais, o mapeamento por intervalo é limitado pelo modelo que o define como um método de QTL único e pela procura unidimensional que não leva em consideração as interações entre QTL (DOEGER, 2002).
Segundo Liu (1998) os principais problemas do mapeamento por intervalo simples são que o número de QTL presentes não pode ser estimado, a localização do QTL não é precisa e os testes utilizados tem poder estatístico baixo. Entretanto, a maior limitação é que o modelo de mapeamento por intervalo simples não é independente para os diferentes segmentos se mais de um QTL existir na região, ou seja, o modelo assume que apenas um QTL afeta o caráter.
Intervalo composto
Jansem (1993) e Zeng (1993) propuzeram um modelo de regressão múltipla, denominado de mapeamento por intervalo composto (CIM). A metodologia evita que a existência de múltiplos QTL interfira no mapeamento do QTL de um determinado intervalo em consideração. Neste caso, no modelo de regressão múltipla a informação de marcadores adjacentes ao intervalo e de marcadores em outros grupos de ligação, é incluída na forma de covariáveis. Entretanto o modelo não considera o efeito de epistasia (ZENG, 1994).
No mapeamento por intervalo composto, a idéia é incluir marcas adicionais como cofatores no modelo do mapeamento por intervalo. Estes cofatores são constituídos por marcas significativamente associadas a efeitos de outros QTL (de outras regiões) e servem para remover esses efeitos da variação aleatória. Entretanto marcas adjacentes às marcas do intervalo em avaliação, não são incluídas como cofatores. Estas marcas adjacentes estão numa região denominada de janela, ou “window size”. Esta janela de exclusão tem a função de eliminar o
efeito de interação das marcas da região da janela com o QTL do intervalo principal. O beneficio de definir esta janela é que a variação associada ao ponto de análise (dentro do intervalo investigado) é restrita aos efeitos do QTL associado, ficando livre de efeitos de QTL ligados e de QTL-fantasma. A limitação dessa abordagem é ser restrita à procura unidimensional através do mapa genético e não tem sensibilidade para detectar os múltiplos efeitos epistáticos dos QTL. Além disso, deve-se tomar cuidado para não adicionar muitos cofatores no modelo, para preservar a quantidade suficiente de informação para estimar o efeito do QTL (DOEGER, 2002). Entretanto, se dentro do intervalo houver mais de um QTL, pode ser que não seja possível eliminar a interferência entre esses QTL.
Múltiplos QTL
A abordagem estatística para localizar múltiplos QTL é mais poderosa que a abordagem de QTL único, pois pode diferenciar entre QTL ligados ou em interação. Quando alelos de dois ou mais QTL interagem, há grande potencial de alterações no caráter quantitativa, mas de uma forma difícil de prever, podendo haver, inclusive, a completa perda da expressão do caráter na presença de certas combinações de múltiplos QTL (DOEGER, 2002) O mapeamento por múltiplos intervalos foi proposto por Kao et al. (1999).
O maior desafio na procura por QTL múltiplo é considerar simultaneamente cada posição no genoma, pois cada QTL pode agir independentemente, pode estar ligado a outro QTL ou interagir epistaticamente com outros QTL. QTL em interação é de particular interesse devido a indicarem regiões do genoma que não seriam detectadas utilizando a busca unidimensional (DOEGER, 2002)
Apesar do conceito de localização de múltiplos e interativos QTL ser de compreensão simples, a implementação é difícil, dado ao grande número de QTL potenciais e suas interações, o que leva a inúmeros modelos estatísticos e grande demanda computacional. Uma abordagem heurística que pode ser feita, é primeiro localizar todos os QTL únicos, e depois construir um modelo para esses QTL e suas interações, e finalmente, procurar em uma dimensão por interações significativas. Entretanto a abordagem fica limitada aos QTL que forem
significativos o bastante para serem selecionados na primeira fase e portanto não detectaria efeitos epistáticos entre QTL de pequena significância individual (DOEGER, 2002).
Doeger (2002) enfatiza que a importância de desenvolver modelos com múltiplos QTL é bem entendida para QTL ligados, e tem um grande papel na estimativa e localização de QTL epistático. O limitante é identificar o melhor modelo. Vários modelos são possíveis, de forma que determinar o melhor modelo não é uma tarefa fácil.
Tanto o mapeamento por intervalo, como o intervalo composto e o múltiplo- intervalo são baseados em populações de ascendência endogâmica.
Mapeamento em Populações F1 segregante
A análise de QTL depende da disponibilidade de uma população segregante estruturada. Populações do tipo F2, RC, RIL e F1S (população F1 segregante), são exemplos de
populações estruturadas que podem ser utilizadas na análise de QTL (LIN et al., 2003). Populações obtidas através de genitores com ascendência endogâmica (F2, RC e RIL) são mais
simples de serem analisadas, pois cada loco apresenta no máximo dois alelos em segregação e a fase de ligação entre locos é previamente conhecida. Em populações do tipo F1S as fases de
ligação entre locos não são conhecidas.
Uma população segregante (F1S) é obtida pelo cruzamento entre dois genitores
não-endogâmicos fenotipicamente contrastantes para o caráter em estudo. Neste caso, até quatro alelos podem segregar em cada loco e vários padrões de segregação dos locos podem ocorrer. Segundo WU et al. (2002), são possíveis até 18 tipos de segregação. Entretanto, a maior dificuldade está na determinação das fases de ligação entre locos marcadores e entre QTL. Devido a esta limitação, a análise de QTL em tais populações tem sido feita apenas por marcas simples, ou utilizando a estratégia do duplo pseudotestcross (dois mapas genitores) ou utilizando mapas integrados (fases de ligação estimadas).
A estratégia de marca simples, conforme já definida, não necessita de mapas e nem de estimativas de fases de ligação, mas apresenta as limitações já descritas no item 2.6.2.1, página 62.
A estratégia do duplo pseudotestcross foi inicialmente proposta por Grattapaglia e Sederoff (1994), gerando dois mapas genitores, utilizando apenas marcadores com segregação 1:1 (os tipo D de WU et al., 2002). Neste caso, cada mapa genitor é analisado separadamente, da mesma forma que se analisam mapas de populações RC. A vantagem é que as metodologias e os softwares são os mesmos utilizados para populações mais comuns, como as do tipo RC. A desvantagem é a limitação quanto a informação, já que marcadores com outras configurações (3:1, 1:2:1 e 1:1:1:1) não são aproveitados. Neste caso, somente são detectados QTL que possuem efeito de dominância e segregam em apenas um dos genitores.
Uma metodologia para detecção de QTL em mapas de ligação integrados de populações F1S foi proposta por Gazaffi (2009). A metodologia tem como base o mapeamento
por intervalo composto (CIM) e permite a detecção de QTL com diferentes padrões de segregação, além de identificar as fases de ligação e os efeitos aditivos e dominantes.
Segundo Gazaffi (1999) a principal dificuldade no mapeamento de F1S é a
dificuldade de caracterização das fases de ligação existentes entre marcadores e QTL. Entretanto essa dificuldade pode ser resolvida através da obtenção de mapas de ligação integrados a partir dessas populações F1S. Os mapas integrados são obtidos pela utilização da metodologia por Wu et
al. (2002), de acordo com a estratégia proposta por Garcia et al. (2006) e implementada através do pacote ONEMAP (MARGARIDO et al., 2007).
A metodologia proposta por Gazaffi (1999), é baseada na abordagem proposta por Lin et al. (2003) no mapeamento de QTL por intervalo simples em populações F1S, com enfoque
3 MATERIAIS E MÉTODOS
Para consecução dos objetivos, o trabalho foi executado em três etapas: Ensaio de resistência à Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae; Análise de Ligação e Mapeamento de QTL.