Cryptosporidium sp. bugün dünyada tüm su kaynaklarında varlığı
tespit edilen, insan ve hayvanlarda cryptosporidiosis denilen enfeksiyonu oluşturan, zooanthroponotic (hayvanlardan insanlara- insanlardan hayvanlara bulaşan) özellikte bir protozoondur. Dünyada ölümle sonuçlanan birçok cryptosporidiosis vakası rapor edilmiştir. Ülkelerin gelişmişlik düzeyleri, hijyen alışkanlıkları, bağışıklık sistemi, kalabalık ortamlarda yaşam, hayvanlarla yakın temas, sıcak ve nemli iklim koşulları gibi faktörler Cryptosporidium türlerinin yaygınlığını etkilemektedir (25, 56).
Cryptosporidiosis’i yaratan dozun 30 ookist/L olduğu, hatta bir organizmanın bile enfeksiyonu başlatabildiği bildirilmektedir(57,58). Ookistlerin canlılığını belirlemek üzere hayvan testleri (30), in vitro testler (34, 59) veya her iki testin bir arada yapıldığı (29, 32, 33, 35, 60) çok sayıda çalışma mevcuttur. İnvitro testlerin hayvanlar üzerinde yapılan testlere kıyasla birçok avantajı bulunmaktadır: Sonuçlar kısa sürede alınmaktadır, ucuza mal olmaktadır ve uygulanması kolaydır. Cryptosporidium ookistlerinin canlılığının ve enfektivitesinin belirlenmesi iki ayrı yöntem ile yapılmaktadır. Canlılık testleri DAPI/PI veya SYTO-9 veya SYTO-59 gibi vital boyalarla yapılırsa canlı ookistler kırmızı renkteki Pl veya SYTO boyalarını çeperleri sağlam olduğu için absorbe edemezler (dye exclusion). Buna karşılık ölü ookistlerin çeperinden kolaylıkla içeri giren bu boyalar onların mikroskopta kırmızı renkte yapılar olarak görünmesini sağlar. DAPI canlı ookistin DNA sarmalına tutunarak mikroskopta mavi renkte görünmesini sağlamaktadır. SYTO-59 boyamada canlı ookist boya almaz ve Texas red filtre altında yeşil renkte görünür.
Bu çalışmada iki ayrı vital boya yöntemi ve in vitro ekskistasyon tekniği uygulanarak gama ışınlamaya tabi tutulan Cryptosporidium ookistlerinin canlılığı ve enfektivitesi araştırılmıştır. Çalışmamız sırasında DAPI ve Pl boyamalarda Campbell ve ark. (32) tarafından
belirtilen oluşumları görmek ve değerlendirmek mümkün olmuştur. Aynı araştırıcılar iyi bir boyama ile uzman bir gözün canlı ookist içindeki sporozoitleri belirleyebileceğini belirtmektedirler. Sadece boyama ile can1111k/enfektivite hesaplamanın yanlış sonuç vereceği, enfektivite için hayvan denemelerinin ya da in vitro ekskistasyon denemelerinin yapılmasının daha uygun olduğu bildirilmektedir (29,60). Bu çalışmanın sonuçları in vitro ekskistasyon denemeleri yapılması görüşünü doğrular nitelikte olmuştur. Çalışmamızda ayrıca SYTO-59 boyamanın daha kolay olduğu ve daha dengeli sonuçlar verdiği görülmüştür.
Cryptosporidiosis enfeksiyonu taşıyan insan ve hayvanlar sürekli ve çok sayıda ookisti çevreye bırakmaktadırlar. Bu ookistler çok dirençli olup nemli çevrelerde bir yıl kadar canlı kalmakta, bilinen dezenfektanlarla (klor, amonyak, formaldehit vb.) yok edilememektedir. Suların bu çok küçük boyutlu (3-6 pm) ookistlerden arıtılması zor olmaktadır. Klorlu dezenfektanlara dirençli olan ookistler koagulasyon/filtrasyon prosesi uygulanan sularda bile görülmektedir (38). Ozon ve ultraviyole (UV) ışınlama dışında Cryptosporidium ookistlerini %90’ın üzerinde inaktive edecek bir dezenfeksiyon sistemi bulunmamaktadır (4, 57, 61). Ultraviyole ve ozon uygulamalarının da kendilerine göre dezavantajları bulunmaktadır (17). Alternatif yöntemlerden biri de gama ışınlamadır ve gama radyasyonun Cryptosporidium
ookistlerini inaktif hale getirdiği birçok çalışma ile ortaya konmuştur (37, 43, 45, 46, 62).
Sularda Cryptosporidium söz konusu olunca sadece dezenfeksiyon yöntemini belirlemek yeterli olmamaktadır. Dezenfeksiyon işlemlerini izleyerek parazitin inaktif hale geçtiğinden emin olmak gerekmektedir. Çünkü Cryptosporidium protozoalar arasında oto- enfektif özellik taşıyan tek parazittir. Az sayıda alınan canlı ookist birçok canlı ookistin atılımı ile sonuçlanmaktadır (44).
Bu araştırma ile sularda Cryptosporidium ookistlerini inaktif hale getiren gama radyasyon dozu belirlendi. Gama ışınlama dozunun etkisini belirlemek üzere ookistlerin canlılık ve enfektiviteleri incelendi. Bu amaçla iki ayrı vital boyama sistemi (DAPI/PI ve SYTO-59) ve invitro ekskistasyon testi kullanıldı. Ayrıca Ankara Merkezi Atıksu Arıtma Tesisi’nde arıtılarak Ankara Çayı’na verilen
atıksu örnekleri ışınlanarak Cryptosporidium ookistlerinin canlılık ve enfektiviyeleri belirlendi. Araştırmamız sırasında sürekli olarak taze ookist izolatları kullanıldı. Canlılık ve enfektivite testleri ışınlamanın 10. gününde gama ışınlamanın etkisinin devamlılığını incelemek üzere tekrarlandı.
Laboratuvara getirilen örneklerde Cryptosporidium ookistlerinin teşhisi amacıyla üç ayrı yöntem denendi ve Safranin-Metilen Mavisi ile Fenol-Auramin testlerinin hassas ve doğru olduğu anlaşıldı. Sonuçların yapılan diğer çalışmalarla uyumlu olduğu görüldü (13, 23, 24, 63).
Sularda ookistler en yüksek gama ışınlama dozu olan 20 kGy hariç tüm gama ışınlama dozlarında açılım (ekskistasyon) gösterdiler. Işınlanmamış (kontrol) örneklerde açılım yaklaşık %90 oldu ve doz yükseldikçe azalma gösterdi. Işınlamayı izleyen 10. günde sonuçlarda önemli bir değişiklik görülmedi. Kontrol örneklerde 10. günde açılım oranı artarken ışınlanmış örneklerde düşme görüldü. 15 kGy dozda sadece %3.5 oranında açılım gözlendi. 10. günde bu oran %2’ye düştü. 20 kGy dozda serbest sporozoit ve boş ookist görülmedi.
Boyama sonuçları 15 kGy dozda canlı ookist bulunmadığını gösterdi. Işınlanmamış örneklerde ise ookistlerin yüksek oranda canlı olduğu ve DAPI boyasını aldıkları belirlendi. Doz ile doğru orantılı olarak canlılık oranı düştükçe kırmızı renkli Pl ve SYTO-59 boyalarına karşı permeabilitenin arttığı gözlendi. Kato ve ark. (47) 2000 krad (20 kGy) dozda ekskistasyonun olduğunu fakat ookist permeabilitesinin arttığını (PI+), dolayısıyla ookistlerin ve açığa çıkan sporozoitlerin canlı olmadıklarını, açılım olmasına rağmen ookistlerin enfektivitelerini kaybettiklerini öne sürmektedir. Bizim çalışmamızda da bulgular benzer şekilde olmuştur. Ookist dışına çıkabilen sporozoitlerin DNA’ları gama ışınlamadan zarar gördükleri için enfektivitelerini yitirdikleri, ookist içinde ölenlerin de Pl permeabilitesini arttırdığı belirtilmektedir (45). Bu çalışmada alınan sonuçlar bu savı kanıtlar nitelikte olmuştur. Işınlamanın 10. gününde yapılan boyamalarda canlılık oranının değişmediği görülmüştür. Bu durum ışınlamanın etkisinin devamlı olduğunu göstermektedir.
Atıksularda 10 kGy dozdaki ookistler DAPI boyasını almadılar. Atıksularda ışınlanmayan örneklerde DAPI boyası ile %72.8, SYTO-59 boyası ile %85.2 canlılık tespit edildi. Dozla orantılı olarak azalan canlılık 10 kGy dozda tamamen kayboldu. 10 kGy dozda %1 oranında görülen ekskistasyon sonucu ortaya çıkan sporozoitlerin enfektivitesini yitirdiği anlaşıldı. Işınlamanın 10. gününde yarı açılmış, boş ookist ya da serbest sporozoitlere rastlanmadı. 10 kGy dozda tüm ookistlerin Pl(+) ve SYTO-59(+) olduğu ve ölen ookistlerin kümeler halinde biriktikleri görüldü.
Ekskistasyonun en yüksek düzeye ulaşması için ookistlerin asit içeren ortamda bekletilmeleri gerektiği bildirilmektedir (32,47). Atıksularda bulunan ookistlerin arıtma sırasında asit pH değerindeki işlemlere maruz kalmalarının dirençlerini kırdığı belirtilmektedir (32). Çalışmamızda elde edilen bulgular bu hipotezleri destekler nitelikte olmuştur. Thompson ve ark. (37) benzer şekilde 10 kGy gama ışınlama dozunun Cryptosporidium parvum ookistlerinde 2 log-ıo ünite inaktivasyon sağladığını bildirmektedirler. Son yıllarda yapılan çalışmalarda 10 kGy gama ışınlamayı izleyen 96. saatte sporozoitlerin yapısının tamamen hasar gördüğü belirlenmiştir (45). İnsan ileosekal adenokarsinom hücreleri (HCT-8) kültüründe yapılan enfektivite çalışmalarında 10 kGy gama ışınlama dozunun >2log ıo azalma sağladığı, 72 saat sonra DNA sarmalındaki kırılmaların onarıldığı fakat kaybolan enfektivitenin geri gelmediği bildirilmektedir (46, 62).
Çalışmada canlılığı belirlemek için kullanılan DAPI/PI ve SYTO-59 florojenik boyalar ookistlerin ışınlama dozu arttıkça canlılıklarını yitirdiklerini belirgin bir şekilde ortaya koymuştur. Campbell ve ark. (32) DAPI ve Pl boyalarının C.parvum ookistlerinin canlılığını belirlemekte güvenilir bir indikatör olduğunu bildirmektedir. SYTO-9 ve SYTO-59 boyaları ile yapılan çalışmalarda boyamanın hayvan inokülasyon denemeleri ile aynı sonuçları verdiği (35), ozon ve klor bileşikleri ile yapılan dezenfeksiyon sonrasında ookistlerin canlılığı konusunda benzer sonuçlar alındığı belirtilmektedir (34). Çalışmamızın sonuçları bu bilgileri doğrular nitelikte olmuştur. Sonuç olarak, 15 kGy ve üstündeki gama ışınlama dozu
Cryptosporidium spp. ookistlerinin ekskistasyon oranında azalmaya
yitirmektedir. DAPI/PI ve SYTO-59 gibi vital boyalar ile ookistlerin canlılığını belirlemek mümkün olmaktadır. Bu yöntemle herhangi bir dezenfeksiyon yöntemi sonrasında Cryptosporidium spp.
ookistlerinin canlı olup olmadığı kolaylıkla, kısa sürede ve ucuz bir şekilde belirlenebilir. Metodun tek dezavantajı mikroskop bakılarında sayım ve değerlendirme için tecrübeli bir göze gerek duyulmasıdır.