Tarihsel Gelişimi

Aos 10 dias nenhuma das culturas de hPDLFs exibiram áreas coradas por vermelho de Alizarina. Entretanto, essas marcações foram observadas aos 14 dias, as quais eram mais extensas nas culturas que continham as partículas de vidro bioativo. Através da análise microscópica, observou-se o início da formação de nódulos mineralizados independentes das partículas (Figura 14). A análise quantitativa revelou maior formação de matriz calcificada nos grupos com partículas de vidro bioativo aos 10 e 14 dias. Aos 10 dias esses resultados (2D+VB e 3D+VB) foram significativamente maiores que no controle (p<0,05), em 2D (p<0,05) e em 3D

(p<0,05); e aos 14 dias foram siginificativamente maiores que no controle (p<0,05) e

em 2D (p<0,05) (Figura 15). * * * * *

OC

Figura 14. Aspectos microscópicos de culturas hPDLs nos diferentes arcabouços, coradas por vermelho de Alizarina, em 14 dias. A-a (Controle); B-b (2D); C-c (2D+VB); D-d (3D); E-e (3D+VB). Letras minúsculas representam a escala de 200 µm e maiúsculas 100 µm.

Figura 15. Formação de matriz calcificada (média ± desvio padrão) em culturas de células hPDLF nos diferentes grupos em 10 e 14 dias. * indica diferença estatisticamente significante (p<0,05) na

análise comparativa (pós-teste de Dunn) após o teste Kruskal-Wallis.

5.2. Discussão

Os resultados desse estudo mostraram que as células do ligamento periodontal são capazes de expressar o fenótipo osteoblástico - as condições de culturas colágenas tridimensionais e partículas de vidro bioativo suportaram a viabilidade celular e contribuíram para a expressão do fenótipo osteoblástico de hPDLF, uma vez que favoreceram a atividade de ALP, formação de nódulos mineralizados e expressão gênica realcionada a esse fenótipo.

A viabilidade dos hPDLF cultivados em superfícies colágenas 2D e em géis colágenos 3D com e sem partículas de VB apresentou um índice crescente nos períodos avaliados, mostrando um índice proliferativo normal para todos os grupos. Apesar de não terem sido encontradas diferenças significantes entre os grupos aos 7 e 10 dias, as células semeadas em 3D apresentaram maiores índices de viabilidade nesses períodos. Esses resultados estão de acordo com outro estudo que demonstrou maior viabilidade celular em culturas tridimensionais quando comparada com culturas bidimensionais (Cukierman et al., 2001).

Análises morfológicas por microscopia de fluorescência mostraram que as células cultivadas nas superfícies controle, 2D e 2D+VB apresentaram o mesmo padrão de espraiamento e imunomarcações para ALP e OPN (observadas apenas aos 14 dias), sugerindo que as partículas de VB e seus produtos de dissolução iônica não exerceram influência nesses processos. A análise por microscopia

confocal mostrou que as células estavam aderidas nas superfícies das partículas alterando a sua morfologia e discretas imunomarcações intracelulares para ALP e OPN foram observadas aos 7 e 14 dias apenas nas células em 3D. Apesar de essas marcações sugerirem a presença do fenótipo osteoblástico, a sua importância biológica é ainda desconhecida.

De acordo com a literatura, fibroblastos do ligamento periodontal devem apresentar atividade de ALP (Somerman et al., 1988; Arceo et al., 1991; Pi et al.,

2007). No presente estudo os níveis da atividade de ALP foram significantemente maiores nas culturas 2D e 2D+VB comparadas com 3D e 3D+VB (p<0,05) aos 7

dias. Entretanto, aos 14 dias foi observado que as células semeadas em 3D e 3D+VB produziram níveis de atividade ALP significantemente maiores que o controle (p<0,05). Uma possível explicação seria que a matriz tridimensional aos 7 dias ainda

estaria intacta e estável, o que poderia ter ocasionado um atraso na atividade de fosfatase alcalina neste estágio inicial. Aos 14 dias observa-se uma contração e degradação da matriz colágena produzida pela atividade e produtos celulares, o que pode ter permitido essa maior atividade de fosfatase alcalina em um estágio mais tardio. A contração do colágeno dentro dos poços em um período mais tardio mostra-se consistente com outros estudos (Velazquez et al., 2002; Neeley et al.,

2010).

Nossos resultados demonstraram que o conteúdo de cálcio foi favorecido pela presença do VB, o qual foi maior nas culturas que continham as partículas (2D+VB e 3D+VB) tanto aos 10 quanto aos 14 dias. Interessantemente, não foi observada nenhuma relação de proximidade entre os nódulos mineralizados e as partículas de VB o que sugere que os produtos iônicos gerados pelo VB é que exerceram um papel importante no processo de formação de matriz mineralizada. Essas observações estão de acordo com outros autores (Hench; Paschall, 1974; Kubo et al., 1995; Kubo et al., 1997).

Ainda de acordo com os resultados de mineralização, as culturas tridimensionais (3D e 3D+VB) apresentaram os maiores níveis de PRT aos 7 dias, gene ao qual tem disso atribuído um papel específico na formação do tecido mineralizado (Horiuchi et al.,

1999). As partículas de VB também contribuíram para a expressão gênica de ALP e COL I em culturas bidimensionais (2D+VB), em concordância com outros estudos (Xynos et al., 2001; Foppiano et al., 2007; Varanasi et al., 2009) que demonstraram que

marcadores osteogênicos, contudo isto não foi observado nas culturas 3D+VB em ambos os períodos avaliados. Além disso, as partículas de VB não favoreceram a expressão de FBM e S100A4 – marcadores de um fenótipo fibroblástico. Também não foram observadas maiores expressões de RUNX2, OPN e OC. Nas culturas tridimensionais aos 7 dias, notou-se um aumento siginificativo de PRT e RUNX2, genes mais relacionados a um fenótipo osteoblástico. Aos 14 dias, percebeu-se uma diminuição na expressão gênica de todas as proteínas, sendo que essa queda foi mais acentuada para PRT, OPN, RUNX2 e OC, apesar de ter sido observada a fomação de nódulos mineralizados neste período. Esses resultados demonstram que essa expressão mais precoce dos genes relacionados a mineralização parece ter acontecido e permitiram a mineralização nos períodos mais tardios. Resultados diferem de outros estudos com osteoblastos de calvária de ratos, células da medula óssea, linhagem de células MC3T3-E1 e células do ligamento periodontal (Choi et al., 1996; Choi et al.,

2011) os quais relataram que a expressão de OC foi mantida uma vez que os nódulos de mineralização iniciaram sua formação. Acredita-se na hipótese que a diminuição da expressão de OC aos 14 dias esteja relacionada a apoptose durante a diferenciação celular. Estudos têm mostrado a ocorrência de apoptose quando a mineralização avança (Lynch et al., 1998). Quando células do ligamento periodontal foram cultivadas

em meio suplementado com ácido ascórbico, β-glicerofosfato e dexametasona, os níveis de expressão de OC, OPN e BSP foram maximizados aos 14 dias e caíram aos 21 dias (Iwata et al., 2010).

A heterogeneidade na expressão de RNAm e as limitações dos dados quantificáveis obtidos pela utilização do método altamente sensível RT-PCR deve ser

levado em consideração. No entanto, alguns estudos que mostraram a expressão desses genes por RT-PCR não detectou qualquer expressão de RNAm para OPN, OC

e ALP por Northern blot (Nohutcu et al., 1997; Parkar et al., 1999; Ivanovski et al., 2001;

Pi et al., 2007). Isto pode ser atribuído aos baixos níveis de expressão de RNAm para

estas proteínas em células do ligamento periodontal humano.

Futuros estudos são necessários para validar esses modelos de culturas. Há muito ainda a ser discutido sobre a capacidade de as células do ligamento periodontal em manter as suas características fenotípicas distintas na presença de partículas de vidro bioativo e em culturas tridimensionais in vitro, o que é importante

para o desenvolvimento um sistema no qual podemos estudar e manipular essas células contribuindo para bioengenharia na regeneração periodontal.