Camundongos C57BL/6 (n = cinco por grupo) foram utilizados para o teste das terapêuticas em estudo, tendo sido realizados três experimentos independentes. O modelo murino de colite ulcerativa foi reproduzido através da administração de dextrana sulfato de sódio (DSS) (peso molecular de 36-50 kDa, MP Biomedicals) dissolvida na água de beber dos animais na concentração final de 3% (p/v) durante sete dias consecutivos, tendo sido o consumo de líquido monitorado diariamente para certificar que os grupos consumiram quantidades equivalentes de água. Neste período, o desenvolvimento da colite experimental foi monitorado através da constatação da perda de peso corporal, da presença de sangue nas fezes dos animais, bem como da consistência das fezes. Esses parâmetros foram utilizados para determinar o índice de atividade da doença (IAD), que varia entre 0 a 4, sendo resultado da soma dos escores atribuídos a cada um dos três parâmetros (Tabela 1) dividido pelo número de parâmetros (três) (CAMUESCO et al., 2004).
Tabela 1 – Escores atribuídos à perda de peso corporal, presença de sangue nas fezes e consistência das fezes para determinação do índice de atividade da doença (IAD).
Índice Perda de Peso Corporal (%) Sangue nas Fezes Consistência das fezes
0 0 – 2 Ausente Bem formadas
1 > 2 – 5 - -
2 > 5 – 10 Sangue visível Amolecidas
3 > 10 – 15 - -
4 > 15 – 20 Sangramento intenso Diarreia
Às características de sangue nas fezes ou consistência das fezes são atribuídos apenas os escores ou índices 0, 2 e 4, não existindo, portanto escores 1 ou γ para as mesmas, o que é representado na tabela por “-”.
Os animais foram randomicamente distribuídos entre os grupos conforme demonstrado na Tabela 2. Os grupos destinados ao tratamento com o E. faecium 32 receberam a cepa probiótica pela via oral durante os sete dias que antecederam a indução da colite experimental e também durante os sete dias da disponibilização da DSS 3% na água de beber. A administração do potencial probiótico em período anterior à indução da colite ulcerativa foi realizada com o objetivo de que o mesmo se estabelecesse em quantidades adequadas no trato gastrintestinal e assim pudesse exercer os seus efeitos (FUJIMOTO et al., 2008; FUJIWARA et al., 2001; JOHANSSON et al., 1998; PIMENTEL et al., 2012; TUOHY et al., 2007). Ela foi realizada pela via oral com um auxílio de uma agulha de gavagem previamente esterilizada, sendo administrada uma concentração de 1,5 × 109 UFC/ml num volume final de 200 µl. Os animais dos demais grupos receberam o mesmo volume de solução salina 0,9% estéril (veículo) como controle. Já os grupos destinados ao tratamento com o extrato metanólico de C. mexicana receberam-no na dose de 2,0 mg/kg pela rota intravenosa em dias alternados, iniciando a administração com o início da indução da colite experimental (oitavo dia), de acordo com estudo prévio de Bittencourt (2011). Da mesma forma, os animais dos demais grupos receberam solução salina 0,9% estéril (veículo) pela mesma via de inoculação como controle. Finalizado o período de disponibilização da água contendo DSS 3%, os animais passaram a receber água de beber sem o irritante químico, e no dia seguinte (décimo sexto dia) os camundongos foram eutanasiados por deslocamento cervical (Figura 1). O cólon foi removido e mensurado; após mensuração, o excesso de fezes foi retirado com auxílio de uma pinça, o cólon foi aberto longitudinalmente e dele foram extraídos fragmentos, os quais foram exaustivamente lavados com meio de cultura para retirada das fezes residuais. Cinco milímetros do segmento colônico proximal foram imediatamente fixados em uma solução de formaldeído a 10% em PBS para posterior análise histológica; fragmentos de mesmas dimensões do segmento colônico transverso foram utilizados para cultura e posterior dosagem de citocinas.
Tabela 2 – Distribuição dos grupos de acordo com os tratamentos no modelo de colite ulcerativa. Grupos Tratamentos recebidos pelos grupos
Tratamento oral Tratamento intravenoso Água de beber
Grupo 1 Veículo Veículo Normal
Grupo 2 Ef32 (109 UFC/ml) Veículo Normal
Grupo 3 Veículo Veículo DSS 3%
Grupo 4 Ef32 (109 UFC/ml) Veículo DSS 3%
Grupo 5 Veículo E.M. DSS 3%
Grupo 6 Ef32 (109 UFC/ml) E.M. DSS 3%
Após a retirada do fragmento do segmento do cólon transverso, o mesmo sofreu lavagens sucessivas com meio de cultura para células (RPMI-1640, Gibco), suplementado com 2% de soro bovino fetal e gentamicina, para a retirada do material fecal. Posteriormente o tecido foi depositado em placa de 24 poços contendo meio de cultura RPMI (Gibco) suplementado com 10% de soro bovino fetal e gentamicina. A placa foi incubada por 24 horas em estufa umidificada contendo 5% de CO2 a 37ºC (BITENCOURT, 2011). Após a incubação, os sobrenadantes foram colhidos e congelados para posterior dosagem dos níveis das citocinas IFN- , IL-4, IL-6, IL-12, IL-17A e TNF-α por meio de kits de enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) (eBioscience e R&D Systems) de acordo com recomendações
do fabricante.
3.4.1 Cultura do cólon 3.4.1 Análise microscópica
Para a análise microscópica dos espécimes, os fragmentos proximais do cólon logo após a sua retirada foram dispostos em forma de espiral como descrito por Whittem, Williams e Williams (2010) e fixados em uma solução de formaldeído a 10% em PBS. O material fixado foi então embebido por parafina e os blocos foram seccionados em cortes de 5 µm de espessura, os quais foram corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina (HE), tendo sido posteriormente examinados à microscopia de luz por um patologista que desconhecia a distribuição dos grupos entre as amostras dos animais.
O estudo compreendeu um período de dezesseis dias. Os animais receberam inicialmente um pré-tratamento com a cepa probiótica E. faecium γβ pela via oral (●) durante um período de sete dias (do primeiro ao sétimo dia), após o qual deu-se início à indução da colite ulcerativa experimental (oitavo dia) pela administração de DSS 3% na água de beber dos animais. Neste mesmo período, o probiótico foi mantido (●) e foi iniciado o tratamento com o extrato metanólico da C. mexicana pela rota intravenosa em dias alternados (○). Como controle, os animais dos demais grupos receberam veículo (solução salina 0,9% estéril) pelas mesmas vias (oral e intravenosa). No 15º dia (○), tanto a DSS 3% quanto os tratamentos (probiótico e extrato) foram suspensos, e no 16º dia os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical (♦). DSS, dextrana sulfato de sódio.
Figura 1 – Desenho experimental do estudo indicando a distribuição temporal dos tratamentos utilizados e período da indução da colite.
DSS na água de beber
O estudo morfológico baseou-se na determinação de escores para as características das lesões, quando presentes. Assim, as amostras do cólon foram classificadas como normal (escore 0), presença de lesão leve (escore 1), lesão moderada (escore 2) ou severa (escore 3). As amostras consideradas normais exibiam a morfologia preservada. As lesões leves eram pequenas e focais ou largamente separadas das áreas multifocais de inflamação e/ou fibrose limitada à lâmina própria. As lesões moderadas exibiam ou áreas multifocais ou localmente extensas de inflamação ou fibrose se estendendo até a submucosa. As lesões severas exibiam áreas de ulceração (maiores que 1 mm). As úlceras são caracterizadas pela perda do revestimento, sendo recobertas por uma membrana fibrino- purulenta (MAHLER et al., 1998).