Koyun dalak doku arginaz enzimi ile daha önce çalışıldığına dair hiçbir literatür bilgiye rastlanılmamış ve bu çalışmada enzimin bazı özellikleri ortaya konulmuştur.
Enzimlerin genel yapısının protein kaynaklı olması nedeniyle ısıya dayanıklı değildirler. Maksimum aktivite gösterdiği ısının üzerine çıktığı zaman enzim aktivitesi düşmektedir. Koyun dalak doku arginazının preinkübasyon ısısını saptamak için farklı ısılarda (30-70 ˚C) enzim aktivitesine bakılmış ve en uygun preinkübasyon ısısının 58 ˚C olduğu, bu sıcaklıktan sonra enzim aktivitesinde düşme meydana geldiği tespit edilmiştir. Preinkübasyon ısısı farklı tür ve dokularda araştırılmış ve tüm metodlarda kullanıldığı görülmüştür. Preinkübasyon ısısı koyun gözü vitreusu için 40 ˚C (48), koyun meme doku arginazı için 52 ˚C (102), insan tükürük arginazı (67), tiroid doku arginazı (57), eritrosit ve uterus arginazı (49), bronş lavaj sıvısı arginazı (2) için 55 ˚C, diabetik rat karaciğeri için 68 ˚C (38), sığır rumen doku arginazı için 60 ˚C (41), domuz karaciğer arginazı için 45 ˚C (133), teleskop balığı karaciğeri için 37 ˚C (131), fascioliosisli koyun karaciğer arginazı için 65 ˚C (11), M. benedeni arginazı için 53 ˚C (107) olarak bildirilmiştir.
Preinkübasyon ısısının Mn +2 iyonlarına gereksinimini tespit etmek için enzim kaynağı MnCl2’ lü ve MnCl2’ süz (distile su ile) preinkübasyona tabii tutulmuştur. MnCl2’ lü preinkübasyon uygulanan enzim kaynağının, MnCl2’ süz preinkübasyon uygulanan enzim kaynağından yaklaşık 3 kat daha fazla aktivite gösterdiği saptanmıştır. Mn+2 iyonları preinkübasyon için gereklidir. Mn+2 iyonlarının enzim ile substrat arasında metal bir köprü kurduğu ve enzim- Mn+2-
arginin kompleksinin meydana gelmesinde etkili olduğu bildirilmiştir (116). Yapılan çalışmalarda preinkübasyon ortamına Mn+2’ nın ilavesinin enzim aktivitesini artırdığı görülmüştür (41,102). Mn+2’ nın preinkübasyon sırasında arginaza bağlanarak enzim aktivitesini ve dayanıklılığını artırdığı açıklanmıştır (83). Sığır tükürük arginazı (96), koyun meme doku arginazı (102) ve sığır rumen doku arginazı (41) için preinkübasyon ısısının ve Mn+2 iyonlarının gerekli olduğu ve aktiviteyi artırdığı yapılan çalışmalarda ortaya konmuştur. Sıçan karaciğer doku arginazının Mn+2 iyonları varlığında 55 ˚C’ de preinkübasyonunun enzim aktivitesini yaklaşık % 110 artırdığı, 5 mM MnCl2’ varlığında ve 55 ˚C’ de 20 dakika preinkübasyonla eritrosit arginaz aktivitesinin 2-6 kat, karaciğer arginaz aktivitesinin 4-5 kat arttığı saptanmıştır (28,126).
Koyun dalak doku arginaz enziminin en uygun preinkübasyon süresini tespit edebilmek için enzim 58 ˚C’ de 0-30 dakikalar arasında preinkübasyona tabii tutulmuş ve en uygun preinkübasyon süresinin 13 dakika olduğu tespit edilmiştir. Preinkübasyon süresi koyun meme doku arginazı (102) ve insan tiroid doku arginazı (57) için 12 dakika, koyun gözü vitreusu için 9-10 dakika (48), insan tükürük arginazı (67), bronş lavaj sıvısı arginazı (2) ve diabetik rat karaciğeri (38) için 20 dakika, sığır rumen doku arginazı (41), eritrosit arginazı (49) ve domuz karaciğer arginazı (133) için 5 dakika, uterus arginazı için 35 dakika (49), fascioliosisli koyun karaciğer arginazı için 15 dakika (11) , M. benedeni arginazı için 10 dakika olarak belirlenmiştir (107).
Enzimatik reaksiyonlar vücut ısısında oluştuğu için enzim kaynağı 37 ˚C’ de 0-30 dakikalar arasında inkübasyona bırakılarak optimum inkübasyon süresi tespit edilmeye çalışılmış, 10. dakikaya kadar lineerliğin devam ettiği, 10.
dakikadan sonra lineerliğin yerini hiberbolik bir görünümün aldığı gözlemlenmiştir. Bu nedenle koyun dalak doku arginazı için optimum inkübasyon süresi 10 dakika olarak kabul edilmiştir. Yapılan çalışmalarda farklı dokular için farklı inkübasyon süreleri tesbit edilmiştir. İnkübasyon süresi insan tiroid arginazı için 30 dakika (57), rat karaciğeri (38), insan karaciğer ve uterusu (49) için 20 dakika, koyun gözü vitreusu (48) ve fascioliosisli koyun karaciğer arginazı (11) için 10 dakika, sığır rumen doku arginazı için 13 dakika (41), M. benedeni arginazı (107) ve koyun meme doku arginazı için 15 dakika (102) olarak bulunmuştur. Ünitenin tanımı inkübasyon süresine göre yapıldığından araştırmacılar buldukları farklı sürelere göre üniteyi tanımlamışlardır.
Arginazın tetramerik bir yapıya sahip olduğu ve tetramerik yapının oluşması için Mn+2 katyonlarının gerekli olduğu Muszynska (91) tarafından belirtilmiştir. Mn+2 iyonlarının enzime bağlanması ısıya dayanıklılığı artırmakta ve enzimi inaktivasyonlara karşı daha dayanıklı hale getirmektedir (74). Bu nedenle koyun dalak doku arginaz aktivitesi üzerine MnCl2 konsantrasyonunun etkisi araştırılmış ve arginaz enziminin 2 mM MnCl2 konsantrasyonunda en yüksek aktiviteyi verdiği saptanmıştır. Yapılan çalışmalarda farklı dokular için gerekli olan MnCl2 konsantrasyonu farklı olup rat karaciğeri (38) ve sığır rumen doku arginazı (41) için 2 mM, M. benedeni arginazı için 0.5 mM (107), Xenopus leavis karaciğer arginazı için 50 mM (111), insan tiroid arginazı (57) ile karaciğer ve eritrosit arginazı (49) için 2.5 mM, insan tükürük arginazı (67) ve vitreus arginazı (48) için 5 mM, koyun meme doku arginazı için 0.75 mM (102), insan uterusu için 0.8 mM (49), domuz karaciğer arginazı için 10 mM (133),
fascioliosisli koyun karaciğer arginazı için 1 mM (11), diabetik rat karaciğer arginazı için 1-2 mM, böbrek arginazı için 2 mM olarak bulunmuştur (38).
Arginaz enzimi üzerine yapılan çalışmalarda farklı tampon sistemleri kullanılmıştır (11,28,38,41,48,49,57,99,102,107). Bu nedenle araştırmamızda uygun tampon seçimi ve optimal pH araştırılmış, bu amaçla Tris-HCl (pH 7.1 ile 10.6), Glisin-NaOH (pH 8.6-10.6) ve Sodyum bikarbonat- sodyum karbonat (pH 9.2-10.0) tampon sistemleri kullanılmıştır. Çalışmalar sonucunda koyun dalak doku arginazı için en uygun tampon çözeltisinin karbonat tamponu, optimum pH’ nında 9.5 olduğu saptanmıştır. Çalışmamızla paralel olarak karaciğer ve eritrosit arginazı (28), M. expensa arginazı (99), koyun meme doku arginazı (102), M. benedeni arginazı (107) için pH 9.5’ deki karbonat tamponu, sığır rumen doku arginazı (41) ve fascioliosisli koyun karaciğer arginazı (11) için pH 10’ daki karbonat tamponu, diabetik rat karaciğeri (38) için pH 10.1’ deki karbonat tamponu, insan karaciğer ve eritrositi için pH 9,7’ deki, insan uterusu için ise pH 9.6’ daki karbonat tamponunun kullanıldığı bildirilmiştir (49). Koyun gözü vitreusu için pH 8.8’ deki Glisin-NaOH tamponunun kullanıldığı (48), insan tiroid arginazının optimum pH’ sının 9,6 (57), domuz karaciğer arginazının pH’ sının 10.5 (133) olduğu, Genypterus maculatus türünden balıkların karaciğer arginazının (23) ve Sea molluse (Concholepas Concholepas) arginazının (21) pH 9.5’ de yüksek aktivite gösterdiği belirtilmiştir.
Koyun dalak doku arginaz aktivitesinin L-arginine karşı olan Km’ i araştırılmış, bu nedenle enzim miktarı sabit tutularak L-argininin değişen konsantrasyonlarında enzim aktivitesi ölçülmüş ve Km değeri 6 mM olarak bulunmuştur. Yapılan çalışmalarda farklı türden enzim kaynaklarındaki arginazın
L-arginine karşı olan Km’ inin geniş sınırlar içinde değiştiği görülmüştür. Km değerleri sığır rumen doku arginazı (41) ve fascioliosisli koyun karaciğer arginazı (11) için 4 mM, M. benedeni arginazı için 12.5 mM (107), insan eritrositi için 3.2 mM, karaciğeri için 4.1 mM, uterusu için 5.9 mM (49), tiroid arginazı için 2 mM (57), vitreus arginazı için 6 mM (48), koyun meme doku arginazı için 1.35 mM (102), Sea molluse (Concholepas Concholepas) arginazı için 25 mM (21), diabetik rat karaciğer arginazı için 3.2 mM, böbrek arginazı için 6.7 mM (38), Mus booduga karaciğer arginazı için 8.3 mM (118), Xenopus leavis karaciğer arginazı için 29 mM (111), domuz karaciğer arginazı için 19.6 mM (133) olarak bulunmuştur. Koyun dalak doku arginazı için bulduğumuz Km değeri yapılan çalışmalarda elde edilen Km değerleri sınırları içerisindedir.
Koyun dalak doku arginaz aktivitesi üzerine Mn+2, Ni +2, Cd+2, Co+2, Na+1, K+1, Li+1, Al+3, Mg+2, Mo+6 , Ca+2, Ba+2, Hg+2, Fe+3, Cr+3, Cu+2, Zn+2, Sn+2, Pb+2 ve Ag+2 metal iyonlarının etkisi araştırılmış ve enzim en yüksek aktiviteyi MnCl2 varlığında vermiştir. Enzimi aktive eden metal iyonları sıralamaya göre Mn+2 (%1645) > Ni +2 (%1193) > Li+1 (%1080) > Cd+2(% 603) > Co+2 (% 383) > K+1 (% 213) > Al+3 (% 193) > Na+1 (% 151) > Mg+2 (% 112) olarak bulunmuştur. Mo+6, Ca+2, Ba+2, Hg+2, Fe+3, Cr+3, Cu+2, Zn+, Sn+2 iyonları varlığında enzim aktivitesinde düşme görülürken Pb+2 ve Ag+2 iyonları varlığında enzim hiç aktivite göstermemiştir.
Metal iyonları bir dokudaki enzimi aktive ederken diğer dokudakini inhibe edebilmektedir. Spektor ve ark. (135) , yetişkin ve fötal insan karaciğer, eritrosit, böbrek, beyin ve gastrointestinal sistem dokularında metal iyonlarının etkisini araştırmışlar, Mn+2 > Co+2 > Mg+2 iyonlarının enzimi aktive ettiğini, Ca+2
iyonunun ise enzimi inhibe ettiğini bulmuşlardır. Koyun meme doku arginazı üzerine farklı metal iyonlarının etkisi araştırılmış, enzim en yüksek aktiviteyi Mn+2 metal iyonları varlığında göstermiştir. Cd+2 ve Ni +2 metal iyonlarının enzim aktivitesini Ca+2 ,Mg+2, Ba+2 ve Cu+2 iyonlarına göre daha fazla artırdığı, Hg+2 iyonlarının aktiviteyi değiştirmediği, Co+2, Zn+2, Ag+2 ,Sn+2 iyonlarının enzim aktivitesini inhibe ettiği, Pb+2 ve Cr+3 iyonları varlığında ise enzimin hiç aktivite göstermediği tespit edilmiştir (102). Sığır rumen doku arginazı üzerine farklı metal iyonlarının etkisi araştırılmış Mn+2 metal iyonu varlığında enzimin en yüksek aktiviteyi verdiği, Ni +2, Cd+2, Co+2, Li+1 iyonlarının ise enzim aktivitesini Mn+2’ a göre daha az artırdığı, K+1, Al+3, Mg+2, Ca+2, Ba+2 Fe+3, Cu+2, Cr+3 , Zn+2, Pb+2, Sn+2 iyonlarının varlığında enzim aktivitesinin azaldığı, Hg+2 ve Ag+2 varlığında ise enzimin hiç aktivite göstermediği tespit edilmiştir (41). İnsan tiroid arginaz aktivitesi üzerine bazı metal iyonlarının etkisi araştırılmış, enzimin en yüksek aktiviteyi Mn+2 metal iyonu varlığında verdiği Cd+2 ,Mg+2, Ca+2 , Ni +2, Co+2 metal iyonlarının enzim aktivitesini Mn+2 iyonlarına göre daha az aktive ettiği ve Hg+2, Ag+2 iyonları varlığında enzim aktivitesinin düştüğü görülmüştür (57). Koyun gözü vitreus arginaz aktivitesi üzerine yapılan çalışmada enzimin en yüksek aktiviteyi Mn+2 metal iyonu varlığında verdiği, Ni +2, Cd+2, Co+2, Mg+2, Ca+2, Ba+2, Hg+2, Fe+3, Cr+3, Cu+2, Sn+2, ve Ag+2 metal iyonlarının enzim aktivitesi düşürdüğü, Pb+2 metal iyonları varlığında ise enzimin hiç aktivite göstermediği tesbit edilmiştir (48). Fare makrofaj arginazı üzerine metal iyonlarının etkisi araştırılmış ve enzim aktivasyonunun metal iyonları tarafından sırasıyla Mn+2> Co+2> Ni +2> Zn+2> Fe+2> Na+1>K+1 şeklinde artırıldığı saptanmıştır (27). Sea molluse (Concholepas Concholepas) arginazı için Mn+2,
Co+2, Ni +2 iyonlarının gerekli olduğu bildirilmiştir (21). Yukarıda yapılmış olan çalışmalar bizim sonuçlarımızı teyit etmektedir.
L-aminoasitlerden L-ornitin ve L-lizinin koyun dalak doku arginaz aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi araştırılmış, L-ornitin 5 mM konsantrasyonda enzimi % 15, 10 mM konsantrasyonda % 27, 15 mM konsantrasyonda ise % 34 inhibisyona uğrattığı saptanmıştır. L-lizininde 5 mM konsantrasyonda enzimi %17, 10 mM konsantrasyonda % 28, 15 mM konsantrasyonda %36 oranında L- ornitine benzer bir şekilde inhibisyona uğrattığı tesbit edilmiştir. İnhibisyon tipini belirlemek için 15 mM L-ornitin ve L-lizin kullanılmış, veriler Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk grafikleri ile değerlendirilerek her iki amino asit için Km değeri 6 mM olarak bulunmuş ve bu amino asitlerin enzimi non-kompetetif inhibisyona uğrattığı gözlemlenmiştir. Farklı tür ve dokularda L-ornitin ve L- lizinin enzime yaptığı inhibisyon tipleri belirlenmeye çalışılmış ve değişik inhibisyon tipleri elde edilmiştir.
Rat beyin mitokondrisinde yapılan çalışmada 25 mM L-arginin kullanılarak L-ornitin ve L-lizinin enzimi 20 kat inhibe ettiği bildirilmiştir (33). M. expensa arginazı (106), laktasyondaki rat meme bezi arginazı (42), sıçan karaciğer arginazı (92), M. benedeni arginazı (107), Xenopus leavis karaciğer arginazı (111), sığır karaciğer arginazı (108,139), insan tiroid arginazı (57), Mus booduga arginazı (118), domuz karaciğer arginazı (133), Genypterus maculatus karaciğer arginazı (23), Sea molluse (Concholepas Concholepas) arginazı (21) üzerine L-ornitin ve L- lizin amino asitlerinin etkisi incelenmiş ve bu amino asitlerin enzimi kompetetif inhibisyona uğrattığı ortaya konmuştur.
Kaysen ve Strecker (63) böbrek dokusunda yüksek arginin konsantrasyonlarıyla enzim aktivasyonunun prolin ve lizin amino asitlerinin belirli konsantrasyonları ile engellenebildiğini belirtmişlerdir. Koyun beyin doku arginazı üzerine bazı L-amino asitlerden L-lizin, L-ornitin, L-valin ve L-lösinin kompetetif tipte inhibisyona neden olduğu bulunmuştur (122). Ornitin, lizin ve prolinin koyun karaciğer arginazı üzerinde kompetetif inhibisyona neden olduğu belirtilmiştir (65). L-ornitinin buzağı karaciğer arginazını (15) ve vitreus arginazını (48) kompetetif inhibisyona uğrattığı gözlemlenmiştir. İnsan karaciğer arginazı üzerinde ornitinin non-kompetetif, lizinin ise kompetetif inhibisyon etkisinin olduğu ortaya konmuştur (24).
Koyun karaciğer dokusunda 55 mM’ lık lizinin arginaz aktivitesini % 74 oranında inhibe ettiği ve inhibisyon tipinin karışık inhibisyon olduğu tesbit edilmiştir (10). Yine sığır böbrek doku arginazı üzerinde de L-ornitin ve L-lizin amino asitlerinin karışık tipte inhibisyona neden olduğu saptanmıştır (58). Ameen ve Palmer (3) lizinin karaciğer arginazını karışık tipte inhibisyona uğrattığını bildirmişlerdir.
Sığır rumen doku arginazı (41), koyun meme doku arginazı (102) ve insan tiroid doku arginazı üzerinde L-ornitin ve L-lizin amino asitlerinin non-kompetetif inhibisyona neden olduğu belirtilmiştir. Bulgularımız literatürler ile (41, 57,102) uyuşmaktadır.
Bond (16), non-kompetetif inhibisyona neden olan inhibitörlerin substrattan farklı bir noktada enzimle reversible olarak birleştiği ve ligantların muhtemelen enzim substrat kompleksinin turnover’ ını bozan konformasyonel
değişime sebep olduğu ve enzimin proteolitik inaktivasyona duyarlılığının arttığını bildirmiştir.
Koyun dalak doku arginaz aktivitesi üzerine guanidino bileşiklerinden olan L- kanavaninin etkisi araştırılmış ve L- kanavaninin enzim üzerinde non- kompetetif inhibisyona neden olduğu saptanmıştır. Kanavanin ile arginaz arasında yapısal benzerlik bulunduğundan bu bileşiğin enzimin aktif merkezi dışında bir yere bağlanıp enzimin üç boyutlu yapısını bozarak inhibisyona neden olduğu ileri sürülmüştür (41). Konu ile ilgili yapılmış çalışmalarda çeşitli sonuçlar elde edilmiştir. Saflaştırılmış insan karaciğer arginazı için substrat olarak L- arginin yerine L- kanavanin kullanılmış ve Km’ in 10.5 mM’ dan 50 mM’ a çıktığı tespit edilmiştir (14). Sığır rumen doku arginazını guanidino bileşiklerinin (41), saflaştırılmış eritrosit arginazını ise kanavaninin non-kompetetif inhibe ettiği saptanmıştır (54). Başka bir çalışmada da kanavaninin karaciğer arginaz enzimini kompetetif inhibe ettiği, buna karşın eritrosit ve uterus arginazlarını etkilemediği tespit edilmiş, kanavaninin arginin yerine substrat olarak kullanılamayacağı bildirilmiştir (49). Muszynska ve ark. (90) ise kanavanin kullanıldığında acı bakla ve sığır karaciğer arginaz aktivitelerini saptayamadıklarını, buna karşın tavuk karaciğerinde düşük düzeyde arginaz aktivitesi elde ettiklerini belirtmişlerdir.
Koyun dalak doku arginazı üzerine p-CMBA ve NEM’ in inhibisyon etkisi araştırılmış ve inhibisyon tipi belirlenmeye çalışılmıştır. p-CMBA ve NEM, enzimlerin aktif merkezinde –SH grubu içeren amino asitler olup olmadığını belirlemek için kullanılan kimyasal maddeler olup bu maddeler –SH gruplarını bloke ederek enzimin inhibisyonuna neden olmaktadır (41). 0.5 mM p-CMBA konsantrasyonunda enzim aktivitesinin % 17’ si, 1 mM’ da % 42’ si ve 2.5 mM’
da % 69’ u kaybolmaktadır. 20 mM NEM konsantrasyonunda ise enzim aktivitesinin % 36’ sı, 60 mM’ da % 62’ si, 100 mM’ da ise % 80’ inin azaldığı görülmüştür. Farklı L- arginin konsantrasyonlarında 2.5 mM p-CMBA ve 100 mM NEM varlığında bu maddelerin enzime olan inhibisyon etkileri araştırılmış, her iki kimyasal maddenin de enzimi non-kompetetif inhibisyona uğrattığı görülmüştür. Bu sonuca göre koyun dalak doku arginaz enziminin aktif merkezinde fonksiyonel –SH gruplarının var olduğu ve katalitik faaliyetin başlaması için –SH gruplarının gerekli olduğu kanıtlanmış olmaktadır. Konuyla ilgili farklı çalışmalar yapılmıştır. p-CMBA ve NEM’ in rat karaciğer arginazını etkilemediği (12), insan karaciğer, uterus ve eritrositi üzerinde p-CMBA’ in herhangi bir inhibisyon etki göstermediği (49), NEM’ in ise sığır karaciğer arginazı üzerinde inhibisyona neden olmadığı saptanmıştır (141).
M. Benedeni arginazı (104), acı bakla arginazı ile tavuk karaciğer arginazı (90) ve koyun gözü vitreusu arginazı (48) üzerine p-CMBA ve NEM’ in inhibisyon etkisi tesbit edilmiştir. İnsan tiroid arginazı (57), koyun meme doku arginazı (102) ve sığır rumen doku arginazı (41) üzerinde p-CMBA ve NEM’ in non-kompetetif inhibisyona yol açtığı bildirilmiş ve bu sonuçlar bizim bulgularımızla paralellik göstermiştir.
EDTA’ nın koyun dalak doku arginaz aktivitesi üzerine inhibisyon etkisi araştırılmış, 0.2 mM EDTA varlığında enzim aktivitesinin % 16’ sı, 0.4 mM’ da % 43’ ü, 0.6 mM’ da ise % 79’ u kaybolmuştur. 0.8 mM EDTA varlığında ise enzim aktivitesinin hepsini kaybetmiştir. 0.6 mM EDTA kullanarak inhibisyon tipi belirlenmeye çalışılmış, veriler Michaelis-Menten ve Lineweaver-Burk eğrisi ile değerlendirilmiş ve EDTA’ nın koyun dalak doku arginazını kompetetif
inhibisyona uğrattığı tespit edilmiştir. Kontrolün Km’ i 6 mM iken EDTA varlığında Km değeri 11 mM olarak saptanmıştır. Koyun meme doku arginaz aktivitesi üzerine yapılan bir çalışmada enzim aktivitesi üzerinde 0.5 mM EDTA’ nın % 44, 1 mM EDTA’ nın ise % 80 civarında inhibisyona neden olduğu ve bizim bulgularımızla paralel olarak EDTA’ nın koyun meme doku arginazını kompetetif inhibisyona uğrattığı açıklanmıştır (102). Yapılan bir çalışmada EDTA’ nın rat karaciğer arginazını inhibe ettiği bildirilmiştir (51). Genç koyun yemlerine Ca+2-EDTA-Cu+2 kompleksi katıldığında ilk 24 saatte arginaz aktivitesinin arttığı, sonra ise düştüğü görülmüştür (56). İnsan karaciğer arginazı farklı pH’ larda EDTA ile reaksiyona sokulduğunda enzim aktivitesinde sürekli azalma olduğu ortaya konulmuştur (71).
Koyun dalak doku arginaz aktivitesi üzerine metilen mavisinin fotoinaktivasyon etkisini incelemek için enzim kaynağı 150 watt ışık altında, değişik metilen mavisi konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır. 0.3 mM metilen mavisi varlığında enzim aktivitesinde %72, 0.6mM konsantrasyonda ise % 85’ lik bir azalma tesbit edilmiştir. İnhibisyon tipini belirlemek için 0.3 mM metilen mavisi varlığında enzim aktivitesi incelenmiş ve metilen mavisinin enzimi non- kompetetif inhibisyona uğrattığı saptanmıştır. Çalışmamızla paralel olarak koyun meme doku arginazı (102), M Benedeni arginazı (103), manda karaciğer ve böbrek doku arginazı (105) ve insan tükürük arginazının da (98) metilen mavisi tarafından non-kompetetif inhibisyona uğratıldığı belirtilmiştir. Metilen mavisinin inhibisyon etkisi farklı ortamlarda incelenmiş, oda ışığında aktivitenin % 66’ sının, karanlıkta % 60’ ının ve 150 watt ışık altında ise % 72’ sinin kaybolduğu
görülmüştür. Koyun dalak doku arginaz enzimini 150 watt ışık altında ve metilen mavisi ile birlikte daha güçlü inhibisyona uğrattığı saptanmıştır.
Fotoinaktivasyon, enzimdeki histidil artıklarının imidazol gruplarının parçalanmasıyla oluşmaktadır. Çeşitli dokularda arginaz enziminin histidil artıklarının imidazol gruplarına Mn+2 katyonlarının bağlanması ile enzimin tetramerik yapıya geçtiği belirtilmektedir. 150 watt ışık ve metilen mavisi varlığında enzim histidil artığının imidazol gruplarının parçalanması ile Mn+2 katyonlarının tetramerik yapıyı oluşturamadığı ve bu nedenle fotoinaktivasyonun meydana geldiği bildirilmiştir (97, 98, 102,103,105).
Koyun dalak doku arginaz enzimine farklı ortamlarda iki preinkübasyon uygulanmış, oda ışığında I. preinkübasyona sadece MnCl2 konularak yapılan çalışma kontrol kabul edilmiş ve diğer çalışmalar bununla kıyaslanmıştır. Bu çalışma sonucunda en az aktivite kaybının Mn+2 ile preinkübasyona sokulduktan sonra metilen mavisi uygulanan grupta olduğu gözlemlenmiştir. Mn+2 katyonları enzimi oligomerik yapıya kavuşturduktan sonra histidil artıklarının yıkımı ve oligomerik yapının değişimi ancak belli miktarda etkilenmektedir. Bu yüzden en az aktivite kaybı bu grupta olmuştur.
Koyun dalak doku arginaz enziminin hücre içi yerleşimini saptamak için enzim kaynağı değişik santrifügasyon işlemine tabii tutulmuştur. Değişik santrifügasyon işlemleri sonucunda koyun dalak doku arginazının % 50’ ye varan bir bölümünün hücre çekirdeğinde, diğer % 50’ lik kısmınında sitoplazmada lokalize olduğu saptanmıştır (Tablo 4). 600x g’ de santrifüj edilen enzim kaynağının peleti hücre çekirdeğini içermektedir ve toplam aktivitesin yaklaşık yarısı bu pelette elde edilmiştir. 100000x g’ nin süpernatantında da toplam
aktivitenin yarısına yakın bir kısmı bulunmuştur ve bu süpernatant sitoplazmayı içermektedir.
Enzimin hücre çekirdeğine bağlı olmasının metabolik denetim açısından önemi Moss (86) tarafından belirtilmektedir. Buna göre enzimin hücre çekirdeğinde bulunması Mn+2 iyonlarının daha çok hücre çekirdeğinde bulunması ve bunların çekirdekten sitoplazmaya geçişleri ile arginaz aktive edilirken arginin düzeylerinin değişim göstermesine, bunun sonucunda da protein sentezinin denetim altına alınmasına bağlanmıştır .
Domuz yavrularının ince bağırsağında yapılan çalışmada arginaz izoenzimlerinin hem mitokondriye hem de sitoplazmaya yerleşik olduğu bulunmuştur (31). Yine rat böbreğinde arginin metabolizmasında rol oynayan enzimlerin böbreğin iç korteks ve dış medulla kısmında (32), Geypterus maculatus karaciğer arginazının ise mitokondrial matrixte lokalize olduğu bildirilmiştir (23).
Koyun meme doku arginazı (102) ve M. benedeni arginazının da (107) hücrenin çekirdeğine lokalize olduğu belirtilmiş ve bu sonuçlar bulgularımızı desteklemiştir.
Bugüne kadar koyun dalak doku arginaz enziminin kinetik özellikleri ile ilgili bir çalışmanın yapılmadığı literatür taramalarından anlaşılmaktadır. Bu nedenle aktif üre döngüsü bulunmayan koyun dalak dokusunda arginaz enzimi saptanmış ve bu enzimin bazı kinetik özellikleri ilk kez laboratuarımızda optimize edilmiştir. Elde edilen verilerin bu konu ile ilgili yapılacak araştırmalara ışık tutacağı kanaatindeyiz.