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Macrófagos são células abundantes na luz brônquica, tanto em indivíduos sadios quanto em asmáticos e liberam mediadores inflamatórios, como enzimas (lisozima, coalgenase, elastase), eicosanoides, além de fatores de crescimento. Os baixos níveis de IL-10 nos asmáticos permitem maior liberação de citocinas pró-inflamatórias, contribuindo para a

inflamação das vias aéreas e estabelecimento do quadro asmático clássico (CALHOUN et al., 1996). São responsáveis pela supressão da resposta proliferativa das células T (SPITERI et

al., 1994).

Monócitos e macrófagos são a principal fonte de IL-1, produzindo principalmente IL- 1 , enquanto os queratinócitos produzem IL-1α. Outros tipos celulares podem produzir IL-1, como células endoteliais, fibroblastos, miócitos, células de Langerhans e linfócitos B e T. Macrófagos infectados por vírus produzem grandes quantidades de IL-1 . A síntese de IL-1 pode ser induzida por TNF-α, IFN-α, e , LPS, vírus e antígenos (AREND, 1991), e pode induzir a secreção de muco, além de ser fundamental na ativação de linfócitos T, importante co-estimulador das células Th2. Na inflamação crônica, os macrófagos secretam IL-1, IL-8, IL-10, TNF-α e IFN- (LANE et al., 1994).

Com o objetivo de analisar o potencial imune das Fr Aq P e Fr Aq M, foram avaliadas suas capacidades de estímulo na produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-1 , IL-6 e TNF- α), e se o efeito encontrado na produção desses mediadores apresentaria relação dose- dependente.

A IL-6 não é produzida constitutivamente pelas células do organismo, mas apenas após alguma infecção viral ou estímulo de lipopolissacarídeos. É liberada a partir de tecido agredido por lesões diretas ou infecções, linfócitos T e precursores hematopoiéticos. A IL-6 está associada ao aumento de atividade de linfócitos T e aumento de produção de imunoglobulinas. Sua produção é induzida por IL-1, TNF-α e IL-3 e se mostra um potente agente sinérgico na ação, junto com IL-1, de controlar os primeiros passos da ativação de linfócitos T (VAN-SNICK, 1990).

A citocina TNF-α foi purificada, sequenciada e teve seu gene clonado em meados dos anos 80. Desde então, várias propriedades atribuídas a essa citocina têm sido demonstradas (EIGLER et al., 1997). É uma citocina multifuncional que possui funções centrais na inflamação aguda e crônica, na resposta antitumoral e nas infecções (PALLADINO et al., 2003). O TNF-α age no crescimento de fibroblastos (BEUTLER e CERAMI, 1989) e apresenta atividade citotóxica induzindo reativos intermediários do oxigênio, não somente em macrófagos e polimorfonucleares, mas também em células cancerígenas (ZIMMERMAN et

al., 1989). É quimiotático para neutrófilos (POSTELTHWAITE e SEYER, 1990) e ajuda na

proliferação e diferenciação de células B humanas, interferindo no processo de diferenciação e de proliferação celular. Também age sinergicamente com a interleucina-1 (IL-1) na ativação osteoclástica, associado à liberação da prostaglandina-E2 (VASSALLI, 1992).

Os níveis de TNF-α induzidos por LPS foram reduzidos, em todas as concentrações de ambas as Fr Aq, sem diferença estatística entre elas. Quando avaliadas isoladas, as Fr Aq, independente das concentrações, não demonstraram nenhuma alteração nos níveis de IL-1 em comparação ao meio, sem diferença estatística entre elas. Quando em associação ao LPS, as concentrações de 50 µg/mL de ambas as Fr Aq demonstraram diminuição estatisticamente significativa de IL-1 quando os níveis foram comparados aos de LPS isolado. Em relação a IL-6, não houve interferência em seus níveis para ambas as Fr Aq, independente da concentração e se em associação ou não ao LPS (Figura 32).

Macrófagos já foram estudados como alvo imunomodulatório de C. sympodialis em estudos anteriores, que demonstraram diminuição de NO e aumento de IL-10 em macrófagos infectados por T cruzi (ALEXANDRE-MOREIRA, FREIRE-DE-LIMA, et al., 2003). IL-1, IL-6 e TNF-α estão envolvidos em muitas doenças inflamatórias crônicas como a doença obstrutiva crônica, artrite reumatoide e asma (BARNES, 2001), por isso foram selecionados nesse estudo, mesmo sem haver relatos anteriores de sua pesquisa em ensaios envolvendo

Cissampelos sympodialis.

O equilíbrio entre mediadores pró e anti-inflamatórios é necessário para regular a resposta imunológica adequada contra um patógeno. Assim, a resposta pró-inflamatória é essencial para combater o patógeno, enquanto a anti-inflamatória limita e controla os danos para o próprio hospedeiro (GRUTZ, 2005).

A asma alérgica é associada com a resposta imunológica Th2 modulada por IL-4 e IL- 5, e ainda envolve a regulação por IL-10. O aumento de produção de IL-10 durante as respostas alérgicas pode servir para controlar a inflamação tecidual caracterizada pela infiltração de leucócitos (GERARD et al., 1993).

Resumindo os resultados encontrados, temos que em cultura de linfócitos não houve redução de sua viabilidade celular em nenhuma das Fr Aq avaliadas, independente das concentrações, sendo ainda observada que nenhuma delas interfere na fase resolutiva da inflamação, pois não acentuam a ocorrência de apoptose nem de necrose. Em relação às citocinas nesse tipo de cultura de células, não foi visualizada nenhuma alteração nos níveis das citocinas avaliadas, o que não significa que as Fr Aq não possuem indicativo de ação anti- inflamatória nos processos dependentes de linfócitos T, e somente a reprodução de todos os estudos em modelos murinos poderia demonstrar resultados diferentes daqueles aqui exibidos.

Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e analisados através do Software Graphpad Prism através de ANOVA e pós-teste de Tukey, onde p < 0,001 (***) foi significativo.

Em relação à cultura de macrófagos, não houve proliferação nem crescimento dos mesmos, independente da Fr Aq e concentrações avaliadas, sendo comprovada a diminuição dos níveis de NO, o que está relacionado à atividade anti-inflamatória. As citocinas

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Figura 32 Efeitos das frações aquosas dos extratos hidroalcoólicos das folhas de Cissampelos sympodialis com pior e melhor teor de warifteína, obtidos através de planejamento experimental (Fr Aq P e Fr Aq M) in vitro na liberação de citocinas de macrófagos.

pesquisadas nesse tipo de cultura de células foram alteradas de forma a diminuir os níveis de IL-1, na concentração de 50 µg/mL para ambas Fr Aq avaliadas, sem diferença estatística. E foi ainda observado, mais significativamente, diminuição de TNF-α, para ambas as Fr Aq, independente das concentrações e sem diferença estatística entre elas, corroborando a atividade anti-inflamatória das Fr Aq avaliadas, independente do tipo de da concentração.

O fato de não haver diferença estatística significativa entre Fr Aq e entre concentrações avaliadas, no que diz respeito aos indicativos de atividade anti-inflamatória contraria o esperado inicialmente, já que seria possível haver essa diferença já que os extratos hidroalcoólicos que originaram as Fr Aq foram obtidos sob diferentes sistemas de solventes e, consequentemente, diferentes condições de polaridade.

Os alcaloides são definidos como compostos básicos sintetizados por organismos vivos contendo um ou mais átomos de nitrogênio, em sua maioria derivados de aminoácidos. O nome da classe está diretamente relacionado ao seu caráter básico (do alemão, alkaloide) e constituem um grande grupo de metabólitos secundários, com mais de 12.000 substâncias isoladas. Uma enorme variedade de fórmulas estruturais, provenientes de diferentes vias biossintéticas apresentam diversas atividades farmacológicas (BRIELMANN et al., 2006). Como substâncias básicas, podem ser protonadas com a adição de ácido ao meio, permanecendo na fase aquosa, estratégia que vem sendo utilizada para extração desses compostos.

Neste trabalho, não foi utilizado o sistema aquoso acidificado para extração de alcaloides na etapa de otimização do processo extrativo, pois o objetivo inicial era avaliar tal parâmetro de acordo com os tipos de sistemas de solvente já utilizados na literatura bem como mimetizar a utilização popular através da infusão, que constitui um sistema aquoso. Sabendo que a utilização de sistemas ácidos para obtenção de extratos visando a sua utilização medicinal não é citada no Formulário de Fitoterápicos (BRASIL, 2011), através dos sistemas de solventes propostos no planejamento experimental, foi possível a obtenção de insumo ativo na forma de extrato ou sua fração aquosa seguros, sem toxicidade.

Dependendo do tipo de solvente utilizado na extração, diferentes quantidades e tipos de produtos podem ser obtidos. É a natureza química da substância a ser extraída que determina o tipo de solvente a ser utilizado, de baixa, média ou alta polaridade. O princípio geral utilizado é que o semelhante dissolve semelhante; portanto, o solvente não polar extrairá a substância não polar (MACIEL et al., 2002). Os solventes mais comuns utilizados no processo de extração, em ordem crescente de polaridade são: hexano, éter de petróleo, benzeno, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetato de etila, acetona, butanol, etanol,

metanol, água (FACCHIN e PASQUINI, 1998; ZUÑIGA et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2010).

O processo de extração pode ser seletivo para determinados metabólitos secundários, segundo (OLIVEIRA et al., 2010):

ALCALOIDES: existem nas formas básica/livre e na forma protonada/sais. Possui caráter anfótero, sendo a forma protonada solúvel em soluções aquosas, e a forma livre mais solúvel em sistemas menos polares.

ÓLEOS ESSENCIAIS: apolares

TANINOS: são solúveis em água, formando soluções coloidais e são solúveis em acetona e álcool.

HETEROSÍDEOS: sua polaridade é determinada pelo número e tipo de açúcar presente, bem como a estrutura da genina. Muitos heterosídeos podem ser extraídos com solventes polares, como acetona, etanol, metanol, água ou a mistura destes. As geninas livres são insolúveis em água, e solúveis em solventes orgânicos.

DERIVADOS ANTRACÊNICOS: são quinonas cíclicas com a presença de grupos fenólicos. Os heterosídeos antrauqinônicos são solúveis em água e em soluções hidroalcoólicas. As geninas livres são insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos.

FLAVONOIDES: os heterosídeos são solúveis em água e álcoois, sendo alguns menos solúveis em água. As geninas livres do açúcar são solúveis em solventes orgânicos, de baixa polaridade, como éter etílico, clorofórmio, diclorometano, acetato de etila e outros.

SAPONINAS: as saponinas esteroidais ou triterpênicas, devido ao grande número de átomos de carbono presentes em sua estrutura (C27 a C30), conferem propriedades lipofílicas à molécula.

CUMARINAS: são livres, solúveis em álcool e extraídas com solventes orgânicos,estacando- se o éter etílico. As formas heterosídicas são pouco solúveis em água, mas arrastadas pelo seu vapor em processos de destilação.

Mesmo baseando-se na possibilidade de que diferentes metabólitos secundários poderiam ter sido extraídos sob as diferentes condições de obtenção dos extratos hidroalcoólicos originais de cada uma das Fr Aq avaliadas, após a quantificação do marcador químico, o alcaloide warifteína, constatou-se que ambas as Fr Aq, P e M, apresentaram teor semelhante.

Estudos sugerem que a warifteína (50 µ g/animal) é responsável pela ação anti-alérgica da espécie (BEZERRA-SANTOS et al., 2006) por inibir o acúmulo de eosinófilos e a produção de leucotrienos, assim como seu extrato de origem (4; 40 e 400 mg/kg, via oral), além de diminuir a degranulação de mastócitos e diminuir as reações alérgicas dependentes de IgE (COSTA et al., 2008). Tanto AFL quanto a warifteína foram capazes de atenuar os efeitos da reação alérgica inflamatória através da diminuição da produção de muco, da deposição de colágeno e da migração de eosinófilos (BEZERRA-SANTOS et al., 2012), sendo a warifteína apontada como principal componente ativo de Cissampelos sympodialis (BEZERRA- SANTOS et al., 2012).

No entanto, um estudo em modelo de alergia respiratória sugeriu que AFL, mas não a warifteína isolada, promoveu aumento significativo de IL-10, o que pode ser explicado através da ocorrência de algum efeito aditivo ou sinérgico de diferentes compostos do extrato (CERQUEIRA-LIMA et al., 2010).

Apesar dessa discordância, a warifteína se mostra como importante fator na atividade imunológica da AFL, visto que sua concentração semelhante nas Fr Aq P e M refletiu atividade anti-inflamatória semelhante frente à diminuição de TNF-α e NO.

Ainda devido às diferentes condições de obtenção do extrato hidroalcoólico original, pode ainda ser possível que a composição total de cada uma das Fr Aq avaliadas não seja equivalente, mas o mesmo não foi encontrado em relação ao teor de warifteína. Certamente ocorreu perda de warifteína na etapa de partição do extrato hidroalcoólico em água, devido à solubilidade dessa molécula e da diferença de concentração da mesma no extrato hidroalcoólico, o que pode ser objeto de otimização de modo a recuperar maior quantidade do marcador na partição em água, mas por outro lado, tal partição foi efetuada segundo os estudos farmacológicos já realizados, reproduzindo a obtenção de AFL, o que mantem a constância do objeto de avaliação nesse contexto biológico.

Por fim, o planejamento experimental foi útil na definição de parâmetros de extração para obtenção do extrato hidroalcoólico e, mesmo havendo equivalência entre o teor de warifteína nas Fr Aq P e M, o processo de obtenção do extrato hidroalcoólico e sua fração

aquosa a partir das condições otimizadas de extração é muito mais viável devido ao manuseio do material vegetal e sua interação com o sistema de solvente, já que quando utilizado um sistema de solvente mais aquoso, como na obtenção do extrato hidroalcoólico sob as piores condições de extração, há falta de molhabilidade do material vegetal, havendo também dificuldade nas etapas seguintes de filtração e secagem em rotaevaporador.

5.12. Obtenção do insumo farmacêutico na forma de pó seco por spray dryer a base da fração aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis

Após a obtenção do extrato hidroalcoólico e subsequente fração aquosa a partir das folhas de Cissampelos sympodialis, segundo os parâmetros otimizados anteriormente (item 4.9), foi realizado o ensaio de resíduo seco (BRASIL, 2010a) para conhecimento do teor de sólidos (13,23 mg/mL) e cálculo posterior dos excipientes de secagem utilizados e avaliação do rendimento em massa dos pós secos obtidos.

O spray dry é uma técnica de transformação de sistemas líquidos em pó seco numa única etapa e pode ser aplicada a uma grande variedade de materiais (BILLON et al., 2000). A alta estabilidade térmica dos alcaloides bisbenzilisoquinolínicos presentes na milona (estáveis em temperaturas superiores a 200 °C) permite a utilização de processos de secagens que utilizam calor, especialmente spray-dryer, sem alterar significativamente a qualidade do extrato seco (ARAGÃO et al., 2001; ARAGÃO et al., 2002).

O processo de secagem da fração aquosa ocorreu a partir de 50 mL da fração aquosa e, inicialmente, seguindo alguns parâmetros sugeridos por Aragão (ARAGÃO, 2002), na secagem de extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis: temperatura de entrada 140 °C, fluxo de alimentação 3 mL e sem adição de excipientes de secagem. Como não foi visualizado nenhum pó seco no frasco coletor, a temperatura foi alterada a cada 10°C até o máximo de 180°C, havendo ainda variação na temperatura de saída e no fluxo de alimentação, a partir das condições iniciais (Ensaio A - Tabela 19). Vale salientar que as alterações no decorrer do processo de secagem foram feitas variando-se um parâmetro de cada vez após a ausência de pó no frasco coletor, de modo a buscar níveis dessas variáveis que fornecessem condições de secagem ao sistema.

Não foi obtido pó seco sem a adição de excipientes de secagem ao sistema, então demos sequência a testes com diversos excipientes (dióxido de silício coloidal, maltodextrina, celulose microcristalina e lactose anidra) e algumas combinações binárias (Tabela 19).

Quando houve pó seco no frasco coletor, foi calculado o rendimento em peso do mesmo e realizado o ensaio de umidade (BRASIL, 2010a).

A concentração inicial de 30% foi baseada em dados da literatura, pois é comumente utilizada nesse processo de secagem, para diversos excipientes (OLIVEIRA e PETROVICK, 2010), mas não foi obtido pó seco com a adição de 30% de dióxido de silício coloidal (Ensaio B - Tabela 19), nem de 30% de maltodextrina (Ensaio C - Tabela 19), então se tentou um teste com a adição de uma parte de etanol (Ensaio D - Tabela 19), de modo a diminuir a viscosidade do sistema e talvez conseguir-se êxito, mas isso não foi suficiente. A aderência de pó nas paredes da câmara de secagem e do ciclone são problemas bem frequentes, que podem ser contornados com alterações nos parâmetros de secagem ou adição de outros excipientes de secagem (GALLO et al., 2011).

No próximo teste foi adicionada a mistura binária de dióxido de silício coloidal : maltodextrina (1 : 1 p/p) numa concentração de 30% (Ensaio E - Tabela 19), mas mesmo havendo alterações como a diminuição de fluxo de alimentação, não conseguiu-se pó seco.

Pensando na possibilidade de aumentar a concentração de maltodextrina, visto que, a mesma pode ser utilizada em até 80% nos processos de secagem por spray dryer (ROWE e OWEN, 2006), foram realizados ensaios com concentrações de 40 (Ensaio F - Tabela 19); 50 (Ensaio G - Tabela 19); 70 (Ensaio H - Tabela 19); 75 (Ensaio I - Tabela 19) e 80% (Ensaio J - Tabela 19), dentre os quais apenas a partir de 70% desse excipiente foi obtido pó seco. Assim, foi calculado o rendimento em peso e a umidade desses pós, e verificou-se que quanto maior o teor de maltodextrina, maior o rendimento e menor a umidade dos pós (Tabela 19), condições promissora para a continuidade do estudo e utilização do pó como excipiente. O alto percentual de maltodextrina já foi utilizado na secagem de polpa de tomate, que avaliou as percentagens de 25;50 e 75% (GOULA e ADAMOPOULOS, 2008) e 40 e 50% (CANDELAS-CADILLO et al., 2005) e ainda na secagem de ácido ascórbico, na percentagem de 40 a 90% (FINOTELLI e ROCHA-LEITÃO, 2005).

Ainda foram testadas a celulose microcristalina (Ensaio K - Tabela 19) e a lactose anidra (Ensaio L - Tabela 19) como excipientes isolados (30%) e celulose:aerosil, em combinação binária 2:1 p/p (50%) (Ensaio M -Tabela 19), mas não foi obtido pó seco.

Também foi obtido pó seco na tentativa de diminuição da temperatura de secagem com 80% de maltodextrina (Ensaio N - Tabela 19), já que a alta temperatura de 180°C foi utilizada na fase de testes de secagem com alteração dos níveis das variáveis durante o processo, buscando obtenção de pó seco. Essa diminuição não foi buscada com a preocupação de que os marcadores químicos seria degradado, pois, além de sua estabilidade térmica até 200 °C,

como dito anteriormente, a técnica de spray dryer possibilita um curto período de contato entre o líquido disperso e a fonte de calor, podendo inclusive ser aplicada à secagem de sistemas que contenham substâncias termolábeis (CORDEIRO e OLIVEIRA, 2005; PÉREZ- SERRADILLA e CASTRO, 2011; ARARUNA et al., 2013).

Como só conseguiu-se concluir o processo de secagem com uma alta concentração de maltodextrina, ainda foi realizado um teste com mistura binária da mesma com aerosil 65:15 p/p (80%) (Ensaio O - Tabela 19), através da qual também foi obtido pó seco, mas com rendimento um pouco menor e umidade um pouco maior daqueles obtidos com 80% de maltodextrina.

Após a eleição de duas condições de secagem (Ensaios N e O - Tabela 19), foi obtida nova fração aquosa (20,00 mg/mL de teor de sólidos) realizando o aumento de escala do processo de secagem por spray dryer para obtenção de pó seco a partir de maior volume da mesma (500 mL) (Figura 33).

Figura 33 - Fração aquosa, Pó “P” e pó “Q”, respectivamente, envolvidos no processo de secagem da fração aquosa do extrato hidroalcoólico das folhas de Cissampelos sympodialis

Os pós foram caracterizados através de rendimento do pó seco em massa, umidade, velocidade de escoamento, ângulo de repouso, densidade (aparente e compactada) e teor de warifteína. Os pós obtidos a partir desse aumento de escala do processo de secagem foram codificados como “P” (80% de maltodestrina) e “Q” (65% maltodextrina + 15% aerosil).

Ensaio T entrada (°C) T saída (°C) Alimentação (mL/min) Adjuvante Observações Rendimento (%) Umidade

A 160 - 180 75 - 95 4 – 2 Ausente Pó retido no ciclone - -

B 160 - 170 75 - 117 6 – 3 30% aerosil Pó no ciclone e na câmara de

secagem

- -

C 150 - 160 75 - 95 6 – 4 30% maltodextrina Pó retido no ciclone - -

D 180°C 95 3 – 1 30% maltodextrina +

10 mL de etanol

Pó no ciclone, com aspecto úmido - -

E 180 95 6 – 2 15% aerosil +

15% maltodextrina

Pó no ciclone, mesmo diminuindo o fluxo

- -

F 180 95 4 40% maltodextrina Pó retido no ciclone - -

G 180 - 160 75 - 95 6 – 4 50% maltodextrina Pó retido no ciclone - -

H 180 95 4 70% maltodextrina Pó seco 400 mg (19%) 18,03%

I 180 95 4 75% maltodextrina Pó seco 870 mg (34,8%) 12,20%

J 180 95 4 80% malto Pó seco 1,34 g (40,52%) 7,98%

K 120 - 180 70 -120 4 – 2 30% de celulose

microcristalina

Pó úmido na câmara de secagem e pó retido no ciclone

- -

L 120 80 4 30% lactose anidra Pó aderido ao ciclone - -

M 120 - 180 70 - 120 3 – 2 30% celulose + 20% aerosil Pó aderido ao ciclone - - N 120 80 4 80% de matodextrina Pó seco 1,23 g (37,19%) 8,84% O 120 80 4 65% de maltodextrina + 15 % de aerosil Pó seco 0,85 g (25,71%) 17,5%

O aumento de escala da ordem de 10 vezes, em termos de volume seco a cada ensaio, possibilitou uma visualização de maior quantidade de pó úmido nas paredes das câmaras de secagem e passagem, e do ciclone (Figura 34), pois na menor escala havia menor visualização da perda de material na forma úmida, o que não significava sua inexistência, visto que o rendimento do processo passou de 37,19% para 32,68% na secagem apenas com maltodextrina e de 25,71% para 38% na secagem com a mistura binária de maltodextrina 65% + dióxido de silício coloidal 15%. A grandeza do rendimento do ensaio “P” foi quase a mesma, mas a do ensaio “Q” sofreu aumento considerável, cuja significância não pôde ser calculada porque o processo foi realizado apenas uma vez, em cada condição de secagem. O ajuste do processo a uma maior escala geralmente ocasiona perdas maiores, então talvez tenha havido alguma perda maior não visualizada na menor escala, já que um maior rendimento é esperado com o uso de dióxido de silício coloidal, mesmo em misturas binárias, já que consiste em excipiente que retém umidade e facilita a secagem (ROWE e OWEN, 2006).

Na análise macroscópica foi possível observar que o pó seco obtido no ensaio “P” apresenta-se como pó fino, mas um pouco granuloso, amarelo claro e com odor característico da espécie vegetal. Já o pó obtido no ensaio “Q” mostrou-se mais fino, com menos aglomerados, e de coloração amarela um pouco mais clara, com odor característico da espécie